拱健婷，關(guān)佳莉，李 莉*，梁 如，于淑琳，叢 悅，趙藝萌，徐媛媛，鄒慧琴*

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 北京市中醫(yī)藥研究所，北京 100010；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京102488）

黃精為百合科植物滇黃精Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.、黃精Polygonatum sibiricumRed.或多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua.的干燥根莖[1]，作為傳統(tǒng)中藥在我國沿用已久。2002 年黃精被列入《既是食品又是藥品的物品名單》，至今也是國家衛(wèi)生健康委員會(huì)公布的藥食同源品種[2-3]。因其具有藥食同源的特性，黃精具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，以黃精為原料研發(fā)出的中成藥或湯藥、保健品、食品、化妝品等市場需求量逐步增長。截至2019 年，我國注冊黃精保健食品達(dá)351 種[4]，黃精的年需求量為3 500 ～ 4 000 t[5]。但是由于黃精富含多糖，因此黃精貯藏過程中極易產(chǎn)生霉變變質(zhì)現(xiàn)象。黃精每年因霉變造成較大的損失，霉變黃精早期的檢測與診斷對保證其質(zhì)量具有重要的作用。此外，霉變會(huì)導(dǎo)致中藥有效成分大量流失，影響臨床療效；霉變中藥真菌產(chǎn)生的多種真菌毒素會(huì)對患者的肝臟、腎臟、神經(jīng)和造血系統(tǒng)等造成嚴(yán)重?fù)p害，甚至可能誘發(fā)癌癥，威脅健康，故有“霉藥不治病，甚至害人命”的說法[6-7]。因此，對黃精霉變進(jìn)行檢測與診斷對于減少黃精經(jīng)濟(jì)損失和臨床用藥安全也具有重要意義。

目前評價(jià)中藥霉變的主要方法為性狀鑒定法和理化測定法，性狀鑒別存在主觀性、經(jīng)驗(yàn)性，常規(guī)的真菌鑒定方法耗時(shí)費(fèi)力且昂貴，無法滿足自動(dòng)化、現(xiàn)場快速的檢測需求[8]。在中藥霉變過程中會(huì)有霉味、腐臭味、酸味或甜味等，這些氣味的主要成分是微生物產(chǎn)生的羥、醛、硫化物等，可以通過氣味變化了解中藥霉變情況。電子鼻是模擬人類嗅覺的智能感官儀器，其靈敏度很高，氣味的檢測限可達(dá)ppb 級甚至ppt級水平。關(guān)于電子鼻技術(shù)在霉變檢測中的應(yīng)用和研究主要集中于谷物大米[9]、玉米[10]、小麥[11]、燕麥[12]等，近年來電子鼻在草莓[13]、蘋果[14]和家電“霉味”[15]的檢測，及中藥肉豆蔻[16]、川芎[17]的霉變預(yù)警上的探索應(yīng)用也有報(bào)道，可見電子鼻在霉變檢測方面具有巨大潛力。為此，本研究采用電子鼻技術(shù)對黃精氣味信息進(jìn)行檢測，獲取樣品的氣味指紋圖譜，再聯(lián)合模式識(shí)別算法分析，從而實(shí)現(xiàn)快速識(shí)別黃精是否發(fā)霉。

1 材料與方法

1.1 藥材

6 批黃精樣品均于2019 年7 月采集于遼寧省瓦房店市，經(jīng)北京市中醫(yī)藥研究所李莉研究員鑒定為百合科植物黃精Polygonatum sibiricumRed.的干燥根莖。3 批未霉變黃精（HJ5、HJ6、HJ7）；3 批霉變黃精樣品為2019 年7 月至2021 年7 月儲(chǔ)藏過程中霉變所取樣品（MHJ5、MHJ6、MHJ7），霉變黃精藥材表觀顏色加深，可聞到異味，明顯觀測到生長的菌絲體。樣品儲(chǔ)存于北京市中醫(yī)藥研究所。

1.2 儀器

α-FOX3000 型電子鼻（法國Alpha M.O.S.公司），包括HS-100 型自動(dòng)頂空取樣器、空氣發(fā)生器和12 根金屬氧化物傳感陣列（LY 型傳感器LY2 /LG、LY2 /G、LY2 /AA、LY2 /GH、LY2 /gCTL、LY2 /gCT 構(gòu)成Sensorchamber1，TP 型傳感器T30 /1、P10 /1、P10 /2、P40 /1、T70 /2、PA/2 構(gòu)成Sensorchamber 2），每根傳感器對揮發(fā)性成分的響應(yīng)性能不同，見表1[18]；FW-135 型中草藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；BS-124S 型電子分析天平（德國賽多利斯公司）。

表1 α-FOX3000 型電子鼻傳感器及其檢測范圍Tab.1 α-FOX3000 electronic nose sensors and its detection range

1.3 黃精氣味檢測方法

1.3.1 檢測參數(shù) 參照于淑琳[19]方法進(jìn)行黃精氣味檢測，檢測參數(shù)如下：載氣流速為150 mL/min；攪動(dòng)速度為250 r/min；進(jìn)樣體積為2 500 μL；注射速度為2 500μL/s；注射針溫度為60℃；數(shù)據(jù)采集時(shí)間為120 s；采集周期為1 s；延遲時(shí)間為600 s。

1.3.2 樣品制備 分別精密稱取0.3 g 黃精/霉變黃精樣品粉末（65 目標(biāo)準(zhǔn)篩），裝入10 mL 頂空進(jìn)樣瓶，加蓋密封，放入電子鼻自動(dòng)進(jìn)樣器樣品盤中進(jìn)行檢測，獲取氣味指紋圖譜見圖1。每份樣品平行檢測6次。

圖1 樣品的氣味指紋圖譜Fig.1 Odor fingerprint of sample

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

黃精的氣指紋圖譜由12 根傳感器的120 s 數(shù)據(jù)組成，通常選取峰值或波谷作為特征點(diǎn)，通常同一樣品此處的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較低，不同樣品之間的差異通常最大[20]，因此，在數(shù)據(jù)分析中，選擇12 根傳感器響應(yīng)絕對值的最大點(diǎn)響應(yīng)值為分析指標(biāo)。利用SPSS 19.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)、主成分分析、聚類分析、逐步判別分析，simca-p 13.0 進(jìn)行偏最小二乘判別和VIP 分析，Origin7.5 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃精與霉變黃精電子鼻響應(yīng)值分析

黃精與霉變黃精在電子鼻12 根傳感器上的響應(yīng)值見圖2，可以看出霉變黃精在12 根傳感器上的響應(yīng)絕對值均高于黃精。對所采集的樣品響應(yīng)值進(jìn)行分析，通過四分位距法剔除異常數(shù)據(jù)（HJ7-1）后進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示黃精與霉變黃精在電子鼻12 根傳感器上的響應(yīng)值均存在極顯著差異（P＜0.001），見表2，黃精與霉變黃精氣味差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以黃精響應(yīng)值為參照，計(jì)算二者的差異率，結(jié)果顯示黃精與霉變黃精的氣味在傳感器差異率在6.839 5% ～122.873 9%，在傳感器S1 上差異率最小，在傳感器S2 上差異率最大，且在S2、S3、S6、S11 的響應(yīng)值差異率均超過 80% ，是黃精霉變氣味特征的重要區(qū)別點(diǎn)，其中，S6 響應(yīng)值差異率較大（110.751 3%）也與電子鼻傳感器 S6 對黃精及霉變黃精響應(yīng)值較低存在一定的關(guān)系。說明揮發(fā)性氣味特征差異為電子鼻的分析檢測提供了可能，基于氣味進(jìn)行黃精霉變與否的鑒別是可行的。

圖2 黃精與霉變黃精電子鼻響應(yīng)值散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter Chart of Rhizoma Polygonatum and moldy Rhizoma Polygonatum

表2 黃精及霉變黃精的電子鼻傳感器響應(yīng)值Tab.2 Response value of Rhizoma Polygonatum and moldy Rhizoma Polygonatum

2.2 黃精與霉變黃精判別模型的建立

2.2.1 主成分分析 主成分分析（PCA）是電子鼻構(gòu)建判別模型時(shí)常用的統(tǒng)計(jì)方法，其可以消除數(shù)據(jù)中相互重疊的信息，將電子鼻12 根傳感器的特征降維，實(shí)現(xiàn)用少數(shù)原始變量線性組合的關(guān)鍵變量表征原變量的數(shù)據(jù)特征[21-23]。對黃精與霉變黃精樣品電子鼻檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA 分析，結(jié)果見圖3，第一主成分方差貢獻(xiàn)率為99.03%，第二主成分方差貢獻(xiàn)率為0.78%，二者累積方差貢獻(xiàn)率為99.81%，說明保留的兩個(gè)主成分包含了樣品原始特征中的大部分特征信息。

圖3 黃精與霉變黃精主成分分析得分圖Fig.3 Scatter chart of principal component analysis

黃精與霉變黃精在PCA 散點(diǎn)圖上明顯分為 2 個(gè)區(qū)域，PCA 分析能夠?qū)崿F(xiàn)黃精霉變與否的正確判別。黃精樣本主要分布在第二、三象限，除MJH5-5 外，霉變黃精樣品均分布在第一、四象限，兩類樣品間的差異明顯，且差別主要體現(xiàn)在信息權(quán)重較大的第一主成分上。進(jìn)一步對12 根傳感器進(jìn)行Loadings 分析，發(fā)現(xiàn)傳感器S7、S8、S11、S12 對第一主成分的貢獻(xiàn)度最大。此外，黃精樣品電子鼻數(shù)據(jù)在主成分分析圖上相對集中，霉變黃精電子鼻數(shù)據(jù)在主成分分析圖上較為分散，可能與霉變黃精樣品霉變的程度存在一定的關(guān)系。

2.2.2 聚類分析 聚類分析是電子鼻數(shù)據(jù)處理中常用的模式識(shí)別算法之一。分層聚類分析是應(yīng)用最廣的聚類分析方法，是一種將研究對象分為相對同質(zhì)的群組的統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)，分層聚類分析是依據(jù)個(gè)體或變量的數(shù)量關(guān)系來分類，客觀性較強(qiáng)[24]。將黃精與霉變黃精樣品電子鼻檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，根據(jù)歐式距離進(jìn)行樣本的聚類，最終樣本聚為兩大類，黃精及霉變黃精樣品的分層聚類分析圖，見圖4，正判率為97.14%，其中僅一份霉變黃精樣本（MHJ5-5）被聚類到黃精樣品中，與主成分分析結(jié)果一致，其余聚類全部正確。在霉變黃精樣品中，MHJ5 樣本整體的電子鼻響應(yīng)值較MHJ6、MHJ7 樣本低，MHJ5-5 電子鼻響應(yīng)值較低，故錯(cuò)判為未霉變黃精。

圖4 聚類分析結(jié)果Fig.4 Cluster analysis results

2.2.3 逐步判別分析 具有篩選能力的判別分析法統(tǒng)稱為逐步判別分析。在判別分析的過程中，往往有很多變量對判別結(jié)果有影響，但影響大小不一。當(dāng)判別變量較多時(shí)，適當(dāng)?shù)淖兞亢Y選有利于建立的判別函數(shù)的穩(wěn)定性。逐步判別分析的基本思想是采用“有進(jìn)有出”的算法，即根據(jù)變量的重要性逐步引入變量，而最初引入的變量也可能因?yàn)楹笠氲男伦兞慷テ渲匾员粍h除。引入或刪除變量的每個(gè)步驟都需要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，確保最終的判別函數(shù)只保留重要變量[25-26]。

71.43%的樣本（霉變黃精13 份，黃精12 份）被隨機(jī)抽取以形成訓(xùn)練集，剩余28.57%的樣本（霉變黃精、黃精各5 份）構(gòu)成測試集以評估所建逐步判別模型的性能。模型的F臨界值為2.09，兩類樣本間馬氏距離200.53。通過逐步判別分析，依次選入5 個(gè)變量S12、S1、S2、S5 和S4 作為判別分析的指標(biāo)。根據(jù)逐步判別函數(shù)系數(shù)，霉變黃精的判別函數(shù)為YMHJ= -1 837.41 + 28 310.58S1+ 7 047.37S2+ 6 737.68S4-13 593.4S5+ 106.96S12，黃精的判別函數(shù)為YHJ=-2 276.54 + 34 299.97S1+ 10 155.68S2+ 15 703.75S4-28 543.5S5- 368.39S12，基于上述函數(shù)訓(xùn)練集結(jié)果顯示兩類樣本的正判率均為100%，說明判別模型識(shí)別能力強(qiáng)。使用獲得的判別函數(shù)去判別測試集樣本，均判別正確，正判率為100%，見表3。通過判別分析，電子鼻可以區(qū)分黃精和霉變黃精，效果理想。

表3 黃精樣品逐步判別模型的建立與驗(yàn)證結(jié)果Tab.3 Multivariate stepwise analysis model

2.2.4 偏最小二乘判別分析 PLS-DA 是一種集主成分分析、典型相關(guān)分析、多元線性回歸分析于一體的常用多變量分析方法。它具有清晰直觀的分析結(jié)果、較高的預(yù)測精度和廣泛的實(shí)用性，在中藥質(zhì)量評價(jià)和控制的過程中具有廣泛的應(yīng)用[27]。采用SIMCA-P13.0 軟件對黃精與霉變黃精樣品進(jìn)行PLSDA 分析，表示模型擬合程度參數(shù)R2Y值為0.973，表示該模型預(yù)測能力參數(shù)Q2值為0.952，表明該模型具有良好的擬合度、較高的穩(wěn)定性和預(yù)測率。PLSDA 分析結(jié)果見圖5，兩種類型的樣品集中在兩個(gè)不同的區(qū)域，這表明黃精在霉變后氣味信息發(fā)生了顯著變化，PLS-DA可以實(shí)現(xiàn)黃精霉菌的快速準(zhǔn)確識(shí)別。

圖5 黃精與霉變黃精PLS-DA 分析（A）及VIP 分析(B)Fig.5 Score scatter plot of by PLS-DA（A）and VIP analysis（B）

變量重要性分析值（Variable Importance for the Projection，VIP）可以量化每個(gè)變量對分類模型的貢獻(xiàn)，便于篩選重要的分類變量。VIP 值越大，該變量在兩種樣本之間的差異就越顯著。對12 根傳感器的VIP 值進(jìn)行排序，S7 ～ S12 VIP 值大于1，這表明以上指標(biāo)是判別模型中體現(xiàn)黃精與霉變黃精差異性的主要變量，對黃精霉變的分類鑒別具有顯著影響，而其余6 根傳感器的影響較小。此外，S7 ～ S12 為TP型傳感器，根據(jù)傳感器的性能，可能是黃精霉變后芳香族化合物、氨氣、胺類、甲烷、烷烴類成分種類及含量發(fā)生了顯著變化。

3 討論

霉變是常見中藥變質(zhì)現(xiàn)象之一，直接影響中藥的質(zhì)量與安全。準(zhǔn)確評價(jià)中藥霉變與否是藥品安全生產(chǎn)和使用的重要保障。目前，評價(jià)中藥霉變的主要方法是性狀鑒定法和理化測定法，前者最為常用。文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)存在霉變的中藥通過撞刷、搶水洗、沸水噴淋、酒洗、醋洗、油擦、熱炒、熱蒸等方法除去表面霉菌后干燥重新流入市場的現(xiàn)象，并且刷去霉菌的藥材和正常中藥很難區(qū)分，對鑒別者的經(jīng)驗(yàn)要求很高，且某些藥物還存在假性霉變現(xiàn)象的干擾。隨著技術(shù)的發(fā)展，中藥微性狀鑒定法應(yīng)用到中藥霉變鑒別中，通過觀察藥材組織及表面的菌絲體和芽孢能鑒別出“水洗貨”霉變木瓜、霉變辛夷[28]；劉吉爽等[29]采用柱色譜、薄層色譜等技術(shù)分離制備了葵花盤霉變標(biāo)志物，對多糖、皂苷及蛋白質(zhì)含量較高的植物藥材的霉變評價(jià)具有一定的適用性；另外，酶聯(lián)免疫測定法[30]、膠體金免疫層析法[31]、高效液相色譜法[32]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9]等應(yīng)用于霉變中藥多種真菌毒素的檢測。相較于依賴鑒別經(jīng)驗(yàn)的傳統(tǒng)性狀鑒定法和復(fù)雜的常規(guī)真菌鑒定方法，電子鼻技術(shù)更為客觀便捷。電子鼻可以將傳統(tǒng)鑒定經(jīng)驗(yàn)轉(zhuǎn)化為客觀數(shù)據(jù)，量化不同樣品之間的氣味差異，樣品預(yù)處理過程相對簡單，數(shù)據(jù)分析速度快。

本研究以黃精為研究載體，采用電子鼻技術(shù)提取黃精和霉變黃精氣味特征指紋，聯(lián)合無監(jiān)督的主成分分析、聚類分析及有監(jiān)督的逐步判別判別分析、偏最小二乘判別分析建立了黃精霉變與否定性鑒別模型。對比不同的判別模型結(jié)果，主成分分析中S7、S8、S11、S12 對第一主成分的貢獻(xiàn)度最大，逐步判別分析依次選入S12、S1、S2、S5、S4 共計(jì)5 個(gè)變量作為判別分析的指標(biāo)，偏最小二乘判別分析中貢獻(xiàn)度較大的傳感器為S7 ～ S12，不同判別模性中傳感器S12 對判別結(jié)果均有較大貢獻(xiàn)，另外主成分分析、偏最小二乘判別分析結(jié)果較為一致，TP 型傳感器對黃精霉變與否的氣味影響更為顯著。綜合來看，LY 型傳感器S1、S2、S4、S5 和TP 型傳感器S7 ～ S12 對黃精霉變判別模型貢獻(xiàn)較大，提示黃精霉變后氧化氣體、有機(jī)胺類、硫化物、短鏈烷烴、芳香族化合物等成分發(fā)生了變化?？梢噪娮颖欠治鼋Y(jié)果作為一個(gè)方向性的指導(dǎo)，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜離子遷移譜等手段針對以上成分進(jìn)行分析，進(jìn)一步研究黃精霉變前后揮發(fā)性成分的構(gòu)成差異，為黃精霉變的有效鑒別提供科學(xué)的參考依據(jù)。研究結(jié)果表明，電子鼻技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)能有效地檢測到黃精與霉變黃精的氣味差異，無監(jiān)督和有監(jiān)督判別模型均可以準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)黃精霉變與否的定性鑒別，為黃精霉變評價(jià)提供了一種快速而有效的方法，在中藥霉變鑒別上有較好的應(yīng)用前景和推廣價(jià)值。

本研究依托黃精儲(chǔ)藏過程中自然霉變以獲取霉變樣品，故而收集到的樣品量少，導(dǎo)致樣品的代表性存在一定的局限性?；诖?，在今后的研究中應(yīng)收集更多、更具代表性的樣品，一方面進(jìn)行模型驗(yàn)證；另一方面，在本實(shí)驗(yàn)判別模型的基礎(chǔ)上，可利用判別應(yīng)用中不斷累積的新資料進(jìn)行完善，增加其可靠性，建立更完善的判別模型。此外，本研究只是對黃精霉變的初步探索，還有許多問題值得進(jìn)一步研究，例如黃精與霉變黃精具體有哪些氣味成分的區(qū)別，它們是否與藥效成分有關(guān)，如何跟蹤黃精霉變過程中的氣味變化，找到即將發(fā)生霉變的最佳處理時(shí)刻來控制貯藏條件，從而減少黃精霉變的發(fā)生，課題組將繼續(xù)對黃精霉變氣味的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行進(jìn)一步的探索。

4 結(jié)論

電子鼻技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)黃精及霉變黃精氣味信息客觀化，霉變黃精電子鼻響應(yīng)絕對值顯著高于黃精。電子鼻結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立了黃精霉變與否的主成分、聚類、逐步判別、偏最小二乘判別模型，可以從整體氣味的角度實(shí)現(xiàn)對黃精霉變與否的快速無損鑒定，為黃精霉變快速檢測提供了方法參考，保障臨床用藥安全。