李勇，李全，喬飛，刁艷菲，黃云生，戚曉峰，安莉

215004 江蘇 蘇州，蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院 口腔科（李勇、李全、黃云生、戚曉峰）；215002 江蘇 蘇州，蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 牙體牙髓病科（喬飛、刁艷菲、安莉）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔頜面頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，該病五年生存率不足50%［1］，好發(fā)于唇、舌、牙齦等部位［2］，具有較高的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率。尋找與OSCC發(fā)生、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)的蛋白質(zhì)和基因，將有助于醫(yī)務(wù)工作者進(jìn)行疾病的預(yù)防篩查和治療。

CXC型趨化因子配體11（C-X-C-motif chemokine ligand11， CXCL 11）是趨化因子家族中的一員，機(jī)體穩(wěn)定狀態(tài)下，具有運(yùn)輸免疫細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和凋亡等功能。但在腫瘤組織中， CXCL11常與CXC趨化因子受體3（C-X-C-motif chemokine receptor 3，CXCR3）結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)各種實(shí)體瘤的生長和轉(zhuǎn)移。CXCL11在腫瘤發(fā)生的部位可與受體結(jié)合進(jìn)而刺激下游信號(hào)通路，這些信號(hào)通路參與癌細(xì)胞的致瘤性、凋亡、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移［3-5］。然而，CXCL11和CXCR3在口腔鱗癌中的表達(dá)情況和作用尚不明確。本研究通過生物信息學(xué)手段分析相關(guān)基因差異表達(dá)的情況，通過采取免疫組化染色法檢測CXCL11和CXCR3的表達(dá)情況，探討CXCL11及受體CXCR3與OSCC發(fā)生、轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性，為OSCC的治療找到新的靶點(diǎn)，為探索OSCC發(fā)生侵襲和遷移的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 隨機(jī)選取2015年1月至2022年9月間蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院就診，且病理科已確診的口腔鱗癌患者腫瘤組織石蠟標(biāo)本67例作為OSCC組。同時(shí)選取從口腔外科其他手術(shù)切取的正?？谇火つそM織28例，作為對(duì)照組。所有標(biāo)本均由患者自愿提供，并經(jīng)過蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意（倫理文件批號(hào)：JDLK-2022-166-01）。

1.1.2 主要儀器及試劑 Leica RM2016切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司），組織攤片機(jī)（金華市科迪儀器設(shè)備有限公司），烤箱（上?；厶﹥x器制造有限公司），顯微鏡（尼康儀器有限公司）；CXCL11兔抗人多克隆抗體購自江蘇親科生物研究中心有限公司， 兔抗人多克隆CXCR3抗體購于美國Abcam 公司。SP免疫組化試劑盒、DAB 試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)方法 本研究在GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中搜索關(guān)鍵詞“oral”“cancer”“tumor”相應(yīng)的數(shù)據(jù)集，下載微列陣數(shù)據(jù)GSE30784進(jìn)行分析，以正常口腔黏膜組作為對(duì)照，從而分析口腔鱗癌中差異表達(dá)的基因。同時(shí)利用Cytoscape 3.7.2 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）的富集分析，檢驗(yàn)差異表達(dá)基因在某個(gè)網(wǎng)絡(luò)中是否富集，分析上調(diào)的差異表達(dá)基因的生物學(xué)行為。

1.2.2 資料收集 所選取病例均已經(jīng)過手術(shù)治療，術(shù)前未曾接受化療、放療等其他輔助治療。通過借閱OSCC組術(shù)后病理報(bào)告及查閱患者的住院記錄，對(duì)所選取的病理標(biāo)本進(jìn)行分析。依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟2010版的原則進(jìn)行分類，并記錄患者性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等信息，同時(shí)電話隨訪所有實(shí)驗(yàn)組患者，收集其術(shù)后生存狀態(tài)。對(duì)照組則選自如外傷創(chuàng)緣修整、開窗助萌等手術(shù)過程中廢棄的正?？谇火つそM織。將以上收集到的信息進(jìn)行整理。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 對(duì)所選取的石蠟標(biāo)本做4 μm厚連續(xù)切片，切片置烤箱中以67℃烤90 min，脫蠟，水化，枸櫞酸抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，噴氣后3 min，室溫冷卻，PBS沖洗 5 min×3 次，滴加CXCL11多克隆抗體 （1∶200） 及CXCR3多克隆抗體 （1∶200） ，4℃恒溫下孵育過夜，次日滴入二抗工作液，37℃ 孵育 30 min ； 使用蒸餾水沖洗 3 min ，繼而 PBS 沖洗 3 min × 3 次； DAB 顯色，蒸餾水沖洗終止顯色反應(yīng)。蘇木精復(fù)染，蒸餾水充分沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。

1.3 免疫組化結(jié)果判定

所用切片經(jīng)過兩位專職的病理科醫(yī)師，雙盲法進(jìn)行獨(dú)立評(píng)估，互換切片后，再次進(jìn)行判斷，當(dāng)結(jié)果有異，交換意見或由上級(jí)醫(yī)師做最終判斷。隨機(jī)選取每個(gè)切片5個(gè)高倍鏡（×400）下無重疊的視野，各視野分別計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，根據(jù)染色的強(qiáng)弱及陽性細(xì)胞的占比情況，采取半定量積分法進(jìn)行分析：（1）根據(jù)染色強(qiáng)度：無著色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；（2）陽性細(xì)胞比率0～5%計(jì)0分，6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分，將染色強(qiáng)度評(píng)分與相應(yīng)的陽性細(xì)胞比率評(píng)分乘積（0～12）作為判定依據(jù)，乘積≥2計(jì)為陽性，乘積 ＜ 2計(jì)為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過χ2檢驗(yàn)分析 CXCL11和 CXCR3的表達(dá)與口腔鱗癌臨床病理特征之間的關(guān)系，對(duì)CXCL11和CXCR3在OSCC中的表達(dá)相關(guān)性分析采用Spearman 等級(jí)相關(guān)性分析，采用Kaplan-Meier對(duì)存活率進(jìn)行分析，并應(yīng)用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)計(jì)算差異，以P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)結(jié)果

在GSE30784數(shù)據(jù)集中，共167例OSCC樣本和45例正?？谇火つそM織樣本納入研究，CXCL11在OSCC組與對(duì)照組中呈現(xiàn)差異性表達(dá)，且CXCL11在OSCC 中表達(dá)上調(diào)（LogFC = 3.545，P ＜0.001），位于火山圖中紅色區(qū)域（圖1A）。進(jìn)一步通過GO富集分析，結(jié)果顯示CXCL11主要富集于細(xì)胞侵襲和細(xì)胞遷移（圖1B），說明CXCL11可能參與了OSCC的發(fā)生發(fā)展過程。

圖1 生物信息學(xué)結(jié)果分析Figure 1.Analysis of Bioinformatics Results

2.2 免疫組化結(jié)果

圖2顯示CXCL11表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，彌漫或散在分布，表現(xiàn)為棕色、棕褐色顆粒；CXCR3主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，陽性表達(dá)的細(xì)胞被染色為黃色、棕色或棕褐色。

圖2 CXCL11和CXCR3在OSCC組織和正?？谇火つそM織中的表達(dá)（SP法，×400）Figure 2.Expressions of CXCL11 and CXCR3 in OSCC （SP， ×400） and Normal Oral Mucosa Tissues （SP， ×400）

2.3 CXCL11和CXCR3在OSCC及正?？谇火つそM織中的表達(dá)

CXCL11及CXCR3在OSCC組中陽性表達(dá)率分別為 68.7%（46/67）和 74.6%（50/67），顯著高于在對(duì)照組中的檢出率32.1% （9/28）和39.3%（11/28），兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05；表1）。

表1 CXCL11和CXCR3在正常口腔黏膜和口腔鱗癌組織中的表達(dá)Table 1.Expressions of CXCL11 and CXCR3 in Normal Oral Mucosa and Oral Squamous Cell Carcinoma Tissues

2.4 OSCC組中CXCL11、CXCR3與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

OSCC組中高分化口腔鱗癌42例，中、低分化25例；男性37例，女性30例；腫瘤直徑 ＞ 4 cm 有27例，≤4 cm 有40例；患者年齡34～82歲；臨床分期：I～I(xiàn)I期48例，III～I(xiàn)V 期19例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例。表2結(jié)果顯示，CXCL11的陽性表達(dá)與OSCC的分化程度（χ2= 13.856，P ＜ 0.001）、臨床分期程度（χ2= 5.341，P = 0.021）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2= 5.028，P = 0.025）之間具有顯著相關(guān)性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CXCR3的陽性表達(dá)與 OSCC 分化程度（χ2= 6.357，P = 0.012）、臨床分期程度（χ2= 5.664，P = 0.017）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=7.015，P = 0.008）相關(guān)。然而，CXCL11 和 CXCR3與患者的年齡、性別、腫瘤直徑的大小均無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。

表2 CXCL11和CXCR3的表達(dá)與口腔鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 2.Relationship between the Expression of CXCL11 and CXCR3 and the Clinicopathological Parameters of Oral Squamous Cell Carcinoma

2.5 OSCC組織中CXCL11和CXCR3 表達(dá)的相關(guān)性

67例口腔鱗癌組織中，CXCL11陽性表達(dá)有46例，表達(dá)率為68.7%，CXCR3陽性表達(dá)50例，表達(dá)率為74.6%。Spearman相關(guān)性分析檢驗(yàn)顯示：r＝ 0.271，P = 0.026，二者的表達(dá)可能存在相關(guān)性。

2.6 CXCL11和CXCR3的表達(dá)與OSCC患者5年生存期情況

隨訪2015年1月至2017年12月期間診治的31位患者，腫瘤未發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的存活病例共13例，其中CXCL11陽性表達(dá)有7例，CXCR3陽性表達(dá)有8例；復(fù)發(fā)或死亡病例共18例，其中CXCL11陽性表達(dá)14例，CXCR3陽性表達(dá)有15例。結(jié)合免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行Kaplan-Meier 生存分析（圖 3、4），結(jié)果表明：OSCC患者較短的生存期可能與 CXCL11、CXCR3陽性表達(dá)有關(guān)（HR = 4.456，P = 0.016；HR = 3.579，P = 0.036）。

圖3 CXCL11表達(dá)與口腔鱗癌患者生存期分析Figure 3.CXCL11 Expression and Survival of Patients with OSCC

圖4 CXCR3表達(dá)與口腔鱗癌患者生存期分析Figure 4.CXCR3 Expression and Survival of Patients with OSCC

3 討 論

機(jī)體內(nèi)免疫細(xì)胞受到多種不同細(xì)胞因子的調(diào)控，CXCL11與CXCR3的結(jié)合能誘導(dǎo)這些免疫細(xì)胞迅速浸潤病變區(qū)域［6-7］。CXCL11經(jīng)靶細(xì)胞分泌后，與表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞表面的CXCR3特異性結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞靶向遷移和免疫反應(yīng)，在感染、自身免疫疾病和腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用［8］。大量研究證實(shí)二者在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，朱曉斌［9］觀察到CXCL11和CXCR3在晚期非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)升高。在一項(xiàng)關(guān)于結(jié)直腸癌的研究中，也發(fā)現(xiàn)二者與腫瘤的發(fā)生存在較強(qiáng)的相關(guān)性［10］。本實(shí)驗(yàn)通過在GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE30784微陣列數(shù)據(jù)，觀察到CXCL11在OSCC組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，與正常組織相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LogFC = 3.545，P ＜ 0.001）。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在OSCC組織中，CXCL11和CXCR3的陽性表達(dá)率分別為 68.7%（46/67）和 74.6%（50/67），與正常組織中的表達(dá)情況32.1% （9/28）和39.3%（11/28）相比，表達(dá)率明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.001）。與王伊婷［11］在小鼠動(dòng)物模型上取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。在腫瘤生長過程中，CXCL11和CXCR3可以通過招募Th細(xì)胞、MDSCs和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，參與腫瘤的構(gòu)建［12］。因此，作者認(rèn)為CXCL11、CXCR3的表達(dá)上調(diào)可能與OSCC的發(fā)生存在一定的關(guān)聯(lián)。

CXCL11與CXCR3的結(jié)合，具有促進(jìn)腫瘤血管的生成、募集腫瘤細(xì)胞進(jìn)行定植的能力，通過這樣的方式可以促進(jìn)卵巢癌［13］、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［14］、膽囊癌［15］等腫瘤的侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)對(duì)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行GO富集分析，繼而繪制GO富集散點(diǎn)圖，發(fā)現(xiàn)CXCL11富集于細(xì)胞侵襲和細(xì)胞遷移，表明CXCL11可能參與了OSCC的轉(zhuǎn)移過程。結(jié)合免疫組化結(jié)果分析CXCL11、CXCR3與OSCC臨床病理之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)與腫瘤分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間有相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05） ，而與患者年齡、性別、腫瘤直徑的大小均無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。因此，本課題組猜想 CXCL11、CXCR3的過表達(dá)可能與促腫瘤作用相關(guān)（例如促進(jìn)細(xì)胞增殖、趨化、侵襲和轉(zhuǎn)移等），并最終導(dǎo)致不良結(jié)局的出現(xiàn)。

上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤早期轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，這一過程中CXCL11和CXCR3的特異性結(jié)合起到了驅(qū)動(dòng)作用［12］。Nazari等［16］發(fā)現(xiàn)，通過對(duì) CXCL11-CXCR3軸進(jìn)行干預(yù)，可以抑制膀胱癌的血管生成，導(dǎo)致腫瘤組織發(fā)生退化。對(duì)于大腸癌的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌過表達(dá)的CXCL11，上調(diào)CXCR3，CXCL11-CXCR3的相互作用可激活PI3K/AKT通路，PI3K和AKT1磷酸化水平升高，導(dǎo)致癌組織中E-鈣粘蛋白減少、波形蛋白增多，腫瘤的遷移和侵襲得到促進(jìn)［17］。在本實(shí)驗(yàn)中，可以在OSCC組織中觀察到CXCL11和CXCR3的過表達(dá)可能存在相關(guān)性（r = 0.271，P = 0.026）。因此，本課題組推測在OSCC發(fā)生的早期，對(duì)CXCL11-CXCR3軸進(jìn)行干預(yù)，可能會(huì)對(duì)腫瘤的血管生成產(chǎn)生抑制作用，干擾腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

大量研究表明CXCL11和CXCR3的表達(dá)與癌癥患者的預(yù)后相關(guān)，如卵巢癌［18］、黑色素瘤［19］和結(jié)直腸癌［10］， CXCL11 和 CXCR3 過表達(dá)的患者預(yù)后較差，可能是由于CXCL11-CXCR3軸通過 STAT和PI3K/AKT途徑，激活了PD-L1，有助于抗腫瘤免疫逃逸作用。本研究結(jié)果顯示，在OSCC組中，CXCL11陽性患者，出現(xiàn)復(fù)發(fā)和死亡的時(shí)間短于CXCL11陰性表達(dá)的患者（HR = 4.456，P = 0.016），CXCR3陽性患者的健康生存期也同樣短于CXCR3陰性表達(dá)患者（HR = 3.579，P = 0.036），CXCL11 和CXCR3的過表達(dá)可能增加了OSCC的復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)預(yù)后產(chǎn)生不利的影響。綜上所述，OSCC的形成、侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，及不良臨床病理分型和預(yù)后，可能與CXCL11、CXCR3的過表達(dá)存在一定的關(guān)聯(lián)性。CXCL11和CXCR3作為OSCC早期檢驗(yàn)、預(yù)后判斷的標(biāo)志物具有一定的可行性。本課題組后續(xù)將增加樣本總量，并構(gòu)建OSCC細(xì)胞模型，通過分別抑制細(xì)胞系中CXCL11和CXCR3的表達(dá)，從而驗(yàn)證二者在OSCC侵襲、遷移中所起到的作用，并探索其作用機(jī)制，同時(shí)考慮增加對(duì)放化療術(shù)后患者的隨訪與研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子CXCL11與其受體CXCR3可能與OSCC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)前期采取生物信息學(xué)手段進(jìn)行備選基因的篩查，有助于高效地完成目標(biāo)基因的定位，繼而采用免疫組化的方式分析其表達(dá)情況。有望為OSCC早期發(fā)現(xiàn)、診斷、治療探尋新的診療方向，進(jìn)而降低口腔鱗癌的發(fā)病率，減輕患者家庭及整個(gè)社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，具有一定的社會(huì)效應(yīng)。綜上，CXCL11及CXCR3有望成為OSCC治療新的靶點(diǎn)，不僅能夠?yàn)樵缙贠SCC的診斷及治療提供重要的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，而且也能夠?yàn)榘邢蛑委煹难芯刻峁┬滤悸贰?/p>

作者聲明：本文全部作者對(duì)于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關(guān)規(guī)定保存，可接受核查。

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