高 洋, 曾維康, 魏嘉琪, 過一馳, 程一珊, 姜樹坤, 趙明輝, 耿麗娟, 郭志富

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 沈陽 110866;2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所, 哈爾濱 150086;3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所, 沈陽 110866; 4.沈陽市食品藥品檢驗(yàn)所, 沈陽 110000)

低溫冷害是常見的非生物逆境之一,對(duì)水稻(OryzasativaL.)的生長發(fā)育影響巨大,是限制水稻產(chǎn)量穩(wěn)定和提高的主要環(huán)境因素[1]。寒地水稻因特殊的選育和生長環(huán)境,具備更好的低溫耐受潛力和基礎(chǔ)[2],其主要在東北稻區(qū)尤其是黑龍江稻區(qū)種植,而黑龍江稻區(qū)作為我國最大的商品粳稻生產(chǎn)基地,水稻種植面積和產(chǎn)量均為全國第一,近三年水稻種植面積約占全國粳稻面積的50%[3],對(duì)保障國家糧食安全具有重要的戰(zhàn)略意義。

多年來,針對(duì)高緯度低積溫以及冷害頻發(fā)等問題,東北地區(qū)水稻育種工作者選育出很多熟期早、抗性強(qiáng)、產(chǎn)量高的寒地水稻品種,為東北稻區(qū)水稻產(chǎn)量的穩(wěn)定和提高奠定了基礎(chǔ),同時(shí)為深入開展水稻耐冷基礎(chǔ)理論研究提供了理想的研究材料。龍粳、龍稻、綏粳、墾稻等系列品種,均在東北稻區(qū)有一定的種植面積[4]。在眾多寒地水稻品種中,龍粳31因其高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)等顯著特點(diǎn),多年來一直是全國粳稻種植面積最大的品種,已累計(jì)推廣超過130萬hm2。目前,針對(duì)龍粳31的基礎(chǔ)理論研究主要集中在栽培措施的優(yōu)化上,如種植密度調(diào)整、肥料配比優(yōu)化、旱直播條件摸索等方面,最近也出現(xiàn)了龍粳31遺傳基礎(chǔ)分析以及利用基因編輯技術(shù)對(duì)其進(jìn)行品質(zhì)改良探索的相關(guān)報(bào)道[5-8]。龍粳31作為種植面積最大的寒地水稻品種,有很強(qiáng)的耐冷性,但目前對(duì)于龍粳31低溫耐受表型特征及生理生化等方面的研究較為少見,限制了對(duì)寒地水稻耐冷機(jī)理的深入了解。

油菜素內(nèi)酯(Brassinolides,BRs)是甾醇類植物激素中最具活性的一種,可有效提高植物的抗冷性。研究表明,外源噴施BRs對(duì)于水稻不同時(shí)期耐冷性的提高均有顯著的促進(jìn)作用[9-12]。目前,BRs處理與寒地水稻耐冷性關(guān)系方面的研究尚未見報(bào)道?；谝陨戏治?本研究以耐冷性較強(qiáng)的寒地水稻龍粳31和冷敏感水稻9311為研究材料,在芽期和苗期分別鑒定其在冷處理以及低溫和BRs聯(lián)合處理下的耐冷表型性狀變化,并測(cè)定耐冷相關(guān)生理生化指標(biāo)及內(nèi)源激素含量的變化情況,為寒地水稻耐冷生理基礎(chǔ)及BRs途徑下水稻耐冷調(diào)控機(jī)制的明確提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以寒地水稻龍粳31和冷敏感水稻9311為試驗(yàn)材料。龍粳31由黑龍江農(nóng)科院水稻研究所提供,9311由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1低溫脅迫及BRs處理后低溫發(fā)芽率測(cè)定

試驗(yàn)分為三個(gè)處理,常溫對(duì)照為25 ℃(ck)、低溫處理溫度為17 ℃、聯(lián)合處理為BRs(0.01 μmol/L)+17 ℃低溫處理。選取50粒健康飽滿的水稻種子,在45 ℃烘箱處理2 d打破休眠后,分別使用蒸餾水和BRs(0.01 μmol/L)進(jìn)行24 h浸種處理。將浸種后的種子置于放有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中分別放入25 ℃和17 ℃光照培養(yǎng)箱中處理7 d。

1.2.2低溫脅迫及BRs處理后苗期表型的測(cè)定

試驗(yàn)分為3個(gè)處理,常溫25 ℃、4 ℃低溫處理、聯(lián)合處理為BRs(0.1 μmol/L)+4 ℃低溫處理。選取健康飽滿的種子,在45 ℃烘箱里放置3 d打破種子休眠后,放在墊有濕潤濾紙的玻璃培養(yǎng)皿里,于35 ℃恒溫箱中黑暗催芽72 h,種在混合基質(zhì)土(V基質(zhì)土∶V蛭石∶V珍珠巖=2∶2∶1)的栽培盆(7 cm×7 cm×7 cm),在25 ℃培養(yǎng)室內(nèi)生長21 d,長至三葉期,將4 ℃、4 ℃+BRs(處理前24 h,用0.1 μmol/L BRs進(jìn)行根際灌溉和葉面噴施)兩種處理,置于10 ℃低溫培養(yǎng)箱中處理7 d后,常溫恢復(fù)7 d,將表型與ck進(jìn)行比較。

1.2.3低溫脅迫及BR處理后苗期葉片生理生化指標(biāo)測(cè)定

將前述苗期低溫和聯(lián)合處理的水稻幼苗按0、1、3、5、7 d進(jìn)行葉片取樣,分別進(jìn)行脯氨酸(Pro)含量、丙二醛(MDA)含量、相對(duì)電導(dǎo)率、超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定[14-15]。

1.2.4低溫脅迫及BR處理后苗期葉片生理生化指標(biāo)測(cè)定

苗期低溫和聯(lián)合處理3 d后,對(duì)幼苗葉片進(jìn)行取樣,使用預(yù)冷卻的研缽將0.5 g樣品勻漿,然后在4 mL提取溶液中進(jìn)行超聲輔助提取45 min。12 000 r/min離心10 min后,收集上清液,重復(fù)抽提一次。用2 mL甲醇和2 mL甲酸(1 mol/L)預(yù)活化HLB和MCX柱。然后,將500 μL溶液通過0.22 μm過濾器過濾,并轉(zhuǎn)移到2 mL的LC-MS瓶中進(jìn)行UPLC-MS/MS分析[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫及BRs處理對(duì)水稻發(fā)芽率的影響

由圖1可知,龍粳31的ck、低溫處理和BRs+低溫處理的發(fā)芽率分別為100.00%、93.33%、97.33%,而9311的ck、低溫處理和BR+低溫處理的發(fā)芽率分別為100.00%、82.67%、86.00%,冷處理的龍粳31和9311發(fā)芽率分別降低6.67%和17.33%,證明龍粳31的低溫發(fā)芽率要高于9311,具備更好的芽期耐冷基礎(chǔ)。BRs浸泡后進(jìn)行冷處理的龍粳31和9311發(fā)芽率分別降低4.29%和4.03%,證明低溫條件下,BRs對(duì)水稻種子發(fā)芽率有一定的抑制作用。

圖1 低溫發(fā)芽率表型Fig.1 Germination rate phenotype under cold temperature

注:每組材料從左到右分別為25 ℃常溫對(duì)照,4 ℃冷處理,BRs+4 ℃冷處理。A為冷處理3 d;B為冷處理7 d;C為恢復(fù)生長3 d;D為恢復(fù)生長7 d。圖2 苗期耐冷表型Fig.2 Phenotype with cold tolerance at seedling stage

2.2 低溫脅迫及BRs處理后苗 期表型變化

苗期耐冷表型鑒定結(jié)果表明,冷處理7 d后,龍粳31和9311的生長均受到明顯的抑制。當(dāng)恢復(fù)生長3 d時(shí),9311出現(xiàn)枯萎現(xiàn)象,而龍粳31長勢(shì)明顯好于9311,當(dāng)恢復(fù)生長7 d時(shí),9311已經(jīng)干枯死亡,龍粳31仍然長勢(shì)良好,說明龍粳31具有更強(qiáng)的苗期耐冷性。與單獨(dú)冷處理相比,BRs+冷處理后明顯緩解了低溫對(duì)龍粳31的生長限制,而對(duì)于9311的緩解作用并不明顯(圖2)。

2.3 低溫脅迫及BRs處理對(duì)水稻生理指標(biāo)的影響

為了進(jìn)一步探究寒地水稻耐冷生理變化,對(duì)低溫及BRs處理下的SOD活性、Pro和MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率進(jìn)行鑒定。常溫下,龍粳31和9311幼苗的SOD活性相近,隨著低溫處理時(shí)間的延長,兩種材料的SOD活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),且龍粳31的上升幅度明顯高于9311。0.1 μmol/L的BR處理后,龍粳31和9311在低溫脅迫后SOD活性同樣呈先上升再下降的趨勢(shì),而上升幅度大于單獨(dú)低溫處理?xiàng)l件(圖3 A);常溫下,龍粳31幼苗的Pro含量始終高于9311;在低溫處理后兩材料的Pro含量均呈上升趨勢(shì),相比而言,龍粳31上升幅度更大,說明在龍粳31受低溫脅迫后Pro有更多的積累,可能比9311更具耐冷生理基礎(chǔ)。與單獨(dú)低溫處理相比,BRs+低溫處理下龍粳31的Pro含量整體變化不大,但9311的Pro含量顯著提高(圖3 B);常溫下,龍粳31和9311幼苗的MDA含量相近;隨低溫處理時(shí)間的延長,龍粳31和9311的MDA含量累積逐漸增多,且龍粳31上升程度明顯低于9311,說明龍粳31可能具有更強(qiáng)的清除膜脂過氧化物的能力;與單獨(dú)低溫處理相比,BRs+低溫處理后MDA含量均呈下降趨勢(shì),且9311下降幅度更為明顯(圖3 C);常溫下,龍粳31幼苗的相對(duì)電導(dǎo)率和9311近似;隨著低溫處理時(shí)間延長,龍粳31和9311的相對(duì)電導(dǎo)率均顯著上升,且9311較龍粳31的相對(duì)電導(dǎo)率上升幅度更大,說明9311的質(zhì)膜對(duì)低溫脅迫可能更敏感。與單獨(dú)低溫處理相比,BRs+低溫處理可以降低龍粳31和9311的相對(duì)電導(dǎo)率,且對(duì)9311的作用更為明顯(圖3 D)。

注:A為SOD活性;B為Pro含量;C為MDA含量;D為相對(duì)電導(dǎo)率?！?”表示p<0.05,“**”表示p<0.01,“***”表示p<0.001。下同。圖3 不同處理下生理指標(biāo)變化Fig.3 Changes of physiological indicators under different treatments

注:A為IAA含量;B為GA含量;C為ABA含量;D為SA含量;“*”表示p<0.05,“**”表示p<0.01,“***”表示p<0.001。圖4 不同處理下植物激素含量變化Fig.4 Changes of the plant hormone content under different treatments

2.4 低溫脅迫及BRs處理對(duì)水稻內(nèi)源激素的影響

在不同處理下,對(duì)植物低溫響應(yīng)相關(guān)的激素IAA、GA、ABA和SA的含量分別進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明,常溫下龍粳31幼苗IAA含量要高于9311。低溫處理后,龍粳31和9311的IAA含量均顯著上升,分別提高了228.44%和338.62%,9311的上升幅度更大。與單獨(dú)低溫處理相比,BRs+低溫處理下龍粳31和9311的IAA含量分別降低了32.58%、33.56%(圖4 A);GA含量的變化情況顯示,常溫下9311幼苗GA含量高于龍粳31。低溫處理后,龍粳31和9311的GA含量均顯著下降,分別下降了39.20%和30.23%,龍粳31的下降幅度更大。與單獨(dú)低溫處理相比,BRs+低溫處理下龍粳31和9311的GA含量分別升高了20.76%和11.43%,且龍粳31上升幅度更大(圖4 B);針對(duì)ABA含量而言,常溫下龍粳31和9311幼苗ABA含量相近。低溫處理后,龍粳31和9311的ABA含量均呈上升趨勢(shì),分別提高了44.78%和214.99%,9311上升幅度更大。與單獨(dú)低溫處理相比,BRs+低溫處理下龍粳31和9311的ABA含量分別升高了140.40%和135.87%(圖4 C);而SA含量在常溫下龍粳31和9311幼苗相近。低溫處理后,龍粳31和9311中SA含量均有所上升,分別提高了12.61%、229.12%,9311的上升幅度顯著高于龍粳31。與單獨(dú)低溫處理相比,BRs+低溫處理下龍粳31和9311中SA含量分別升高了10.48%和25.52%,9311上升幅度更大(圖4 D)。

綜合來看,IAA、ABA和SA含量均在低溫處理后有所提升,且9311上升幅度更為顯著。相反地,GA含量在低溫處理后呈下降趨勢(shì),且龍粳31下降幅度更大。與單獨(dú)低溫處理相比,BRs+低溫處理使ABA、SA和GA含量有所提升,9311提升的幅度更大,而BRs+低溫處理后IAA呈下降趨勢(shì)。這些結(jié)果表明,龍粳31內(nèi)源激素受低溫影響的敏感程度要低于9311,而外源施加BR會(huì)對(duì)大部分植物激素含量產(chǎn)生影響。

3 討論與結(jié)論

3.1 寒地水稻表型性狀與耐冷性的關(guān)系

近年來,研究人員多以低溫處理后的發(fā)芽率、成苗率、發(fā)芽系數(shù)、芽期根長、苗長和第一葉長等表型指標(biāo)評(píng)價(jià)寒地水稻的芽期耐冷性;以死葉率、葉片赤枯度、葉片卷曲度、根長、苗長、側(cè)根數(shù)、干重及鮮重等表型指標(biāo)進(jìn)行水稻苗期耐冷性鑒定[17-19]。在本研究中,龍粳31與9311的低溫發(fā)芽率有所降低,但龍粳31的降低幅度要小于9311。對(duì)于苗期而言,9311低溫處理后恢復(fù),出現(xiàn)了瀕臨枯死的狀態(tài),但龍粳31低溫處理恢復(fù)后植株依舊長勢(shì)良好。這些結(jié)果表明,寒地水稻龍粳31在芽期和苗期均具有更好的耐冷能力。外源施加BRs能緩解低溫對(duì)水稻芽期和苗期生長的不利影響,進(jìn)一步說明BRs處理對(duì)于水稻耐冷表型有一定的緩解作用。

3.2 外源BRs及低溫脅迫對(duì)水稻幼苗生理生化指標(biāo)的影響

研究表明,低溫逆境會(huì)減少水稻葉綠素的合成,增加ROS、MDA和可溶性糖含量以及電解質(zhì)滲漏率及細(xì)胞膜透性等,同時(shí)也可以顯著提高SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性,進(jìn)而賦予植物對(duì)低溫脅迫的抵抗力[1,14-15]。外源施加BRs可顯著改善低溫誘導(dǎo)的氧化脅迫,降低MDA含量,提高POD、SOD的活性[9-12]。本研究中,龍粳31和9311在遭遇低溫脅迫期間,均可通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來提高自身耐冷性。隨著低溫處理時(shí)間的延長,在一定時(shí)間內(nèi),Pro含量繼續(xù)呈上升趨勢(shì),隨著冷脅迫時(shí)間不斷加長,Pro含量開始逐漸減少。BRs+低溫處理?xiàng)l件下,0.1 μmol/L BRs處理可以影響低溫下龍粳31和9311的Pro含量,但影響并不顯著。低溫脅迫下龍粳31和9311的MDA累積逐漸增多,相對(duì)電導(dǎo)率顯著上升,但相對(duì)而言龍粳31的上升幅度更小,說明龍粳31清除膜脂過氧化物的能力可能更強(qiáng)。針對(duì)BRs+低溫處理?xiàng)l件來分析,0.1 μmol/L的BRs處理初期,龍粳31和9311在低溫下MDA的含量和相對(duì)電導(dǎo)率均有所降低,這也為BRs提高水稻耐冷性提供了生理層面的證據(jù)。低溫脅迫初期水稻可以通過增加抗氧化酶活性來提高自身耐冷性,隨著低溫處理時(shí)間延長,龍粳31和9311的SOD活性均呈現(xiàn)先上升再下降趨勢(shì),說明植物體內(nèi)酶活性存在動(dòng)態(tài)平衡,超出植物承受范圍,平衡遭到破壞。綜合來看,龍粳31與9311相比,更具耐冷生理基礎(chǔ),而外源BRs處理可使水稻生理指標(biāo)產(chǎn)生利于耐冷性提高的變化趨勢(shì)。

3.3 外源BRs以及低溫脅迫對(duì)水稻幼苗內(nèi)源激素含量的影響

近年來,激素在植物低溫脅迫應(yīng)答中的作用逐漸受到重視。外源施加BRs可顯著影響低溫脅迫下內(nèi)源激素的含量變化,有研究表明,植物激素參與植物對(duì)低溫的響應(yīng),包括ABA、JA、IAA、GA、BRs、SA、C2H4等[9-12]。低溫脅迫后,冬小麥(TriticumaestivumL.)ABA的含量快速增加,GA水平升高,隨著冷處理時(shí)間延長,植物適應(yīng)低溫,ABA、CTK和GA的含量降低,SA和JA的含量開始增加[21]。然而,Du等[22]研究發(fā)現(xiàn),水稻經(jīng)過1 d的低溫處理后,IAA含量連續(xù)5 d保持在較高水平。本研究結(jié)果與之一致。IAA的濃度易受低溫脅迫的影響,其差異取決于植物種類、發(fā)育背景和生理環(huán)境。例如,低溫脅迫后冬小麥中IAA含量增加,而春小麥中IAA含量保持不變[23]。低溫處理小麥后,在小麥冠狀組織中IAA濃度顯著增加,而小麥葉片中的IAA濃度卻無明顯變化[24]。本研究中,龍粳31內(nèi)源激素受低溫影響的敏感程度要低于9311,這與表型和生理指標(biāo)方面的結(jié)論相對(duì)應(yīng)。

綜上所述,通過對(duì)龍粳31和9311耐冷特性鑒定及BRs調(diào)節(jié)其耐冷表型和生理生化指標(biāo)變化的研究,初步證明龍粳31具備更強(qiáng)的芽期和苗期的低溫抗性,同時(shí)具備更好的耐冷生理基礎(chǔ)。BRs處理,可對(duì)水稻芽期和苗期的多個(gè)表型指標(biāo)產(chǎn)生傾向于耐冷性提高的正向影響,對(duì)龍粳31的影響可能更顯著。但是,水稻耐冷性是一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀,關(guān)于寒地水稻耐冷性與激素之間的關(guān)系需要進(jìn)一步研究,外源施加BRs會(huì)對(duì)大部分植物激素含量產(chǎn)生影響,但BRs與水稻內(nèi)源激素之間的關(guān)系仍需要進(jìn)一步探討。