周洪亮，高紫薇，田明鑫，周曉雯*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210046）

丹皮酚是一種天然的酚類化合物，又稱芍藥醇、牡丹酚，易溶于甲醇或乙醇，溶于熱水，不溶于冷水[1]。主要來源于毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosaAndr.、蘿摩科植物徐長(zhǎng)卿Cynanchum paniculatum(Bge.) Kitag.，具有確切的鎮(zhèn)痛[2-3]、抗炎[4]、神經(jīng)保護(hù)[5]等作用。目前已有丹皮酚軟膏、丹皮酚片、丹皮酚注射液等劑型上市，主要用于濕疹、皮炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥的治療。

雖然丹皮酚具有廣泛的藥理作用，但因其水溶性差、代謝快、易揮發(fā)等特點(diǎn)制約了其臨床應(yīng)用。目前針對(duì)上述問題的研究多以化合物結(jié)構(gòu)修飾[6-7]及劑型優(yōu)化為主，劑型研究中納米制劑、環(huán)糊精包合物、固體分散體、非離子表面活性劑囊泡等均見報(bào)道，而固體分散體的制備研究中，謝慧超等[8-9]制備的固體分散體所用的丹皮酚原料的X 射線衍射結(jié)果存在較大差異，分析丹皮酚可能存在多晶型現(xiàn)象，但查閱文獻(xiàn)未見相關(guān)報(bào)道。

藥物的多晶型是指藥物在不同的結(jié)晶條件下，藥物分子與溶劑分子之間會(huì)形成不同的相互作用和結(jié)合方式，從而導(dǎo)致藥物形成兩種或兩種以上的晶型。多晶型現(xiàn)象會(huì)影響藥物的生物利用度、穩(wěn)定性、溶解度及溶出速率等，晶型研究對(duì)藥物研發(fā)，尤其固體制劑的開發(fā)來說至關(guān)重要。本研究采用單一溶劑重結(jié)晶法制備丹皮酚不同晶型并對(duì)其進(jìn)行表征，通過溶出度試驗(yàn)法比較不同晶型溶出行為差異，為丹皮酚晶型質(zhì)量控制及固體口服制劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 SDT Q600 型同步熱分析儀（美國(guó)TA公司）；JSM-6510 型掃描電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；D8 Adavance 型X 射線粉末衍射儀（德國(guó)布魯克光譜儀器公司）；Bruker IFS-55 型傅里葉變換紅外光譜儀（德國(guó)布魯克光譜儀器公司）；1100 型高效液相色譜儀（G1314A 型紫外檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技公司）；Sartorius BP-211D 型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；ZRS-8G 型智能溶出試驗(yàn)儀（天津天大天發(fā)科技有限公司）。

1.1.2 試藥 丹皮酚（批號(hào)：Le0h0521，純度：99.86%）購于上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司；乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、正己烷為分析純，均購于成都市科隆化學(xué)品有限公司；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 方法

1.2.1 多晶型樣品的制備 晶型I：取丹皮酚5 g，加水混懸后80 ℃加熱至丹皮酚溶解（融化），保持30 min，置冰水混合物（0 ℃）中不停搖晃使其結(jié)晶，抽濾，30 ℃真空干燥；晶型II ～ VI：取丹皮酚各5 g，分別加適量乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、正己烷溶解（必要時(shí)適當(dāng)加熱使溶解）后30 ℃真空干燥。

1.2.2 多晶型表征 采用X-射線粉末衍射分析法（XRPD）、傅里葉紅外光譜法（FT-IR），掃描電鏡法（SEM）及熱分析法（TA）對(duì)制備的6 種晶型樣品進(jìn)行分析表征。

1.2.3 不同晶型丹皮酚在4 種介質(zhì)中的溶出曲線

取相同粒度（過三號(hào)篩）丹皮酚的不同晶型樣品40 mg，精密稱定，置900 mL 溶出介質(zhì)中，采用槳法，在37 ℃，轉(zhuǎn)速75 r/min 條件下，分別于5、10、15、20、30、45、60、90、120 min 取樣5 mL（各時(shí)間點(diǎn)取樣完成后補(bǔ)充等溫介質(zhì)5 mL），0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按2020 年版《中國(guó)藥典》“牡丹皮”項(xiàng)下[10]丹皮酚含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算溶出度，并以累積溶出度為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，分別繪制不同晶型丹皮酚在水、鹽酸溶液（pH = 1.2）、醋酸鹽緩沖液 （pH = 4.5）、磷酸鹽緩沖液（pH = 6.8）中的溶出曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 多晶型表征

2.1.1 X-射線粉末衍射圖譜分析 對(duì)比丹皮酚6種晶型的XRPD 圖譜發(fā)現(xiàn)，丹皮酚各晶型樣品衍射峰主要集中于衍射角（2θ）為10° ～ 30°的區(qū)域范圍內(nèi)且12°、25°左右的衍射峰強(qiáng)度均較高，見圖1。不同晶型樣品的衍射峰位置、數(shù)量、強(qiáng)度之間又存在明顯差異，晶型I、III、VI 衍射峰數(shù)量相對(duì)較多，強(qiáng)度較低，而晶型II、IV、V 數(shù)量相對(duì)較少。各晶型中2θ 為13.8°、26.4 °、12.3°、34.7°、37.2°的衍射峰分別為晶型I、II、IV、V、VI 的特有衍射峰，且強(qiáng)度較高，可作為丹皮酚各晶型區(qū)分的特征峰。

圖1 丹皮酚不同晶型的XRPD 圖譜Fig.1 XRPD spectrograms of different crystal forms of paeonol

2.1.2 熱分析圖譜分析 SDT-Q600 同步熱分析儀具備差示掃描量熱分析（DSC）和熱重分析（TGA）雙重功能。在TGA 曲線中，丹皮酚晶體的失重溫度為100 ～ 200 °C，主要為丹皮酚分子的氣化所致，這也解釋了丹皮酚可以用水蒸氣蒸餾法提取的原因。在DSC 曲線中，50 ℃左右的峰為丹皮酚融化所致吸熱峰，丹皮酚6 種晶型的熔點(diǎn)分別為59.09、50.91、44.67、51.34、51.42、50.80 °C，其中，晶型II、IV、V、VI 熔點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道的49 ～ 51 °C[11-12]吻合，而晶型I 的熔點(diǎn)為59.09 °C，晶型III 熔點(diǎn)為44.67 °C，與文獻(xiàn)報(bào)道熔點(diǎn)溫度[11-12]有一定差距，分析為晶型差異導(dǎo)致。此外，各晶型樣品200 °C 左右還有一個(gè)較大的吸熱峰，該峰與TGA 曲線的失重溫度一致，由丹皮酚在該溫度下氣化吸熱導(dǎo)致。不同晶型丹皮酚樣品的DSC 和TGA 分析曲線見圖2。

圖2 丹皮酚不同晶型的熱分析曲線Fig.2 Curves of thermal analysis of different crystal forms of paeonol

2.1.3 傅里葉紅外光譜分析 傅里葉紅外光譜圖中1 650 ～ 1 450 cm-1區(qū)域出現(xiàn)的芳環(huán)骨架伸縮振動(dòng)以及3 100 ～ 3 000 cm-1的苯環(huán)上C—H 伸縮振動(dòng)可以證明苯環(huán)的存在，3 071 cm-1處出現(xiàn)的寬峰為酚羥基的伸縮振動(dòng)，1 620 cm-1處的吸收峰是芳酮羰基的伸縮振動(dòng)，因苯環(huán)和羰基的共軛作用而出現(xiàn)紅移，1 207 cm-1處的強(qiáng)吸收峰為芳香醚中的C—O 的伸縮振動(dòng)，以上結(jié)果表明分子中含有苯環(huán)、酚羥基、羰基以及芳香醚等特征基團(tuán)，與丹皮酚結(jié)構(gòu)相符。不同晶型丹皮酚樣品的紅外光譜圖中晶型I 3 443 cm-1區(qū)域無吸收峰、1 914 cm-1處吸收峰明顯弱于其它晶型，晶型II、III 1 200 ～ 1 460 cm-1區(qū)域峰強(qiáng)度較弱。晶型IV、V 1 914 cm-1區(qū)域峰強(qiáng)度相對(duì)較弱，晶型VI 3 443 cm-1區(qū)域無吸收峰，其它區(qū)域的峰強(qiáng)度均弱于其它晶型。紅外光譜吸收峰的數(shù)量、強(qiáng)度差異反應(yīng)了不同晶型丹皮酚分子間作用力的差異，這與晶型導(dǎo)致共價(jià)鍵的伸縮振動(dòng)或彎曲有關(guān)，見圖3。

圖3 丹皮酚不同晶型的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectrograms of different crystal forms of paeonol

2.1.4 電鏡掃描圖像分析 不同晶型呈現(xiàn)出了明顯的形態(tài)差異，晶型I 呈不規(guī)則團(tuán)絮狀；晶型II 呈柱狀平行排列的纖維狀集合體；晶型III 呈鱗片狀，晶體薄，表面粗糙；晶型IV、V 較為相似，呈針狀，晶型IV表面光滑，比表面積更大，而晶型V較為粗糙；晶型VI 則為不規(guī)則塊狀，見圖4。

圖4 丹皮酚不同晶型的掃描電鏡圖Fig.4 SEM images of different crystal forms of paeonol

2.2 不同晶型丹皮酚在4 種介質(zhì)中的溶出曲線

丹皮酚各晶型樣品在水、鹽酸溶液（pH = 1.2）、醋酸鹽緩沖液（pH = 4.5）、磷酸鹽緩沖液（pH = 6.8）中的溶出曲線表明，不同晶型之間的溶出行為具有較大差異，見圖5。各晶型中，晶型III 在各介質(zhì)中溶出均較快，晶型II 次之，晶型I 溶出最慢，晶型IV、V、VI 基本一致，無顯著性差異。有研究表明[13]，丹皮酚12 h 平衡溶解度呈pH 依賴性，介質(zhì)pH 值越低溶解度越高，pH = 2.2 條件下的溶解度是pH = 6.8時(shí)溶解度的1.8 倍，而本研究中丹皮酚在4 種介質(zhì)中的溶出趨勢(shì)基本一致，未見明顯的pH 依賴性，與謝慧超等[8]的研究結(jié)果一致。

圖5 丹皮酚不同晶型在4 種介質(zhì)中的溶出曲線（n = 3）Fig.5 Dissolution curves of different crystal forms in 4 dissolution media（n = 3）

3 討論

多晶型現(xiàn)象在自然界中廣泛存在，據(jù)統(tǒng)計(jì)，50%以上固體藥物存在多晶型現(xiàn)象，而臨床使用的藥物70%為固體口服制劑。不同晶型對(duì)藥物的穩(wěn)定性、生物利用度、藥效以及安全性等可能產(chǎn)生較大的影響[14]。丹皮酚相關(guān)制劑雖已上市應(yīng)用，但仍面臨著水溶性差、易揮發(fā)等問題，本研究從晶型研究角度出發(fā)，篩選出了具有較高熔點(diǎn)的晶型I 和較快溶出速度的晶型III，對(duì)于上述問題的解決具有一定的意義。

晶型研究過程中還發(fā)現(xiàn)，丹皮酚常溫狀態(tài)下可呈固、液兩種狀態(tài)。曾嘗試將丹皮酚加熱融化后置常溫條件下進(jìn)行析晶，但未獲成功，液態(tài)丹皮酚在無人為干預(yù)的情況下可存在數(shù)月之久。而丹皮酚熔點(diǎn)為49 ～51 ℃，該狀態(tài)下丹皮酚為過冷液體，屬于不穩(wěn)定狀態(tài)（介穩(wěn)狀態(tài)），在劇烈搖晃或加入晶體種子后則瞬間轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)丹皮酚。丹皮酚晶型制備過程中共嘗試了8 種溶劑，其中，乙酸乙酯、乙腈中獲得的晶型判斷為同一晶型，而甲醇中獲得的晶型與初始晶型一致，最終獲得了6 種晶型丹皮酚固體。

多晶型藥物主要通過溶出速率、吉布斯自由能等影響生物利用度，尤其是藥物自身的溶出速率是影響其吸收、分布的關(guān)鍵因素，體外溶出曲線的研究對(duì)晶型研究具有重要意義。由于制劑過程中的壓力、溶劑、干燥溫度等因素可能對(duì)晶型有較大影響，因此在溶出曲線測(cè)定過程中采用同一粒徑的原料進(jìn)行測(cè)定，這樣的比較更簡(jiǎn)單明了，排除了制劑過程中可能存在的晶型轉(zhuǎn)變對(duì)溶出曲線的影響。

4 結(jié)論

通過對(duì)丹皮酚多晶型的研究，闡明了不同晶型丹皮酚在光譜、形態(tài)、體外溶出行為等方面的差異，尤其不同晶型樣品的體外溶出行為上的差異，可為解決丹皮酚水溶性差等問題提供新思路，固體制劑開發(fā)過程中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。