馬敬環(huán)，王步月，劉 瑩，高 然

（1.天津工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300387；2.天津海源匯科技有限公司，天津 300359）

海水作為生命的起源，富含90 多種無(wú)機(jī)鹽、礦物質(zhì)及微量元素[1]。合理開發(fā)和利用海水資源是實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的重要措施。隨著合理開發(fā)海水資源的深入，海水淡化不僅可解決全球水資源緊缺的問(wèn)題，也可作為天然的“元素補(bǔ)充劑”，海水中的礦物質(zhì)元素可調(diào)節(jié)人體內(nèi)環(huán)境的元素平衡、調(diào)整電解質(zhì)平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[2]，從而可有效預(yù)防慢性亞健康疾病的產(chǎn)生。因此，海水資源化成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

Nakagaw 等[3]證明海水做成礦物質(zhì)元素飲品是安全的，可以作為優(yōu)質(zhì)的元素補(bǔ)給源，且由于其特性與生物活性（容易吸收、天然無(wú)污染）在多方面對(duì)人體有益，故海水可以加工成為功能性飲品。目前已有研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從醫(yī)學(xué)角度證明：海水有助于預(yù)防高膽固醇血癥、動(dòng)脈粥樣硬化[4]和輕度高血壓[5]，且在改善皮炎癥狀[6]、降低總甘油三酯、提高高密度膽固醇脂蛋白和調(diào)節(jié)肝脂代謝功能[7]等方面有較好效果。從生物化學(xué)角度來(lái)講，礦物質(zhì)元素作為生命體所必需7 大營(yíng)養(yǎng)素之一，參與了多種蛋白質(zhì)的合成、分泌，甚至影響酶活性及機(jī)體代謝。海水中所含的離子可影響酶分子的構(gòu)象[8]，從而影響其功能與活力；離子在酶促反應(yīng)中常作為輔助因子參與反應(yīng)，不同離子以不同方式與酶分子結(jié)合參與后續(xù)催化反應(yīng)[9]。Lu 等[10]研究證明金屬離子可以提高脂肪酶的穩(wěn)定性和水解活性。更有研究[11]證實(shí)，在Mg2+離子、Na+離子等存在下脂肪酶的酶活力及穩(wěn)定性均有所提升。

天津某公司以海水為原料生產(chǎn)的飲品，在推廣應(yīng)用過(guò)程中表現(xiàn)出具有一定的降脂功能。該飲品中含有23 種元素，本文針對(duì)該飲品所含常量離子（Mg2+、Ca2+、Na+、K+和B3+）進(jìn)行研究，通過(guò)考察這5 種離子對(duì)脂肪酶活力、Zeta 電位、紫外和熒光特性的影響，探討該飲品及其所含5 種離子對(duì)脂肪酶的作用機(jī)理，以期為該海水功能飲品的功能強(qiáng)化改進(jìn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

材料：海水功能飲品，天津海源匯科技有限公司產(chǎn)品，其元素組成如表1 所示；豬胰脂肪酶，南京獨(dú)萊生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；橄欖油、磷酸鹽緩沖液、聚乙烯醇，均為上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品；NaOH，分析純，阿拉丁試劑公司上海分公司產(chǎn)品；無(wú)水乙醇、NaCl、MgCl2、CaCl2、KCl、H3BO3，均為分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司產(chǎn)品。

表1 海水功能飲品元素組成Tab.1 Elements of marine functional drinks

儀器：SB-5200-DTDN 型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司產(chǎn)品；SHZ-D 型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州博科儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；HJ-6C 型恒溫磁力攪拌水浴鍋，金壇市科普實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品；FSH-2A 型可調(diào)高速勻漿機(jī)，常州市白塔安瑞實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品；Malvern Nano ZS90 型納米粒徑及電位分析儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司產(chǎn)品；GENESYS 10S 型紫外-可見分光光度計(jì)，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；F-380 型熒光分光光度計(jì)，天津港東科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 脂肪酶活力的測(cè)定

酶活力測(cè)定方法[12]參照國(guó)標(biāo)GB/T 23535-2009 進(jìn)行。通過(guò)測(cè)量脂肪酶催化油脂水解產(chǎn)生脂肪酸的含量來(lái)表征脂肪酶的催化活力?？瞻捉M（未加離子）酶活力為100%。某公司海水功能飲品為濃縮液，需稀釋100倍后飲用。飲用時(shí)飲品中Mg2+、Ca2+、Na+、K+和B3+離子的濃度分別為8.83、0.04、2.52、0.73 和0.07 mmol/L。參照該飲品中5 種離子的濃度，分別配制不同濃度離子溶液。取適量酶粉溶于5 mL 磷酸鹽緩沖液中，與不同濃度等量的離子溶液混合均勻。空白組加入等量純水，而樣品組酶液離子濃度分別為：Mg2+組2.00、4.00、6.00、8.00、8.83、10.00、12.00 mmol/L；Ca2+組0.02、0.04、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 mmol/L；Na+組1.00、2.00、2.52、3.00、4.00、5.00、6.00 mmol/L；K+組0.50、0.73、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mmol/L。B3+組0.03、0.07、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 mmol/L；海水功能飲品組濃度為海水功能飲品原液的1/100。于40 ℃、200 r/min的條件下在恒溫振蕩搖床中培育15 min 得到樣品酶液，測(cè)定酶活力?？瞻捉M（未加離子）的酶活力為100%，計(jì)算樣品組的相對(duì)酶活力，進(jìn)行比較分析。

1.3 脂肪酶活力穩(wěn)定性的測(cè)定

脂肪酶活力隨著時(shí)間的推移而出現(xiàn)減弱的現(xiàn)象稱為脂肪酶活力的穩(wěn)定性。本文通過(guò)于15 min 和30 min 培育時(shí)間節(jié)點(diǎn)測(cè)定其酶活力，來(lái)表征脂肪酶活力穩(wěn)定性。樣品酶液均于40 ℃、200 r/min 的條件下在恒溫振蕩搖床中培育，分別在15、30 min 時(shí)取出1 mL樣品酶液測(cè)量其酶活力。將空白組培育15 min 后的酶活力設(shè)定為100%，計(jì)算樣品組的相對(duì)酶活力。

1.4 脂肪酶Zeta 電位的測(cè)定

Zeta 電位的變化可用來(lái)考察酶分子的分散機(jī)制和酶分子構(gòu)象的改變[13]。于室溫條件下將適量樣品酶液加入樣品室中，注意檢查室內(nèi)無(wú)小氣泡后，采用Malvern Nano ZS90 型納米粒徑及電位分析儀測(cè)定Zeta 電位。

1.5 脂肪酶紫外吸收光譜的測(cè)定

通過(guò)測(cè)量紫外吸光度強(qiáng)度及峰位變化，表征海水功能飲品及其5 種離子對(duì)脂肪酶紫外光譜特性的影響。取0.1 g 酶粉溶于純水，定容至100 mL，酶液用不同濃度的Mg2+、Ca2+、Na+、K+、B3+離子溶液和海水功能飲品溶液在室溫下處理成樣品酶溶液。取適量樣品酶溶液于比色皿中，使用GENESYS 10S 型紫外-可見分光光度計(jì)于室溫下掃描，波段為190～350 nm。

1.6 脂肪酶熒光發(fā)射光譜的測(cè)定

通過(guò)研究熒光強(qiáng)度及其峰位置的變化程度，考察海水功能飲品及其5 種離子對(duì)蛋白質(zhì)分子微環(huán)境及構(gòu)象的影響[14]。使用F-380 型熒光分光光度計(jì)測(cè)定酶液熒光光譜，所用樣品配制與紫外光譜中相同。測(cè)量參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)光300 nm，發(fā)射光從280～500 nm 掃描，狹縫寬度10/10，PMT Voltage 950，掃描速率1 200 nm/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)脂肪酶活力的影響

海水功能飲品及其5 種離子對(duì)脂肪酶活力的影響如圖1 所示。

圖1 海水功能飲品及其5 種離子對(duì)脂肪酶活力的影響Fig.1 Effect of marine functional drinks and its five ions on lipase activity

由圖1 可知，Mg2+、Ca2+、Na+、K+、B3+離子組均表現(xiàn)出對(duì)脂肪酶活力的促進(jìn)效果，且與離子濃度呈正相關(guān)。Mg2+離子在濃度為8.83 mmol/L 時(shí)相對(duì)酶活力為129.95%；Ca2+離子在濃度為0.04 mmol/L 時(shí)相對(duì)酶活力為102.40%；Na+離子在濃度為2.52 mmol/L 時(shí)相對(duì)酶活力為121.51%；K+離子在濃度為0.73 mmol/L 時(shí)相對(duì)酶活力為117.95%；B3+離子在濃度為0.07 mmol/L 時(shí)相對(duì)酶活力為107.94%；稀釋100 倍的海水功能飲品對(duì)酶催化活力的促進(jìn)作用最為顯著，相對(duì)酶活力為149.19%。由于海水功能飲品中含有多種離子，其種類與濃度的不同對(duì)酶的空間結(jié)構(gòu)和功能所起的作用方式也不盡相同[15]。多種離子可通過(guò)影響脂肪酶的活性中心、或者改變環(huán)境極性使酶的構(gòu)象發(fā)生改變[16]，促使酶活力顯著提升，因而表現(xiàn)為相對(duì)酶活力最強(qiáng)。

2.2 對(duì)脂肪酶活力穩(wěn)定性的影響

海水功能飲品及5 種常量離子對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性的影響如表2 所示。

表2 海水功能飲品及其5 種離子對(duì)脂肪酶穩(wěn)定性的影響Tab.2 Effect of marine functional drinks and its five ions on stability of lipase

由表2 可知：空白組脂肪酶培育15 min 后的酶活力為100%，30 min 后空白組的相對(duì)酶活力則為79.60%；所有離子組的相對(duì)酶活力在15 min 和30 min后均高于空白組，對(duì)脂肪酶活力穩(wěn)定性有不同程度的提升，且提升效果隨著離子濃度的升高而增強(qiáng)；離子組中，當(dāng)離子濃度與飲品中離子濃度相同時(shí)，濃度為8.83 mmol/L 的Mg2+離子對(duì)脂肪酶活力穩(wěn)定性的維持效果最好，15 min 后相對(duì)酶活力為129.95%，30 min后的相對(duì)酶活力為114.29%，為空白組30 min 后的相對(duì)酶活力的1.44 倍；海水功能飲品組15 min 和30 min后的相對(duì)酶活力分別為149.19%、139.18%，遠(yuǎn)高于單一離子的相對(duì)酶活力。

2.3 對(duì)脂肪酶影響的機(jī)理研究

2.3.1 對(duì)脂肪酶Zeta 電位的影響

不同濃度的5 種離子和海水功能飲品對(duì)脂肪酶Zeta 電位的影響如圖2 所示。

圖2 海水功能飲品及其5 種離子對(duì)脂肪酶Zeta 電位的影響Fig.2 Effect of marine functional drinks and its five ions on zeta potential of lipase

由圖2 可知，伴隨著離子濃度的上升，一價(jià)離子（Na+、K+）和B3+增加了Zeta 電位絕對(duì)值，二價(jià)陽(yáng)離子（Mg2+、Ca2+）降低了Zeta 電位絕對(duì)值。海水功能飲品組的Zeta 電位絕對(duì)值為12.18 mV，相比空白組絕對(duì)值增加了0.68 mV。Zeta 電位絕對(duì)值增加，使分子表面靜電作用增強(qiáng)，粒子之間的排斥力增加[17]，酶液體系變得更分散、更穩(wěn)定，可使酶分子更好更均勻地分散在溶液中，不易聚集沉淀。其中，一價(jià)陽(yáng)離子比二價(jià)陽(yáng)離子能更有效地提高酶分子的Zeta 電位絕對(duì)值。由于離子的加入可改變酶分子表面氨基酸殘基的帶電性，使分子表面所帶電荷量改變，導(dǎo)致部分氨基酸序列重排，最終使酶分子構(gòu)象改變。海水功能飲品及5 種離子使脂肪酶的Zeta 電位發(fā)生明顯改變，證明了海水功能飲品及5 種離子影響了酶分子構(gòu)象。

2.3.2 紫外吸收光譜分析

海水功能飲品及其5 種離子對(duì)脂肪酶紫外光譜特性的影響如圖3 所示。

圖3 海水功能飲品及其5 種離子與脂肪酶作用的紫外光譜Fig.3 UV spectra of lipase interacting with marine functional drinks and its five ions

由圖3 可知，酶液最大吸收峰在194 nm 處，主要是芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）或者肽鍵中C—O 基的n-p3躍遷所致[18]。離子濃度越高，酶液的吸光度越大，其中Mg2+離子組吸光度變化最大，酶液吸光度由空白組的2.573 1 增至2.618 9，海水功能飲品組的吸光度為2.678 7，是空白組吸光度的1.041 倍。海水功能飲品及5 種離子通過(guò)改變發(fā)色基團(tuán)的微環(huán)境極性，使其與助色團(tuán)相連發(fā)生共軛效應(yīng)，從而影響酶分子的構(gòu)象[19]，表現(xiàn)為吸光度增加和最大吸收峰位紅移3 nm。而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在溶液中構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變時(shí)會(huì)影響脂肪酶的結(jié)構(gòu)與功能，表現(xiàn)為對(duì)脂肪酶活力的影響[20]。

2.3.3 熒光發(fā)射光譜分析

海水功能飲品及其5 種離子對(duì)脂肪酶熒光光譜的影響如圖4 所示。

圖4 海水功能飲品及其5 種離子與脂肪酶作用的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of lipase interacting with marine functional drinks and its five ions

由圖4 可知，經(jīng)300 nm 激發(fā)后，天然酶內(nèi)源熒光在304 nm 處有最大發(fā)射峰，此處所得的發(fā)射峰主要是芳香族氨基酸（色氨酸和酪氨酸）殘基作用的結(jié)果[21-22]。樣品組與空白組的熒光強(qiáng)度相比發(fā)生了明顯變化，離子濃度的增加致使樣品熒光強(qiáng)度先升高后降低，熒光發(fā)射峰位基本沒有出現(xiàn)位移現(xiàn)象，且峰型無(wú)明顯變化。這說(shuō)明發(fā)生在5 種離子與脂肪酶之間的作用一定程度上影響了脂肪酶分子的結(jié)構(gòu)[23]，從而表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度先升后降的趨勢(shì)。海水功能飲品組的熒光強(qiáng)度最高，為2 529.865，比空白組升高1 152.861。熒光反映生色團(tuán)所處微環(huán)境的信息[14]，海水功能飲品中多種離子的存在，改變了溶液極性，使蛋白質(zhì)微環(huán)境極性增強(qiáng)，致使蛋白質(zhì)分子構(gòu)象改變，熒光強(qiáng)度升高[24]。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)飲品及其5 種常量離子（Mg2+、Ca2+、Na+、K+、B3+）對(duì)脂肪酶催化活力、Zeta 電位及光譜特性的影響進(jìn)行分析，得出如下結(jié)論：

（1）5 種離子對(duì)脂肪酶的活力及穩(wěn)定性均有促進(jìn)作用，且隨離子濃度的升高而增強(qiáng)，海水功能飲品對(duì)脂肪酶促進(jìn)效果最顯著。

（2）一價(jià)陽(yáng)離子（Na+、K+）和B3+比二價(jià)陽(yáng)離子（Mg2+、Ca2+）能更有效地提高酶分子的Zeta 電位絕對(duì)值。海水功能飲品使酶分子的Zeta 電位絕對(duì)值增加，證實(shí)氨基酸殘基帶電性發(fā)生變化，導(dǎo)致氨基酸序列重排，影響酶分子區(qū)域構(gòu)象，使酶液體系變得更分散，不易沉淀。

（3）5 種離子均使脂肪酶的紫外吸收和熒光強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)增大。與空白組相比，海水功能飲品組紫外吸光度是空白組的1.041 倍，最大吸收峰紅移3 nm，而熒光強(qiáng)度增大1 152.861，表明海水功能飲品中的5 種離子可能通過(guò)影響微環(huán)境極性，使其與助色團(tuán)相連發(fā)生共軛效應(yīng)，從而導(dǎo)致酶分子構(gòu)象改變，影響脂肪酶的結(jié)構(gòu)與功能，表現(xiàn)為對(duì)脂肪酶活力的提升。