李雪松，孫達(dá)鋒，華 蓉，岳萬松，劉春麗，袁紹保，羅孝坤，劉紹雄**

[1.云南云菌（集團(tuán)）有限公司，云南 昆明 650221；2.陸良爨鄉(xiāng)綠圓菇業(yè)有限公司，云南 陸良 655601；3.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221]

皺木耳（Auricularia delicata）隸屬于真菌界（Kingdom Fungi）擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）木耳目（Auriculariales）木耳科（Auriculariaceae）木耳屬（Auricularia），在我國是一種傳統(tǒng)的食（藥）用菌，具有抗氧化、抗病毒、保肝解毒等功效，常用于治療各種胃腸道和肝臟疾病[1]。目前，黑木耳（Auricularia heimuer）、毛木耳（Auricularia cornea）等木耳品種已被廣泛栽培及推廣，但木耳屬其他物種的資源開發(fā)利用相對(duì)較少。與黑木耳、毛木耳相比，皺木耳耳片質(zhì)地較厚，子實(shí)層具有明顯的網(wǎng)狀褶皺，口感更加松脆爽口[2]。皺木耳的野生資源豐富，主要分布于我國的西南地區(qū)，特別是云貴地區(qū)。目前，對(duì)于皺木耳生物學(xué)特性以及生長發(fā)育調(diào)控基因相關(guān)的基礎(chǔ)研究較少，這成為了限制皺木耳栽培及推廣的因素之一。

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，與抗壞血酸氧化酶、哺乳動(dòng)物血漿銅藍(lán)蛋白、膽紅素氧化酶等同屬于藍(lán)色多銅氧化酶家族MCO（multi copper oxidase，MCO）[3]。目前，在細(xì)菌、真菌、植物及動(dòng)物中均有關(guān)于漆酶的研究報(bào)道。其中，真菌漆酶研究最多，已研究的物種包括雜色云芝（Coriolus versicolor）、糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）、變色栓菌（Trametes versicolor）、灰蓋鬼傘（Coprinopsis cinerea）等。真菌漆酶主要參與其形態(tài)建成、病原菌致病、色素合成、應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)過程，對(duì)其生長發(fā)育十分重要[4-5]。同時(shí)，由于漆酶具有廣泛的底物作用性，可作為綠色生物催化劑應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)保、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域，具有廣闊的市場(chǎng)前景[6]?，F(xiàn)有的研究表明，真菌漆酶基因一般包含多個(gè)拷貝且通常成簇排列，每一個(gè)拷貝的漆酶同源基因可能行使著某一特定的功能，而特定的功能往往與其特有的結(jié)構(gòu)直接相關(guān)[7]。因此，對(duì)皺木耳漆酶基因的結(jié)構(gòu)展開分析，將有助于了解其生物學(xué)功能及作用機(jī)制。

本研究對(duì)皺木耳的漆酶進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，分析了漆酶基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)。這些結(jié)果進(jìn)一步明確了皺木耳漆酶基因的差異及相關(guān)的功能，對(duì)闡明皺木耳的生長發(fā)育過程、漆酶的開發(fā)利用等具有重要意義。同時(shí)，通過對(duì)皺木耳生長發(fā)育過程進(jìn)行研究，也為規(guī)范栽培、優(yōu)良菌株選育等提供基礎(chǔ)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載皺木耳的基因組序列、基因注釋文件、蛋白序列文件，灰蓋鬼傘、雙色蠟?zāi)ⅲ↙accaria bicolor）、草菇（Volvariella volvacea）等的漆酶蛋白序列。皺木耳、雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）、黑木耳、變色栓菌等的漆酶參考序列從UniProt 數(shù)據(jù)庫獲取。

1.2 皺木耳漆酶序列的鑒定

首先，使用HMMER 軟件構(gòu)建漆酶的保守結(jié)構(gòu)域模型，E 值設(shè)置為e<10-10，比對(duì)皺木耳的所有蛋白序列，作為HMM 部分漆酶的結(jié)果。其次，為保證候選漆酶基因的準(zhǔn)確性和完整性，以參考漆酶序列為目標(biāo)序列，利用BLAST 軟件從皺木耳的蛋白文件中搜索漆酶，E 值設(shè)置為e<10-4，篩選出的序列為BLAST 部分漆酶的結(jié)果。然后，將HMM 和BLAST的結(jié)果合并，并將合并后的結(jié)果通過BLASTP 軟件與UniProtKB 數(shù)據(jù)庫比對(duì)，E 值小于10-10的被認(rèn)為是候選漆酶。最后，再利用Pfam 數(shù)據(jù)庫和CDD 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)這些候選蛋白的結(jié)構(gòu)域，若存在結(jié)構(gòu)域，則認(rèn)為該候選蛋白屬于漆酶；若未能檢測(cè)出結(jié)構(gòu)域，則認(rèn)為其不屬于漆酶。

1.3 皺木耳漆酶蛋白的理化性質(zhì)分析

利用ProtParam 工具預(yù)測(cè)漆酶蛋白的相關(guān)理化性質(zhì)，指標(biāo)包括氨基酸數(shù)目、分子量、理論等電點(diǎn)、蛋白質(zhì)疏水性等。漆酶蛋白的亞細(xì)胞定位分析使用PSLDoc[8]工具完成。

1.4 皺木耳漆酶基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)分析

通過皺木耳的基因組注釋文件獲取漆酶基因的結(jié)構(gòu)信息，使用Tbtools[9]構(gòu)建基因結(jié)構(gòu)圖。利用SOPMA[10]預(yù)測(cè)皺木耳漆酶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。同時(shí)，使用SWISS-MODEL 對(duì)漆酶的氨基酸序列進(jìn)行同源建模，生成蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)?；贛EME[11]工具對(duì)皺木耳漆酶蛋白的模體序列進(jìn)行分析，其中motifs 的最大數(shù)量設(shè)置為10，其他參數(shù)采用默認(rèn)值。使用Pfam 數(shù)據(jù)庫和CDD 數(shù)據(jù)庫開展結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，取2 種預(yù)測(cè)結(jié)果的并集作為最終漆酶蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)果。

1.5 皺木耳漆酶蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI 數(shù)據(jù)庫和UniProt 數(shù)據(jù)庫中下載雙孢蘑菇、黑木耳、毛木耳、灰蓋鬼傘、雙色蠟?zāi)?、射脈菌（Phlebia radiata）、糙皮側(cè)耳、鳳尾菇（Pleurotus sajorcaju）、毛栓菌（Trametes hirsuta）、變色栓菌、長絨毛栓菌（Trametes villosa）、草菇的漆酶蛋白序列。使用MUSCLE 軟件對(duì)所有的漆酶序列進(jìn)行比對(duì)，然后使用MEGA[12]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展值設(shè)置為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 皺木耳漆酶序列的鑒定結(jié)果

通過HMMER 程序構(gòu)建模型，利用該模型從皺木耳基因組中檢索到13 個(gè)蛋白序列含有2 個(gè)及以上多銅氧化酶的結(jié)構(gòu)域。通過BLAST 程序比對(duì)UniProtKB 數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)有11 個(gè)可能是皺木耳漆酶的蛋白序列。最后，合并HMMER 和BLAST 的結(jié)果，再通過篩選序列長度、3 個(gè)多銅氧化酶結(jié)構(gòu)域等特征，獲得8 個(gè)皺木耳漆酶蛋白，詳見表1。

表1 皺木耳漆酶基因信息分析Tab.1 Information of laccase gene in Auricularia delicata

如表1世紀(jì)，皺木耳的8 個(gè)漆酶基因長度為2.2～2.9 Kb，編碼蛋白的長度也較為相近，最長為619 個(gè)氨基酸，最短為550 個(gè)氨基酸；除Ad-lac3與Ad-lac4位于同一段scaffold 上外，其余的漆酶基因都位于不同的scaffold 上。

2.2 皺木耳漆酶蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果

對(duì)皺木耳漆酶蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析結(jié)果詳見表2。

表2 皺木耳漆酶基因氨基酸的理化分析Tab.2 The physico-chemical analysis of amino acid in Auricularia delicata

由表2 可知，這些基因所表達(dá)的蛋白分子量為60.40～68.33 Ku，等電點(diǎn)為4.24～7.02，大多數(shù)在堿性范圍，說明蛋白分子中富含酸性氨基酸。半衰期（酵母活體內(nèi)）是判斷蛋白在細(xì)胞內(nèi)是否穩(wěn)定的指標(biāo)之一，大于20 h 的為穩(wěn)定蛋白；預(yù)測(cè)結(jié)果表明皺木耳的漆酶蛋白均較穩(wěn)定?？偲骄H水性GRAVY（grand average of hydropathy，GRAVY）指所有氨基酸親水值的總和與氨基酸個(gè)數(shù)之間的比值，負(fù)值代表親水性，負(fù)值越大表明親水性越強(qiáng)，而正值代表疏水性，正值越大表明疏水性越強(qiáng)[13]。皺木耳漆酶蛋白序列間的GRAVY 值雖存在差異，但均為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位的分析結(jié)果表明，有6 個(gè)皺木耳的漆酶蛋白均分泌到細(xì)胞外，可能是作為分泌蛋白在細(xì)胞外分解酶；而Ad-lac1與Ad-lac8定位于細(xì)胞質(zhì)中，說明皺木耳漆酶基因的生理功能存在差異。

2.3 皺木耳漆酶基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

利用本研究中皺木耳漆酶的蛋白序列構(gòu)建8 個(gè)漆酶的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果詳見圖1。

圖1 皺木耳漆酶基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹和基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Phylogenetic tree and gene structures of Auricularia delicata laccase

由圖1 可知，皺木耳的漆酶蛋白基因均含有10個(gè)以上的CDS 編碼區(qū)域。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近的皺木耳漆酶蛋白的基因結(jié)構(gòu)是相似的，如Ad-lac4和Ad-lac5的CDS 數(shù)目和排列幾乎一致，這也從側(cè)面體現(xiàn)了漆酶基因具有一定的保守性。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是指不同氨基酸間C=O 和N-H基團(tuán)間氫鍵形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，主要為α-螺旋和β-折疊。利用SOPMA 軟件，預(yù)測(cè)皺木耳8 條漆酶基因編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果詳見表3。

表3 皺木耳漆酶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Tab.3 The secondary structure of protein sequence in Auricularia delicata

由表3 可知，8 條序列的結(jié)構(gòu)類型主要是不規(guī)則卷曲。其中，α-螺旋（Alpha helix）占8.36%～14.59%、β-轉(zhuǎn)角（Beta turn）占25.80%～29.22%、不規(guī)則卷曲（Random coil）占47.50%～56.37%，不規(guī)則卷曲所占比例遠(yuǎn)高于其他的類型。

模體（motif）是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中介于二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的結(jié)構(gòu)層次，又稱超二級(jí)結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)分子具有特定功能或作為獨(dú)立結(jié)構(gòu)域一部分的二級(jí)結(jié)構(gòu)聚合體[14]?；蛩谢蛘叽蠖鄶?shù)成員共有的motif 極可能是該家族執(zhí)行重要功能或組成結(jié)構(gòu)不可缺少的部分[15]。所以，識(shí)別基因家族共同的motif 就能刻畫該基因家族的特征，從而可以利用這些特征來發(fā)掘基因家族新成員[14]。本研究中皺木耳漆酶蛋白的基序情況詳見圖2。

圖2 皺木耳漆酶基因的模體Fig.2 Motif of the Auricularia delicata laccase genes

如圖2世紀(jì)，皺木耳的8 個(gè)漆酶蛋白均含有10個(gè)motif。其中，motif_1 中的HCHxxxH、motif_2 中的HWH、motif_4 中的HPxHLH、motif_6 中的HSH與報(bào)道的真菌漆酶的特征序列和草菇的漆酶蛋白序列具有一致性[16]。

在較大的蛋白質(zhì)分子中，由于多肽鏈上相鄰的超二級(jí)結(jié)構(gòu)緊密聯(lián)系，進(jìn)一步折疊形成1 個(gè)或多個(gè)相對(duì)獨(dú)立的致密三維實(shí)體，即結(jié)構(gòu)域（domain）[17]。一般每個(gè)結(jié)構(gòu)域由100～200 個(gè)氨基酸殘基組成，各有不同的空間構(gòu)象，并具有不同的生物學(xué)功能。根據(jù)已有的研究報(bào)道，真菌漆酶一般都含有3 個(gè)多銅離子氧化酶結(jié)構(gòu)域，排列為Cu-oxidase_3、Cu-oxidase 和Cu-oxidase_2。在多銅氧化酶的研究中發(fā)現(xiàn)了3 種光譜上不同的類型：1 型（藍(lán)色）、2型（正常）和3 型（耦合雙核），利用銅離子特有的氧化還原能力，對(duì)還原性底物進(jìn)行單電子氧化，同時(shí)傳遞4 個(gè)電子，將作為第二底物的氧氣還原成水[18]。本研究中得到的8 個(gè)皺木耳的漆酶蛋白序列的情況詳見圖3。

圖3 皺木耳漆酶基因的結(jié)構(gòu)域Fig.3 Domain of the Auricularia delicata laccase genes

如圖3世紀(jì)，皺木耳的漆酶蛋白序列也同樣有這樣的結(jié)構(gòu)域和相應(yīng)的排列順序，進(jìn)一步說明篩選出的皺木耳漆酶也應(yīng)具有相同的生物學(xué)功能。

通過Swiss-Model 對(duì)皺木耳的漆酶蛋白序列進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)同源建模，結(jié)果詳見圖4。

圖4 皺木耳漆酶蛋白三維結(jié)構(gòu)Fig.4 Protein 3D structure of Auricularia delicata laccase

如圖4世紀(jì)，8 個(gè)漆酶蛋白大部分都具有十分相似的三維結(jié)構(gòu)。每個(gè)蛋白由3 個(gè)杯狀（Cu-oxidase）結(jié)構(gòu)域（Domain 1、Domain 2、Domain 3）組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域均有1 個(gè)β 桶狀結(jié)構(gòu)。8 個(gè)皺木耳漆酶蛋白的三維結(jié)構(gòu)由多個(gè)α-螺旋和β-折疊構(gòu)成，都具有對(duì)應(yīng)的銅離子結(jié)合位點(diǎn)和催化的活性中心。

2.4 皺木耳漆酶蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

通過合并8 條皺木耳的漆酶蛋白序列和下載的69 條蛋白序列，總計(jì)77 條漆酶序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果詳見圖5。

圖5 皺木耳及其他物種漆酶蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Laccase protein sequences phylogenetic tree of Auricularia delicata and other species

如圖5世紀(jì)，77 條漆酶主要分為7 個(gè)類群，主要的大類群是木耳屬與栓菌屬（Trametes），其他的各個(gè)類群的聚類關(guān)系與其物種相對(duì)應(yīng)。本研究中篩選出的皺木耳漆酶與木耳屬的黑木耳、毛木耳的漆酶聚為一枝（枝長顏色為紅色），表明皺木耳的漆酶與木耳屬其他物種漆酶的基因之間具有較高的保守性。其中，Ad-lac3、Ad-lac7和Ad-lac8各在1 個(gè)分枝上；Ad-lac1和Ad-lac2聚為一枝；Ad-lac4、Ad-lac5和Ad-lac6聚為一枝。結(jié)合皺木耳漆酶的基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系較近的漆酶蛋白的基因結(jié)構(gòu)具有一致性。

3 結(jié)論與討論

針對(duì)皺木耳的漆酶進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明在皺木耳基因組中有8 個(gè)漆酶基因，分布在基因組的不同位置，這與目前報(bào)道的擔(dān)子菌和子囊菌中漆酶基因通常成簇排列是不一致的[19-21]。原因可能是皺木耳的基因組測(cè)序時(shí)間較早，測(cè)序組裝技術(shù)具有局限性，導(dǎo)致基因組碎片化程度較高及注釋不完全，最終使篩選結(jié)果不全面。進(jìn)一步分析了皺木耳漆酶蛋白氨基酸的定位與理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)8 個(gè)皺木耳的漆酶蛋白理化性質(zhì)總體差異較小，但Adlac1與Ad-lac8基因所表達(dá)的蛋白不是細(xì)胞外的分泌蛋白，2 個(gè)漆酶蛋白可能是在細(xì)胞內(nèi)行使功能。在皺木耳的基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果中也可以看出，皺木耳不同漆酶的基因結(jié)構(gòu)不一致。漆酶在真菌的形態(tài)建成、色素合成、應(yīng)激反應(yīng)等生長發(fā)育過程中起重要的作用，不同物種的漆酶也應(yīng)該具有一定的保守性。皺木耳的8 個(gè)漆酶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以不規(guī)則卷曲為主，這與黑木耳漆酶蛋白情況相似。同時(shí)，對(duì)皺木耳8 個(gè)漆酶模體的分析發(fā)現(xiàn)，HCHxxxH、HWH、HPxHLH、HSH 等序列的特征與草菇等的漆酶蛋白序列具有一致性；結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，多銅離子氧化酶結(jié)構(gòu)域的排列特征與毛栓菌、變色栓菌等的研究結(jié)果一致[16]。8 條漆酶蛋白序列的三維結(jié)構(gòu)特征與二級(jí)結(jié)構(gòu)、模體、結(jié)構(gòu)域的結(jié)果一致。這些特征都表明篩選出的8 個(gè)漆酶蛋白具有生物學(xué)功能，在皺木耳的生長發(fā)育中扮演著重要的角色。而系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果則說明，同一類群物種的漆酶具有較近的親緣關(guān)系，可能受相似的選擇壓力作用，具有相似的生物學(xué)功能，以便適應(yīng)相應(yīng)的生存環(huán)境。

目前皺木耳的研究仍聚集在生物學(xué)特性、馴化及栽培上，本研究中首次較全面地從皺木耳基因組中篩選出漆酶序列，對(duì)皺木耳漆酶基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了分析，闡釋了皺木耳漆酶基因的特性和各基因之間的差異。同時(shí)，了解了皺木耳漆酶不同成員之間的相互關(guān)系。而對(duì)于皺木耳的每一個(gè)漆酶的生物學(xué)功能，還需要進(jìn)行基因克隆以及表達(dá)分析來驗(yàn)證。研究結(jié)果為闡明皺木耳的生長發(fā)育過程、漆酶的開發(fā)利用等提供了理論支持和試驗(yàn)依據(jù)。