王靳琎 李雪瑩 易進(jìn)科 趙蓓玲 黃慧敏 魏 英

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院，湖北十堰 442008；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院第二臨床學(xué)院，湖北十堰 442008

硼存在于植物和飲用水中，是生物體完成生命周期必不可少的元素[1]。硼對(duì)人類和動(dòng)物的鈣離子代謝、骨骼生長(zhǎng)和維持、胰島素代謝等都具有重要作用[2]。硼攝入不足會(huì)導(dǎo)致骨骼發(fā)育和免疫功能受損以及一定程度的發(fā)育缺陷，過高濃度的硼會(huì)對(duì)胚胎的增殖分化產(chǎn)生不良影響[3]。以上均表明，只有補(bǔ)充適當(dāng)劑量的硼才有益處。硼作為非金屬元素，廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域[4]。然而，硼的過量攝入或長(zhǎng)期暴露對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生明顯損傷甚至毒性作用。高劑量的硼可引起應(yīng)激性胃腸道紊亂，腎小管腫脹和顆粒變性；抑制大鼠和肉雞免疫器官生長(zhǎng)發(fā)育[5]。目前并沒有關(guān)于硼的統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，硼的生物效應(yīng)及毒性作用機(jī)制尚未完全明確。本研究以C3H/HeN 小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，測(cè)定小鼠硼酸鈉半數(shù)致死量；記錄小鼠的臨床表現(xiàn)、體重、解剖學(xué)變化；采用HE 染色觀察內(nèi)臟組織病理學(xué)改變，以期為硼的后續(xù)研究及其在生產(chǎn)生活中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品

硼酸鈉（Borax），分析純，純度≥99.5%，購(gòu)于天津博迪化工股份有限公司。預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)稱取10 g 硼酸鈉溶于60℃的50 g 去離子水中，冷卻至37℃后進(jìn)行灌胃處理。正式實(shí)驗(yàn)按照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別稱取一定量的硼酸鈉溶于60℃的去離子水中，制備對(duì)應(yīng)濃度的實(shí)驗(yàn)試劑，冷卻至37℃灌胃處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)C3H/HeN 小鼠120 只，雌雄各半，體重18 ～20 g，購(gòu)于湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SCXK（京）2016-0011]，室內(nèi)溫度20 ～25℃，相對(duì)濕度40%～60%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用指南》進(jìn)行，本研究已獲湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn) SPF 級(jí)C3H/HeN 小鼠40 只，雌雄各半，體重18 ～20 g，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h，將硼酸鈉按照小鼠最大體積0.4 ml/10 g 體重單次灌胃給藥，觀察記錄小鼠死亡情況，根據(jù)給藥后的狀態(tài)和死亡數(shù)量，調(diào)節(jié)給藥劑量，找出各組小鼠全死亡和不死亡的劑量，并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)[6]。

1.3.2 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn) SPF 級(jí)C3H/HeN 小鼠80 只，體重18 ～20 g，隨機(jī)分成8 組，分別為對(duì)照組（蒸餾水，含硼量為0）、實(shí)驗(yàn)組[硼酸鈉7 個(gè)劑量組（2.00、2.40、2.88、3.46、4.15、4.98 和5.97 mg/g）（Bliss 法）]，每組各10 只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h，灌胃單次給予不同劑量的硼酸鈉，對(duì)照組給予等體積的蒸餾水，灌胃3 h 后自由飲水進(jìn)食。

1.3.3 觀察指標(biāo) 給藥后連續(xù)觀察14 d，記錄第1、7、14 天體重。觀察小鼠運(yùn)動(dòng)，呼吸、皮毛和分泌物。記錄中毒癥狀、嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間和死亡情況，及時(shí)解剖死亡小鼠，觀察臟器色澤、質(zhì)地和體積，臟器組織用4%多聚甲醛浸泡，石蠟包埋，切片HE 染色，顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，計(jì)算LD50和LD50的95%置信區(qū)間和回歸方程。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.00 mg/g 劑量時(shí)，小鼠出現(xiàn)不同程度的活動(dòng)減少，困倦，被毛蓬亂。劑量≥2.40 mg/g 時(shí)，小鼠出現(xiàn)畏寒，嗜睡，肌肉僵直，呼吸急促，抽搐，大小便失禁，死亡（見圖1A、B）。劑量為5.97 mg/g 時(shí)，小鼠24 h 內(nèi)全部死亡。各組存活小鼠多在3 ～4 h 開始自主進(jìn)食飲水，24 h 內(nèi)排稀軟便，48 h 后恢復(fù)正常，活動(dòng)自如。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分為2.00、2.40、2.88、3.46、4.15、4.98 和5.97 mg/g 7 個(gè)硼酸鈉實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 小鼠一般體征圖

2.2 小鼠死亡情況

5.97 mg/g 硼酸鈉處理5 min 后，小鼠出現(xiàn)死亡。2.88 ～4.98 mg/g 硼酸鈉組小鼠死亡多數(shù)發(fā)生在24 h內(nèi)。14 d 內(nèi)，2.00 和2.40 mg/g 硼酸鈉組及對(duì)照組小鼠均未出現(xiàn)死亡（表1）。硼酸鈉對(duì)雄鼠和雌鼠的LD50分別為3.794 和3.646 mg/g（表2）。

表1 給予硼酸鈉或純水的C3H/HeN小鼠的死亡數(shù)量（n）

表2 硼酸鈉對(duì)小鼠毒性效應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析

2.3 體重變化

小鼠初始體重為18 ～20 g，第1、7、14 天小鼠體重見表3。2.00 ～4.98 mg/g 硼酸鈉組和對(duì)照組之間未觀察到體重差異。5.97 mg/g 硼酸鈉組小鼠因死亡，無法與對(duì)照組進(jìn)行比較。說明一次口服硼酸鈉對(duì)小鼠的生長(zhǎng)無明顯影響。

表3 給予不同劑量硼酸鈉和對(duì)照組小鼠的平均體重（g，± s）

表3 給予不同劑量硼酸鈉和對(duì)照組小鼠的平均體重（g，± s）

注 “-”表示無數(shù)據(jù)

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2.4 硼酸鈉急性暴露對(duì)特定器官重量的影響

對(duì)死亡小鼠及時(shí)解剖，肉眼見胃腸臌脹，腸管透明（圖2），心、肝、脾等器官體積、顏色、質(zhì)地未發(fā)現(xiàn)明顯變化。14 d 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，小鼠稱重后行脊椎脫臼處死，解剖取各臟器。計(jì)算臟器指數(shù)：臟器指數(shù)=臟器（g）/體重（g）×100%。各器官指數(shù)無顯著變化，見表4。

表4 硼酸鈉急性暴露對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響（± s）

表4 硼酸鈉急性暴露對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響（± s）

注 “-”表示無數(shù)據(jù)

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圖2 小鼠解剖情況

2.5 組織病理學(xué)結(jié)果

硼酸鈉4.98 mg/g 組小鼠肝細(xì)胞水腫，肝臟中央靜脈擴(kuò)張淤血；肺泡上皮結(jié)構(gòu)正常，肺泡隔毛細(xì)血管擴(kuò)張淤血、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔中有少量紅細(xì)胞漏出；腎小球和腎小管間質(zhì)出現(xiàn)淤血；腦組織、心臟、脾臟未見異常。見圖3。

圖3 鏡檢組織病理觀察（HE 染色，200×）

3 討論

硼有多種功效，從抗炎抗氧化到調(diào)節(jié)身體各系統(tǒng)[7-8]。硼酸鈉作為飲食和藥物補(bǔ)充劑廣泛用于不同場(chǎng)合，研究表明，飲食中適當(dāng)添加硼酸鈉可降低肺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)[9-11]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，硼對(duì)肝癌有防治作用[12]。然而，高硼狀態(tài)對(duì)人和不同動(dòng)物有細(xì)胞毒性。為確定硼酸鈉的安全范圍，本研究以C3H/HeN 小鼠為研究對(duì)象，明確了硼酸鈉經(jīng)口一次給藥雄性小鼠LD50為3.794 mg/g，雌性小鼠LD50為3.646 mg/g。

據(jù)報(bào)道，給予硼酸鈉后，大鼠出現(xiàn)抑郁、共濟(jì)失調(diào)、抽搐甚至死亡，雄性和雌性大鼠硼酸鈉LD50分別為4.50 和4.98 mg/g[13]。世界衛(wèi)生組織有關(guān)化學(xué)品急性毒性分級(jí)原則（The WHO Remended Classification of Pesticides by Hazard and Guidelines to Classification 1990-1991），規(guī)定的LD50顯示，極高毒性：＜0.005 mg/g；高毒危險(xiǎn)：0.005 ～0.05 mg/g；中毒危險(xiǎn)：0.05 ～0.50 mg/g；輕度危險(xiǎn)：＞0.5 mg/g。本研究中，雄性和雌性小鼠硼酸鈉的LD50分別為3.794 和3.646 mg/g，可推斷硼酸鈉屬于低毒化合物。

人急性硼中毒時(shí)，表現(xiàn)出皮炎、腹瀉、惡心嘔吐、乏力等癥狀；慢性中毒時(shí)，出現(xiàn)食欲缺乏、體重下降、惡心等癥狀[14]。本研究中小鼠急性中毒后出現(xiàn)腹瀉等癥狀，HE 染色發(fā)現(xiàn)，肝、肺、腎出現(xiàn)不同程度的水腫，淤血這與報(bào)道大體一致。90%的硼從胃腸道內(nèi)吸收，大部分由尿排出[15]。高劑量硼會(huì)導(dǎo)致人腎小管細(xì)胞混濁腫脹、顆粒變性[16]。本研究中，給予硼酸鈉后，小鼠肝和腎均出現(xiàn)明顯病理性變化，這可能是高硼環(huán)境下，肝臟代謝解毒功能和腎臟排泌功能受損，導(dǎo)致硼大量蓄積，對(duì)肝、腎造成嚴(yán)重?fù)p傷，但具體的作用機(jī)制有待深入研究。

綜上，雄性小鼠硼酸鈉LD50為3.794 mg/g，雌性為3.646 mg/g，屬于低毒化合物；急性硼酸鈉中毒對(duì)小鼠有明顯的毒性作用，隨硼酸鈉劑量的增加，其毒性作用逐漸加重。