劉慧莉, 陳 垣, 郭鳳霞, 周 洋, 成志強(qiáng)

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省中藥材規(guī)范化生產(chǎn)技術(shù)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省藥用植物栽培育種工程研究中心, 蘭州 730070;2.平?jīng)鍪嘘P(guān)山林業(yè)管理局, 甘肅 平?jīng)?744100)

黨參[Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.]為桔?？?Campanulaceae)黨參屬多年生草本植物,以干燥根入藥,具有健脾益肺,養(yǎng)血生津的功效[1],是我國常用的補(bǔ)益藥之一。甘肅黨參的種植面積占全國黨參種植面積的90%左右,于2012年隴西白條黨參獲中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品(國家市場監(jiān)督管理局,商標(biāo)號4891422)[2-3]。黨參種質(zhì)資源豐富,近緣品種較多。近年來,由于品種間的相互引種、調(diào)種,使得種質(zhì)資源混亂,群體間生物學(xué)混雜,這不僅影響種子的質(zhì)量也影響藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)。

黨參以種子繁殖,研究其開花習(xí)性、花部特征、花粉活力、柱頭可受性等對育種和種子生產(chǎn)具有重要意義。有性生殖過程中,植物的生物學(xué)特性與其傳粉機(jī)制相適應(yīng),大量有活力的花粉、有效的傳媒和可授期的柱頭是植物生殖成功的前提,繁育系統(tǒng)直接影響后代遺傳組成,其中交配系統(tǒng)是核心[4]。已有學(xué)者對暗紫貝母[5]、菘藍(lán)[6-7]、直緣烏頭[8]、黃蓮花[9]等藥用植物的繁育系統(tǒng)進(jìn)行了深入的研究,為藥用植物育種提供了科學(xué)依據(jù)。本研究從開花動(dòng)態(tài)、花粉活力、柱頭可授性、人工授粉和套袋試驗(yàn)等方面研究黨參的繁育系統(tǒng),為黨參品種選育及優(yōu)良品種的提純復(fù)壯提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況與試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地位于甘肅省隴西縣首陽鎮(zhèn)隴西藥鋪園(35°5′22″N,104°24′44″E),海拔1 912 m,年均氣溫7.7 ℃,年均降水量450 mm,降水集中在8—9月,年均日照時(shí)數(shù)292 h,年均無霜期142 d,土壤質(zhì)地為黃綿土。

本試驗(yàn)材料為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的新品系兩年生健康、無病蟲害的植株“甘黨1號”。

1.2 開花動(dòng)態(tài)觀察

觀察黨參花的形態(tài)特征并且在黨參整個(gè)生殖生長期內(nèi)參照王艷芳[11]的方法觀察黨參花期,劃取3個(gè)3 m×3 m樣方,觀測記錄各小區(qū)內(nèi)黨參開花動(dòng)態(tài),試驗(yàn)于7月20日開始,每10天觀測一次,按表1標(biāo)準(zhǔn)記錄。在盛花初期,選取一定數(shù)量即將開花的花朵進(jìn)行掛牌標(biāo)記,每隔2 h觀察一次,記錄其開花狀態(tài)及柱頭與雄蕊位置變化情況。根據(jù)觀察結(jié)果將黨參花劃分等級。

表1 黨參開花進(jìn)程Table 1 The flowering process of Codonopsis pilosula

1.3 花粉活力測定

采用0.5%TTC(2,3,5-氯代三苯基四氮唑)法測定其花粉的活力。選取各等級的花朵,用鑷子小心夾取每朵花中的花藥,分別置于載玻片上,并用鑷子搗碎花藥散出花粉,加1～2滴配制好的TTC溶液,蓋上蓋玻片,放置在室溫且黑暗處10～15 min,隨后置于光學(xué)顯微鏡下觀察花粉粒的染色情況。根據(jù)花粉染色情況判定花粉的活力,花粉粒被染為紅色,表明花粉活力最強(qiáng);淡粉色表明花粉活力次之;無色或綠色時(shí)表明花粉無活力。每一等級花選取3朵進(jìn)行觀察,每次觀察5個(gè)視野并統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)花粉粒總數(shù)以及紅色、淡粉色花粉粒數(shù)目,最后計(jì)算不同級別花朵的花粉活率。

花粉活率/%=[(紅色花粉粒數(shù)+淡粉色花粉粒數(shù))/花粉?？倲?shù)]×100%;

強(qiáng)活力花粉率/%=(紅色花粉粒數(shù)/花粉粒總數(shù))×100%;

弱活力花粉率/%=(淡粉色花粉粒數(shù)/花粉?？倲?shù))×100%。

1.4 柱頭可受性測定

參照Dafni等[10]的方法(聯(lián)苯胺-過氧化氫法)測定柱頭可受性。用鑷子小心摘取各等級花的柱頭并放置于單凹面載玻片上,將含有聯(lián)苯胺-過氧化氫的反應(yīng)液(1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22)滴在柱頭上,使柱頭浸在反應(yīng)液中,隨后將載玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察柱頭周圍產(chǎn)生氣泡的數(shù)量與速度,氣泡越多、速度越快說明柱頭的可受性越強(qiáng),反之柱頭可受性越低,沒有氣泡產(chǎn)生則表明該階段的柱頭不具有可受性。每一等級選取3個(gè)花朵進(jìn)行觀測,每一裝片觀察統(tǒng)計(jì)5個(gè)視野。

1.5 傳粉方式研究

在盛花期對黨參花做以下9個(gè)處理:

1) 自然授粉:不去雄,不套袋,僅掛牌標(biāo)記,檢測自然條件下果實(shí)的結(jié)實(shí)率;

2) 不去雄套紙袋:在花冠還未裂開時(shí)套紙袋,檢測其自交結(jié)實(shí)情況;

3) 去雄套紙袋:選花萼將要裂開、但花藥未裂的花朵,去掉雄蕊,并套上紙袋,檢測是否具有融合生殖;

4) 去雄套網(wǎng)袋:選花藥未裂開的花朵,去掉雄蕊并套上網(wǎng)袋,檢測風(fēng)媒傳粉的結(jié)實(shí)率;

5) 去雄不套袋:去掉未裂開的雄蕊,檢測異花授粉的結(jié)實(shí)率;

6) 去雄同株異花外壁授粉:去掉還未裂開的雄蕊,取同一植株上的另一朵花藥剛裂開的雄蕊,將花藥涂抹在柱頭外壁上,檢測外壁和同株授粉情況;

7) 去雄異株異花外壁授粉:去雄后選取另一植株上剛裂開的花藥進(jìn)行授粉,檢測外壁和異株授粉情況;

8) 去雄同株異花內(nèi)壁授粉:取掉雄蕊后套袋,待柱頭裂開后,取同株花藥裂開的雄蕊,將花粉授在柱頭的內(nèi)壁,隨后繼續(xù)套上紙袋,檢測內(nèi)壁和同株授粉情況;

9) 去雄異株異花內(nèi)壁授粉:操作步驟同8,但取異株的花粉授于內(nèi)壁上,檢測內(nèi)壁和異株授粉情況。

不同花朵之間傳粉授粉時(shí),選擇花冠和花藥都未裂開的花朵進(jìn)行試驗(yàn),每次取花藥時(shí)都將鑷子用75%的酒精消毒,避免交叉?zhèn)鞣?以防摘取部位感染,影響結(jié)果準(zhǔn)確率。網(wǎng)袋選用網(wǎng)孔為1 mm×1 mm的尼龍篩網(wǎng),防止昆蟲傳粉;紙袋選用透氣、透光和防水的硫酸紙袋,大小為8 cm×5 cm,套袋時(shí)用回形針將紙袋開口處夾住,待花朵完全枯萎時(shí)取掉其紙袋,以防影響果實(shí)發(fā)育。

1.6 傳粉媒介觀察

在田間劃取3個(gè)3 m×3 m樣方,盛花期時(shí)每天每隔2 h觀察一次,持續(xù)觀察8 d,觀察傳粉的媒介以及傳粉昆蟲出現(xiàn)的時(shí)間。

2 數(shù)據(jù)分析

2.1 開花動(dòng)態(tài)觀察

觀測結(jié)果(表2)表明,該試驗(yàn)地于7月中旬(7月20日)開始現(xiàn)蕾,7月下旬(7月30日)進(jìn)入初花期,開花數(shù)小于30%,8月上旬(8月10日)進(jìn)入盛花初期,開花數(shù)在30%～50%,盛花期在8月中旬至8月下旬,盛花期時(shí)間較長,大約20 d。9月中旬進(jìn)入開花末期,開花數(shù)量少于10%。

表2 黨參開花時(shí)期Table 2 Flowering period of Codonopsis pilosula

黨參藤蔓較長,相互纏繞,莖色為綠色有些具有紫色斑紋,內(nèi)含乳白色乳汁,分枝較多。花萼多為5裂少見4裂,花冠鐘狀,雄蕊5,柱頭多為3裂少見4裂、5裂。子房常為下位或半下位?；ü诙酁榈S色,有些具有淺紫色花紋。通過對田間黨參花朵的觀察,黨參從現(xiàn)蕾至開花結(jié)束主要經(jīng)歷以下幾個(gè)過程,蕾期—花萼開裂—花冠開裂—雌蕊偏離柱頭—柱頭開裂向下卷曲—花冠枯萎。為使開花動(dòng)態(tài)的觀測更加直觀,用數(shù)字代表每個(gè)進(jìn)程(表3)。

表3 開花動(dòng)態(tài)觀測Table 3 Flowering dynamic abservation

圖1 黨參花柱頭內(nèi)外壁Fig.1 Inner and outer wall of Codonopsis pilosula stigma

圖2 不同等級黨參花朵Fig.2 Different grades of Codonopsis pilosula flowers

表4 不同等級黨參花朵花粉活力的比較Table 4 Comparison of pollen vitality of different grades of Codonopsis pilosula

圖3 不同等級黨參花朵柱頭在聯(lián)苯胺-過氧化氫反應(yīng)液中的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of the aniline-hydrogen peroxide for different grades of Codonopsis pilosula flowers

圖4 黨參花朵傳粉媒介Fig.4 The flower pollinator of Codonopsis pilosula

通過觀察發(fā)現(xiàn),黨參為兩性花,既有雌蕊又有雄蕊,大多黨參花冠裂開初期,雄蕊緊貼柱頭,但花藥也伴隨裂開,花粉被釋放至柱頭上。開花動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果表明,花萼從有小裂縫至完全裂開需經(jīng)歷6～8 h,花冠裂開后4～8 h雄蕊開始偏離柱頭,隨后貼合花冠內(nèi)部并干枯,柱頭多在花冠裂開后24 h左右開始裂開,其單花壽命2～3 d。

2.2 花粉活力

通過觀察黨參花的開花動(dòng)態(tài),根據(jù)花粉呈現(xiàn),柱頭裂開及花萼、花冠展開狀態(tài),可將不同形態(tài)的黨參花分為以下8個(gè)等級:1級為蕾期,花萼將花冠完全包裹,未見花冠但柱頭尚未裂開;2級為花苞鼓起,花萼裂開,但未翹起;3級為花萼全部翹起,但花冠還未裂開;4級為花冠裂開,雄蕊還未偏離柱頭;5級為雄蕊偏離柱頭,但柱頭尚未裂開;6級為柱頭裂開;7級為花冠邊緣枯萎;8級為花冠完全枯萎。因黨參花具有花粉二次呈現(xiàn)的特性,4級后的花朵在柱頭上取其花粉進(jìn)行測定。

將8個(gè)不同等級花朵分別用TTC測定其花粉活力,結(jié)果顯示,在蕾期花萼未開裂時(shí)花粉就已具有活力,為26.28%;花粉粒在花藥中不斷成熟,花粉粒總數(shù)及活率均呈直線上升趨勢,且2級較1級弱活力花粉率極顯著增加(p<0.01)。直到花冠裂開時(shí),花粉?？倲?shù)、強(qiáng)活力花粉粒數(shù)及花粉活力達(dá)最大(p<0.05),因4級花朵的花藥已裂開,且花藥裂開時(shí)緊貼柱頭,因此大部分的花粉散落在柱頭上。在雄蕊偏離柱頭后(5級～8級)花粉粒總數(shù)及強(qiáng)花粉粒數(shù)呈逐漸下降趨勢,尤其當(dāng)花冠完全枯萎時(shí),花藥已完全干枯,且柱頭外壁的花粉幾乎灑落,視野內(nèi)可以看到的花粉粒數(shù)極顯著降低(p<0.01),花粉活力率和弱活力花粉率極顯著下降(p<0.01),強(qiáng)活力花粉率在花藥裂開后極顯著降低(p<0.01)。以上結(jié)果顯示,在黨參花朵整個(gè)發(fā)育過程中,花粉?？倲?shù)、花粉活力及強(qiáng)花粉活力呈先升后降的趨勢,均在4級達(dá)到最大值,是有性雜交最佳花粉采集花朵。

2.3 柱頭可受性

觀察發(fā)現(xiàn),在花蕾期,花萼未翹起時(shí),柱頭周圍無氣泡產(chǎn)生,所以不具備可受性;等級3花朵的柱頭周圍部分有少量氣泡產(chǎn)生,部分無氣泡,因此當(dāng)花萼翹起時(shí),部分花柱頭外壁開始具有可受性;花萼展開,柱頭未開裂時(shí),柱頭外壁周圍氣泡明顯增多,生泡速度加快,說明可受性明顯增強(qiáng);當(dāng)柱頭開裂時(shí),柱頭內(nèi)外壁都有大量氣泡產(chǎn)生,而且內(nèi)壁比外壁產(chǎn)生氣泡更多,生泡速度更快,柱頭可受性更強(qiáng);黨參花朵要枯萎時(shí)柱頭外壁無氣泡產(chǎn)生,內(nèi)壁氣泡較6級有所減少。測定結(jié)果表明,黨參花朵自整個(gè)發(fā)育過程中,花萼與花冠未分離時(shí)柱頭不具可受性,當(dāng)花萼、花冠展開,柱頭尚未裂開時(shí),柱頭外壁具有可受性但可受性不強(qiáng),當(dāng)柱頭裂開后,柱頭內(nèi)壁可受性最強(qiáng)。

綜上所述,黨參花朵在整個(gè)發(fā)育過程中,花朵的花粉均具有活力,在花冠開裂前,部分花朵柱頭已具有可受性,表示黨參存在自交結(jié)實(shí)。但花粉活力最強(qiáng)是花藥和柱頭尚未分離時(shí),柱頭可受性最強(qiáng)是在柱頭開裂時(shí),說明同一朵黨參花雌雄蕊的強(qiáng)活力出現(xiàn)時(shí)間錯(cuò)位,以減少自花授粉的幾率。

2.4 授粉特性研究

由表5可知,在各授粉處理中不去雄套袋的結(jié)實(shí)率為9.00%,去雄不套袋的結(jié)實(shí)率為40.00%,去雄套網(wǎng)袋的結(jié)實(shí)率為10.00%,證明黨參主要是異花授粉,也可自花授粉,但自交結(jié)實(shí)率遠(yuǎn)低于異花授粉的結(jié)實(shí)率,因此,黨參以異花授粉為主,但存在自交親和性;在異花授粉的過程中,昆蟲是主要的傳粉媒介,但風(fēng)也是授粉的媒介之一。去雄套紙袋的結(jié)實(shí)率為0,則表明黨參不存在融合生殖的現(xiàn)象。同株異花外壁授粉結(jié)實(shí)率為10.00%,異株異花外壁授粉結(jié)實(shí)率為15.00%,同株異花內(nèi)壁授粉為20.00%,異株異花內(nèi)壁授粉為25.00%,證明黨參柱頭內(nèi)外壁皆可授粉,但外壁授粉后結(jié)實(shí)的成功率低于內(nèi)壁授粉,且異株授粉的結(jié)實(shí)率高于同株授粉。綜上所述,黨參存在自交結(jié)實(shí),但以異花傳粉為主,在傳粉的過程中,傳粉媒介有風(fēng)媒、蟲媒,但昆蟲是主要的傳粉媒介。

表5 黨參田間結(jié)實(shí)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 5 Statistical results of the field fruit of Codonopsis pilosula

2.5 傳粉媒介觀察

通過田間觀察發(fā)現(xiàn),蜜蜂和蒼蠅為主的昆蟲經(jīng)常出沒在田間,且蜂蜜出沒時(shí)可在田間聽到清晰的嗡嗡聲,因此,通過聲音和數(shù)量可判定每天11:00—15:00時(shí)訪花的蜜蜂較多,蜜蜂訪花的原因可能與黨參花冠中花盤上的蜜腺點(diǎn)有關(guān);大部分蜂蜜在花冠中都呈頭在柱頭下的姿勢,或是卷曲在柱頭下,采蜜的過程中在蜜蜂胸腹、足等位置粘有花粉。因此結(jié)合授粉套袋實(shí)驗(yàn)更加說明,黨參傳粉媒介主要以昆蟲傳粉為主,但也不能排除風(fēng)媒。

3 討 論

3.1 黨參花粉二次呈現(xiàn)特性

植物的花朵在傳粉過程中為了提高花粉散在柱頭上增強(qiáng)授粉的幾率,通常通過調(diào)整花粉的呈現(xiàn)形式來降低或減少花粉在傳遞過程中的損耗[12]。花粉二次呈現(xiàn)是指花粉從花藥中散出后被釋放到另一個(gè)花器官表面,再從此部位呈獻(xiàn)給傳粉者的特征[13]。菊科、豆科、天南星科、半邊蓮科、遠(yuǎn)志科等都具有此類特征,但不同科屬植物次級花粉的呈現(xiàn)形式不同,且Leins P,Erbar C[14]對其次級花粉呈現(xiàn)的類型進(jìn)行了詳細(xì)的研究;張建等[15]研究了東北蒲公英次級花粉的呈現(xiàn)方式,是柱頭在延長的過程中隨著柱頭下表面具刺狀的突起將花粉從聚合花藥中帶出。除植物自身特性外,動(dòng)物也是參與傳粉推動(dòng)植物花部特征進(jìn)化的重要驅(qū)動(dòng)力[16]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,黨參在花冠展開的同時(shí)也伴隨著花藥的裂開,但由于花藥緊貼柱頭,因此花藥中釋放出來的花粉大多集中于柱頭上,當(dāng)雄蕊開始偏離柱頭時(shí),雄蕊開始枯萎?；ǚ坩尫旁谥^上時(shí)的花粉活力最強(qiáng),此時(shí)柱頭已具有可受性,但是較弱,當(dāng)柱頭裂開時(shí)柱頭內(nèi)壁可受性最強(qiáng),但此時(shí)的花粉活力相對減弱,結(jié)合授粉試驗(yàn)可知,不去雄套紙袋時(shí)黨參的結(jié)實(shí)率為9.00%,結(jié)實(shí)率在各項(xiàng)處理中最低,這與黨參柱頭強(qiáng)可受性及花粉強(qiáng)活力最佳時(shí)間不相交有關(guān)。因花粉二次呈現(xiàn)在柱頭上,增加了花粉傳播的途徑,異花授粉的結(jié)實(shí)率為40.00%,風(fēng)媒傳粉的結(jié)實(shí)率為10.00%,由此可知昆蟲是主要的傳粉媒介。結(jié)合大田觀察可知,蜜蜂是主要的傳粉昆蟲,因黨參花盤的五個(gè)角都具有分泌花蜜的蜜腺點(diǎn),當(dāng)蜜蜂在采集花蜜的同時(shí)會(huì)通過柱頭帶走部分花粉。

3.2 黨參繁育系統(tǒng)為異交為主,存在自交親和性,無融合生殖

在眾多的繁育系統(tǒng)類型中,植物的有性繁殖是通過授粉受精形成種子,進(jìn)而繁育后代的繁殖方式[17]。因此植物的繁育方式在植物的性狀遺傳和變異方面具有重要的意義[18]。絕對自交、絕對異交的植物較少,大多植物是兩種混交的模式[19]。王麗[20]研究認(rèn)為,新疆黨參不能進(jìn)行自發(fā)的自花傳粉,且自交不親和。王艷芳等[21]認(rèn)為,黨參不存在風(fēng)媒傳粉,且柱頭外側(cè)不具有可受性。本研究結(jié)果顯示,黨參在花冠未展開前,柱頭已具有可受性及花粉具有活力,并且部分花藥已散落花粉粒于柱頭,再結(jié)合不去雄套紙袋結(jié)實(shí)率為9.00%均能說明黨參存在自交親和,但是根據(jù)柱頭可受性的觀察以及內(nèi)外壁授粉后的結(jié)實(shí)情況,認(rèn)為黨參柱頭外壁具備可授性,并在黨參花冠及柱頭裂開時(shí),柱頭內(nèi)外壁可受性均達(dá)到最大,此時(shí)通過傳粉媒介異花授粉結(jié)實(shí)幾率更大,與去雄不套袋結(jié)實(shí)率40%結(jié)果相一致,由此說明黨參繁育系統(tǒng)屬于兩種混交模式,授粉結(jié)實(shí)存在自交親和性,但以異交為主。本研究還揭示,黨參去雄套紙袋不結(jié)實(shí)和去雄套網(wǎng)袋結(jié)實(shí)率僅10%,既反映出黨參風(fēng)媒傳粉的可能,也反映出黨參無法孤雌生殖。