朱國勝 邱麗影 資 捷

廣東省深圳市福田區(qū)婦幼保健院檢驗科 518045

卵巢癌是常見的且致死率最高的婦科惡性腫瘤,其中90%～95%為卵巢原發(fā)性癌,在中國女性癌癥死亡原因中排名第七位。卵巢癌患者早期無明顯的臨床癥狀,且缺乏有效的早篩手段,因此早期診斷比較困難,約70%的病人確診時已進入晚期。其標準治療方案為細胞減滅術(shù)及藥物化療,但是經(jīng)過治療后大約25%病人在6個月后出現(xiàn)耐藥型復(fù)發(fā),病人5年生存率約為31%,10年生存率僅為15%[1-2]。卵巢癌對患者生命健康的危害及造成的社會負擔十分巨大,而缺乏早期診斷方法和化療耐藥是導(dǎo)致卵巢癌致死率高的關(guān)鍵因素,因此,探尋卵巢癌發(fā)病機制和尋找卵巢癌的早期診斷標志物和治療靶點具有非常重要的意義。

DDX5和DDX17是Dead-Box(DDX)RNA解旋酶家族中高度相似的兩個成員,它們對RNA具有多種調(diào)節(jié)功能,參與轉(zhuǎn)錄起始、選擇性剪切和miRNA加工等過程[3-4]。有研究表明,DDX5和DDX17在結(jié)腸癌等惡性腫瘤組織中出現(xiàn)異常高表達,與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。目前關(guān)于DDX5和DDX17在卵巢癌組織中表達的研究少見,具體機制尚未明確。本研究利用RT-PCR技術(shù)檢測卵巢癌組織樣本和正常卵巢上皮樣本中DDX5和DDX17的mRNA表達水平,為揭示DDX5和DDX17通過調(diào)節(jié)miRNA來促進卵巢癌發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制提供實驗依據(jù)。

1 樣本與方法

1.1 樣本與細胞系獲取 卵巢癌細胞系SKOV3購自中國科學院細胞庫(中國上海)。選取37例因卵巢癌行切除的卵巢癌組織(試驗組)及26例因良性病變行切除的正常卵巢上皮細胞(對照組)。試驗組樣本納入標準：(1)符合卵巢癌診斷標準,并經(jīng)病理學確診為原發(fā)性卵巢癌;(2)從未接受放療及化療。上述卵巢癌組織和正常卵巢上皮細胞的收集經(jīng)過患者知情同意后獲取。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測DDX5和DDX17基因mRNA表達水平：按照Thermo TRIzol RNA提取試劑盒說明書要求提取卵巢癌組織及正常卵巢上皮細胞總RNA,并用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以該產(chǎn)物作為模板分別對目的基因 DDX5 和 DDX17 進行擴增,使用GAPDH為內(nèi)對照,每樣本做3復(fù)孔。反應(yīng)體系：2xPower SYBR Green Master Mix 10μl,DDX5或DDX17的上下游引物均為2μl,β-actin 上下游引物均為2μl,cDNA 模版2μl,體系總體積為 20μl。在 PCR 儀中執(zhí)行以下程序：94℃預(yù)變性5min;94℃變性15s,60 ℃退火40s,72℃延伸40s,40個循環(huán)。引物序列如下：DDX5 上、下游引物分別為5’-AGAGGTGATGGGCCTATTTGC-3’和5’-TCAAGCGACAAGCTCGACAAT-3’;DDX17上、下游引物分別為5’-GGATGTCTGCATGGAAAGTG-3’和5’-TCAGATCATCACAGCGTCTC-3’;內(nèi)對照GAPDH上、下游引物分別為5’-ATTTGGCTACAGCAACAGG-3’和5’-TTGAGCACAGGGTACTTTATT-3’。

通過計算 2-ΔΔCt值,量化基因相對表達水平進行比較分析。由PCR擴增曲線得到了每個樣品的目的基因和內(nèi)參基因平均Ct值(閾值循環(huán)數(shù)),以一卵巢正常上皮細胞作為參照樣品,基因相對表達量ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因,相對表達值ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組,mRNA 的相對表達量即為2-ΔΔCt。

1.2.2 建立DDX5和DDX17沉默細胞株,并檢測細胞活性：構(gòu)建針對DDX5和DDX17基因的pLKO.1 shRNA質(zhì)粒,將上述質(zhì)粒、對照質(zhì)粒(pLKO.1-Scramble)分別與包裝質(zhì)粒pCMV-dR8.2和 pCMV-VSVG 共轉(zhuǎn)染到293T細胞中進行包裝,收集病毒上清。使用病毒上清感染卵巢癌細胞系SKOV3,48h后使用2μg/ml嘌呤霉素篩選5d,得到DDX5和DDX17基因穩(wěn)定沉默細胞株,分別命名為shNC、shDDX5-1、shDDX5-2、shDDX17-1和shDDX17-2,用Western Blot驗證。

將上述篩選獲得的5種不同細胞株按相同數(shù)量接種于96孔板中,在37℃下培養(yǎng)72h,加入CCK-8溶液(10μl)到96孔板的培養(yǎng)基中。然后將混合物在37℃孵育2h,并使用分光光度計測量吸光度(OD)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用統(tǒng)計學分析軟件SPSS22.0進行數(shù)據(jù)分析處理,兩實驗組比較采用獨立樣本t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DDX5和DDX17在卵巢癌細胞和正常卵巢上皮細胞的表達水平 通過實時熒光定量PCR實驗分析37例卵巢癌細胞和26例卵巢正常上皮細胞中兩基因的mRNA表達水平,結(jié)果顯示(見圖1)：相對于正常卵巢上皮細胞,卵巢癌組織中DDX5的表達顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),而卵巢癌組織中DDX17的表達明顯降低(P<0.01)。

圖1 DDX5和DDX17 mRNA相對表達水平

2.2 沉默DDX5和DDX17卵巢癌SKOV3細胞株的增殖能力 通過轉(zhuǎn)染分別使SKOV3細胞系中的DDX5和DDX17沉默,得到DDX5和DDX17基因穩(wěn)定沉默細胞株,分別命名為shNC、shDDX5-1、shDDX5-2、shDDX17-1和shDDX17-2。Western Blot驗證如下(見圖2)：與shNC組對比,DDX5沉默細胞株DDX5的表達明顯下調(diào),DDX17沉默細胞株DDX17的表達明顯下調(diào)。通過CCK-8檢測發(fā)現(xiàn),與shNC和DDX17沉默的卵巢癌細胞相比,DDX5沉默的SKOV3 細胞的增殖能力降低;DDX17沉默的卵巢癌細胞增殖能力與shNC對照組無明顯差別(見圖3)。

圖2 DDX5和DDX17基因沉默卵巢癌細胞系中DDX5和DDX17表達

圖3 DDX5和DDX17基因沉默卵巢癌細胞系體外增殖情況

3 討論

DDX5和DDX17的核心區(qū)域是DEAD box家族保守的模體,具有90%的同源性,而N端和C端區(qū)域則同源性較弱,分別約為60%和30%[7],它們可能與不同 RNA底物或者蛋白相互作用,導(dǎo)致在細胞中存在不同功能。DDX5和DDX17已被證實通過與自身高度調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子相互作用并調(diào)節(jié)其活性,參與細胞的轉(zhuǎn)錄起始、選擇性剪切和miRNA加工等生物學過程;與組織發(fā)育成熟及腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān),在癌癥中同時扮演著促進和抑制的雙重角色[8-9]。

DDX5和DDX17可與腫瘤細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物,調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達,從而影響上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤細胞增殖。在結(jié)腸癌中,DDX5和DDX17結(jié)合β-catenin,刺激β-catenin調(diào)控的c-Myc、cyclin D1等原癌基因的表達,從而促進結(jié)腸癌細胞的增殖;在實驗鼠中,敲低DDX5和DDX17 的表達可以抑制結(jié)腸癌細胞的增殖,并減少腫瘤的形成。也有研究表明,血小板衍生因子(PDGF)會通過磷酸化DDX5促進腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)過程[10]。

隨著研究的深入,DDX5和DDX17在癌癥發(fā)展過程中的抑制作用逐漸被研究者揭示。DDX5和DDX17是抑癌基因p53的共轉(zhuǎn)錄因子,對p53介導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答至關(guān)重要,但DDX17同p53的相互作用要弱于DDX5,DDX5沉默會顯著抑制p53在DNA損傷應(yīng)答下對細胞周期抑制蛋白p21的轉(zhuǎn)錄激活作用[11]。另外,在許多癌癥細胞中,Hippo信號通路會發(fā)生突變而失去功能。Mori M的研究發(fā)現(xiàn),在肝癌細胞中失活的Hippo信號通路會導(dǎo)致YAP蛋白聚集在細胞核中,而YAP蛋白會結(jié)合DDX17,使其無法參與miRNA加工過程,最終導(dǎo)致許多腫瘤抑制相關(guān)miRNA水平降低,使腫瘤細胞生長加速;而過表達DDX17則會抑制Hippo通路失活引起的細胞過快生長[12]。

本研究利用熒光定量PCR技術(shù)檢測36例卵巢癌液氮標本和27例正常卵巢上皮標本中DDX5和DDX17 mRNA表達水平,發(fā)現(xiàn)對比正常卵巢上皮細胞,卵巢癌細胞中DDX5表達上升,而DDX17表達下降;沉默DDX5的卵巢癌細胞增殖能力降低,沉默DDX17的卵巢癌細胞增殖能力卻無明顯差別。這可能是DDX5可以通過無義介導(dǎo)的mRNA降解(Nonsense-mediated mRNA decay,NMD)降低DDX17表達[13],卵巢癌中高水平的DDX5導(dǎo)致DDX17表達下降;也可能是在卵巢癌細胞中,DDX5和DDX17與不同的RNA底物或蛋白作用,在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著不同的作用。Iyer R Sumanth等發(fā)現(xiàn)DDX5沉默后極大地降低了質(zhì)粒穩(wěn)定性,而敲低DDX17對質(zhì)粒穩(wěn)定性沒有明顯影響,DDX5促進乳腺癌細胞DNA復(fù)制[14]。在卵巢癌細胞中,DDX5影響質(zhì)粒穩(wěn)定性,促進DNA復(fù)制因子表達,促進癌細胞增殖,DDX5的沉默會損害DNA復(fù)制因子表達,導(dǎo)致卵巢癌細胞增殖能力下降;DDX17對質(zhì)粒穩(wěn)定性沒有明顯影響,因此,沉默DDX17對卵巢癌細胞增殖能力影響不大。

本研究中卵巢癌細胞DDX5的表達上升,DDX17的表達下降,而既往研究中兒童髓母細胞瘤、腦膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤細胞DDX5和DDX17的表達水平均升高[15-16],可能是DDX5/DDX17既可作為自身高度調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子的激活因子,也可為抑制因子,其功能受細胞環(huán)境、DDX5/DDX17翻譯后的修飾、特異的啟動子被調(diào)控等因素影響[17]。卵巢癌細胞中DDX5和DDX17的異常表達提示DDX5和DDX17可能成為卵巢癌的生物學標志物。沉默DDX5的卵巢癌細胞增殖能力降低,說明在卵巢癌中,高表達的DDX5可能扮演一個癌基因的角色,起促進卵巢癌細胞發(fā)生增殖的作用,可作為卵巢癌治療的一個潛在靶點。

綜上所述,DDX5和DDX17在卵巢癌組織中顯著異常表達,DDX5的表達情況會影響卵巢癌細胞的增殖,對卵巢癌的早期診斷具有一定價值。在后期研究中需進一步探究DDX5和DDX17在卵巢癌發(fā)生中的作用機制,探討上下游的可能的調(diào)控因子,明確DDX5和DDX17通過哪個信號軸調(diào)控卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。通過研究找到卵巢癌早期診斷標志物,爭取通過檢驗發(fā)現(xiàn)早期卵巢癌,對后續(xù)開展靶向治療提供基礎(chǔ),挽救更多患者的生命,為社會發(fā)展作出貢獻。