陳壁娜　黃益穗　駱月姫

〔摘要〕 目的 建立多指標(biāo)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)綜合分析半夏天麻丸成分質(zhì)量及關(guān)鍵指標(biāo)的方法，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。方法 采用高效液相色譜一測(cè)多評(píng)（high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single-marker， HPLC-QAMS）法建立12批半夏天麻丸11種成分含量測(cè)定方法，運(yùn)用SPSS 26.0和SIMCA 14.0軟件對(duì)以上指標(biāo)進(jìn)行聚類分析（clustering analysis， CA）、主成分分析（principal component analysis， PCA）及偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriminant analysis， PLS-DA），通過對(duì)12批產(chǎn)品的分析，綜合評(píng)價(jià)半夏天麻丸質(zhì)量及標(biāo)志性成分。結(jié)果 建立的11種成分含量測(cè)定方法穩(wěn)定性較好。CA分析可將12批樣品聚為三大類，2個(gè)主成分可代表11種成分92.142%的信息量，可用2個(gè)主成分對(duì)半夏天麻丸進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。根據(jù)PLS-DA結(jié)果分析，造成其質(zhì)量差異的指標(biāo)為橙皮苷、天麻素、柚皮蕓香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和巴利森苷，可能是影響半夏天麻丸產(chǎn)品質(zhì)量的差異性標(biāo)志物。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)首次建立了半夏天麻丸多指標(biāo)成分質(zhì)控方法，該方法易操作，重復(fù)性與穩(wěn)定性良好；化學(xué)計(jì)量學(xué)手段也為半夏天麻丸質(zhì)量控制研究提供了參考依據(jù)。

〔關(guān)鍵詞〕 半夏天麻丸；多指標(biāo)成分；高效液相色譜一測(cè)多評(píng)法；相對(duì)校正因子；化學(xué)計(jì)量學(xué)；綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)

〔中圖分類號(hào)〕R284? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.016

Quality evaluation of Banxia Tianma Pill by multi-component content determination

using HPLC-QAMS and chemometrics

CHEN Bi'na， HUANG Yisui LUO Yueji

Department of Pharmacy， The First Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou，

Guangdong 510405， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To establish a method for the quality and key indexes of Banxia Tianma Pill （BXTMP） by multi-index combined with chemometrics to provide a scientific basis for its quality evaluation. Methods High performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single-marker （HPLC-QAMS） was used to establish a method for the determination of 11 components content in 12 batches of BXTMP. The quality and iconic components of 12 batches of BXTMP were determined and analyzed by SPSS 26.0 and SIMCA 14.1 software for clustering analysis （CA）， principal component analysis （PCA）， and partial least squares-discriminant analysis （PLS-DA）. Results The determination methods of 11 components were stable. The results showed that the 12-batch samples were classified into three categories by CA， two principal components could account for 92.142% of the information content of 11 components， and two principal components could be used for the comprehensive evaluation of BXTMP. According to PLS-DA， the quality differences were caused by hesperidin， gastrodin， naringin， mullein isoflavone glucoside and parishin. These components may be the differential markers affecting the quality of BXTMP. Conclusion The quality control method of multi-index components of BXTMP was established for the first time. The method is easy to operate， with good repeatability and stability. Chemometrics also provides a reference for the quality control of BXTMP.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Banxia Tianma Pill; multi-index component; high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single-marker; relative correlation factor; chemometrics; comprehensive quality evaluation

半夏天麻丸收載于《中華人民共和國藥典（2020版）》一部[1]，由黃芪、天麻、陳皮、法半夏、人參、黃柏等12味藥材配方，能健脾祛濕、化痰息風(fēng)，主要用于眩暈、頭痛、如蒙如裹、胸脘滿悶的脾虛濕盛、痰濁內(nèi)阻。現(xiàn)代研究表明，半夏天麻丸可使缺血性腦血管病患者體內(nèi)前列環(huán)素I2水平顯著升高，同時(shí)降低血栓素A2水平，使腦血流灌注指標(biāo)平均通過時(shí)間顯著縮短，顯著升高腦血容量、腦血流量[2]。目前，關(guān)于半夏天麻丸已有臨床應(yīng)用[2]、工藝處方[3]研究，未檢索到與該制劑檢驗(yàn)分析相關(guān)的文獻(xiàn)，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[1]中僅對(duì)陳皮成分橙皮苷進(jìn)行了定量控制。近年來，高效液相色譜一測(cè)多評(píng)（high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single-marker， HPLC-QAMS）法[4-5]和化學(xué)計(jì)量學(xué)[5-7]的多指標(biāo)評(píng)價(jià)[8]模式越來越多地應(yīng)用于中藥復(fù)方制劑質(zhì)控研究中。本實(shí)驗(yàn)選取半夏天麻丸君藥天麻所含主要成分天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷，臣藥黃芪所含黃酮類成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和7，2'-二羥基-3'，4'-二甲氧基異黃烷，臣藥陳皮所含主要成分柚皮蕓香苷、橙皮苷和川陳皮素為指標(biāo)性成分，同時(shí)以制劑中含量適中，色譜峰出峰時(shí)間居中，質(zhì)量穩(wěn)定的天麻素作為內(nèi)參物，采用HPLC-QAMS法對(duì)以上11種成分含量同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，并與外標(biāo)法（external standard method， ESM）結(jié)果進(jìn)行比較，同時(shí)通過化學(xué)計(jì)量學(xué)[聚類分析（clustering analysis， CA）、主成分分析（principal component analysis， PCA）及偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriminant analysis， PLS-DA）]等方法探究多指標(biāo)成分含量數(shù)據(jù)間潛在的內(nèi)在的關(guān)系，找出影響質(zhì)量差異的主要針對(duì)性成分，旨在為半夏天麻丸整體質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1? 試藥

對(duì)照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷、天麻素、橙皮苷和川陳皮素（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111920-201907、110807-202010、110721-202019、112055-202102，含量均高于95.3%）；7，2'-二羥基-3'，4'-二甲氧基異黃烷（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y31D10H107318，含量98.0%）；芒柄花素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷和柚皮蕓香苷（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號(hào)：PRF8032146、PRF9010943、PRF9061142、PRF9061143、PRF9061141、PRF9062802，含量均高于97.1%）；半夏天麻丸（太極集團(tuán)四川綿陽制藥有限公司，規(guī)格：每100丸重6 g，批號(hào)：2002001、2002002、2005003、2007004、2007005、2102001、2103002、2105003、2110008、2111009、2201001、2201002，編號(hào)依次為S1～S12）；甲酸、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

1.2? 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀（美國戴安公司）；Waters e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；液相色譜柱：Hedera ODS-2柱（江蘇漢邦科技有限公司）、Thermo BDS C₁₈柱（美國賽默飛世爾公司）和Durashell C₁₈柱（艾杰爾科技有限公司）；XSE205DU型電子分析天平[梅特勒托利多科技（中國）有限公司]。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、7，2'-二羥基-3'，4'-二甲氧基異黃烷、天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷、柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素對(duì)照品適量，用60%甲醇制成各成分質(zhì)量濃度分別為0.236、0.410、0.128、0.472、0.506、0.152、0.374、0.960、4.872、9.890、1.192 mg·mL-1的混合母液。再將此母液用60%甲醇稀釋20倍得混合對(duì)照品溶液。

2.2? 供試品溶液的制備

精密稱定半夏天麻丸細(xì)粉約1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加60%甲醇25 mL，稱重，加熱回流1 h，常溫放至室溫，60%甲醇補(bǔ)重，搖勻過濾，即得。取按其處方工藝制備的缺黃芪、缺天麻和缺陳皮的陰性供試品各適量，按“2.1”項(xiàng)方法制得供試品溶液。

2.3? 色譜條件及專屬性試驗(yàn)

色譜柱為Hedera ODS-2，柱溫30 ℃，流速1.0 mL·min-1；波長切換：254 nm（0～22 min檢測(cè)毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和7，2'-二羥基-3'，4'-二甲氧基異黃烷）[9-12]、220 nm（22～44 min檢測(cè)天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷）[13-17]和283 nm（44～75 min檢測(cè)柚皮蕓香苷、橙皮苷和川陳皮素）[18-21]；0.1%甲酸-乙腈（B）梯度洗脫（0～10 min，13.0% B；10～19 min，13.0%→17.0% B；19～44 min，17.0%→26.0% B；44～63 min，26.0%→62.0% B；63～75 min，62.0%→13.0% B），進(jìn)樣量為10 μL。理論板數(shù)按各成分色譜峰計(jì)，均高于4500。在上述色譜條件下進(jìn)樣混合對(duì)照品溶液及供試品溶液，記錄色譜圖（圖1）。圖譜顯示半夏天麻丸供試品溶液中11種成分與相鄰色譜峰分離良好（分離度均≥1.5）；陰性無干擾。

2.4? 多指標(biāo)成分測(cè)定

2.4.1? 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的繪制? 精密吸取“2.1”項(xiàng)混合母液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別用60%甲醇稀釋至20 mL，得序號(hào)為1～6的混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣檢測(cè)，以上述11個(gè)對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫軸，峰面積為縱軸建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。詳見表1。

2.4.2? 精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性考察? 取同一份半夏天麻丸（編號(hào)：S1）供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下，不間斷進(jìn)樣6次，記錄色譜峰峰面積，計(jì)算得出各成分峰面積的RSD值為0.56%～1.32%（n＝6），表明精密度良好。取半夏天麻丸（編號(hào)：S1），按“2.2”項(xiàng)方法制備6份供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下檢測(cè)，用外標(biāo)法計(jì)算11種成分的含量，得出含量的RSD值為0.96%～1.89%（n＝6），表明方法的重復(fù)性良好。取一份半夏天麻丸（編號(hào)：S1）供試品溶液，于0、2、5、9、16、24、36 h在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜峰峰面積，得出11種成分峰面積的RSD值為0.52%～1.38%（n＝7），表明配制的半夏天麻丸供試品溶液36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3? 準(zhǔn)確度考察? 精密稱取半夏天麻丸（編號(hào)：S1）細(xì)粉0.5 g，分別按相當(dāng)于各成分含量80%、100%、120%的3個(gè)水平加入混合對(duì)照品溶液（11種對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為0.137、0.206、0.065、0.241、0.269、0.084、0.191、0.572、3.612、8.095、0.796 mg·mL-1），再按“2.2”項(xiàng)制法配制供試品溶液，每個(gè)水平3份，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下檢測(cè)，結(jié)果各成分的平均加樣回收率（n＝9）及RSD分別為97.98%（1.37%）、98.59%（1.42%）、96.90%（1.47%）、100.03%（0.71%）、99.42%（1.11%）、96.87%（1.57%）、98.79%（0.99%）、99.66%（1.17%）、100.11%（0.69%）、99.65%（1.26%）和98.98%（0.84%）。

2.5? HPLC-QAMS法建立

2.5.1? 相對(duì)校正因子（f）的計(jì)算? 分別精密吸取“2.4.1”項(xiàng)6個(gè)混合對(duì)照品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下檢測(cè)，以天麻素為內(nèi)參物，按照公式f_k/s=f_k/f_s=（W_k/A_k）/（W_s/A_s）=（W_k×A_s）/（W_s×A_k）（其中f、W、A、k和s依次代表相對(duì)校正因子、質(zhì)量濃度、峰面積、其他待測(cè)成分和內(nèi)參物）分別計(jì)算其他10種成分的f。詳見表2。

2.5.2? 耐用性考察? 本試驗(yàn)考察了液相色譜儀和色譜柱的變化、柱溫的變化、流速的變化對(duì)各待測(cè)成分f的影響。結(jié)果提示，不同色譜儀（UltiMate 3000型和e2695型）和不同色譜柱（Hedera ODS-2柱、Thermo BDS C₁₈柱和Durashell C₁₈柱）時(shí)，f的耐用性良好（表3）；柱溫為25、30、35 ℃時(shí)，f的耐用性良好（表4）；流速為0.8、1.0、1.2 mL·min^-1時(shí)，f的耐用性良好（表5）。

2.5.3? 色譜峰定位? 本試驗(yàn)以天麻素為內(nèi)參物，考察其他待測(cè)成分在不同品牌HPLC儀和不同品牌色譜柱上相對(duì)保留時(shí)間的RSD波動(dòng)。結(jié)果提示，在相同的色譜條件下，不同品牌HPLC儀（UltiMate 3000型和e2695型）和不同色譜柱（Hedera ODS-2柱、Thermo BDS C₁₈柱和Durashell C₁₈柱），各待測(cè)成分的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2.0%。詳見表6。

2.6? HPLC-QAMS與ESM結(jié)果比較

取12批半夏天麻丸（S1～S12），依法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，首先運(yùn)用ESM法計(jì)算半夏天麻丸中11種成分的含量，再采用HPLC-QAMS法，運(yùn)用表2中的f值計(jì)算各組分含量（表7）。采用SPSS 26.0軟件對(duì)每個(gè)成分的2種方法所得數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果P＞0.05，表明兩種方法無顯著性差異，HPLC-QAMS法可用于半夏天麻丸中11種成分的含量測(cè)定。

2.7? CA

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表7中HPLC-QAMS法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行CA，得聚類樹狀圖（圖2）。結(jié)果表明，當(dāng)間距為10時(shí)，12批半夏天麻丸樣品聚為三大類，S7、S8和S6為一類，S2、S5、S3、S4和S1為一類，S10、S11、S9和S12為一類。

2.8? PCA

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表7中HPLC-QAMS法含量數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA（表8—9）。由PCA結(jié)果可知，前2個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為92.142%，其中主成分1占68.984%，主成分2占23.159%；由特征向量可知，第一主成分綜合了芒柄花素、7，2'-二羥基-3'，4'-二甲氧基異黃烷、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、柚皮蕓香苷、橙皮苷和川陳皮素的信息，第二主成分綜合了毛蕊異黃酮葡萄糖苷、天麻素和巴利森苷的信息。同時(shí)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SIMCA 14.1建立PCA模型（圖3），共提取出2個(gè)主成分R²X＝0.921，Q²＝0.809，均大于0.5，說明所建立的模型穩(wěn)定性較高。從圖3可以看出，S1～S5、S6～S8以及S9～S12分別呈現(xiàn)一定的關(guān)聯(lián)性。

2.9? PLS-DA

為進(jìn)一步比較12批半夏天麻丸，尋找類間差異性指標(biāo)，將表7中HPLC-QAMS法含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1統(tǒng)計(jì)軟件，運(yùn)行PLS-DA程序，得圖4。結(jié)果累積解釋能力參數(shù)R²X＝0.971、R²Y＝0.823，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q²為0.743，理論上R²Y、Q²數(shù)值越接近1，代表模型越好，通常兩者高于0.5時(shí)提示所建立的模型穩(wěn)定可靠、預(yù)測(cè)能力好。根據(jù)模型中各變量重要性投影（variable importance in projection， VIP）預(yù)測(cè)值來篩選類間差異性指標(biāo)。一般認(rèn)為在95%的置信區(qū)間內(nèi)VIP＞1.0的指標(biāo)在分類中發(fā)揮著重要作用，篩選出半夏天麻丸化學(xué)成分差異的標(biāo)志性成分5個(gè)成分（VIP>1）（圖5），即成分10（橙皮苷，VIP=1.905）、成分4（天麻素，VIP=1.274）、成分9（柚皮蕓香苷，VIP=1.270）、成分1（毛蕊異黃酮葡萄糖苷，VIP=1.155）、成分8（巴利森苷，VIP=1.052）對(duì)半夏天麻丸樣品質(zhì)量的影響較大，可能是影響半夏天麻丸產(chǎn)品質(zhì)量的主要潛在標(biāo)志物。

3 討論

3.1? 含量測(cè)定指標(biāo)的選擇

半夏天麻丸由黃芪、天麻、陳皮、法半夏、人參、黃柏等12味藥材配方，其中半夏和天麻均為治風(fēng)痰眩暈、痰厥的良藥，共為君藥；人參、黃芪、白術(shù)健脾益氣，蒼術(shù)、陳皮健脾燥濕，茯苓、澤瀉健脾滲濕，7味合用，以去痰源，共為臣藥，佐以六神曲、麥芽、黃柏。諸藥相合共奏健脾祛濕、化痰息風(fēng)之效。本實(shí)驗(yàn)依托中藥質(zhì)量標(biāo)志物原則，選取君藥天麻、臣藥黃芪和陳皮為考察對(duì)象，對(duì)它們所含成分進(jìn)行分析，確定以天麻所含主要成分天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷，黃芪所含主要有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素和7，2'-二羥基-3'，4'-二甲氧基異黃烷，陳皮所含代表性成分柚皮蕓香苷、橙皮苷和川陳皮素為指標(biāo)，采用HPLC-QAMS法兼波長切換法對(duì)以上11種成分進(jìn)行含量測(cè)定。

3.2? 供試品溶液處理方法的確定

本試驗(yàn)在制備供試品溶液時(shí)，首先考察了提取溶劑：50%甲醇、60%甲醇、甲醇和稀乙醇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)60%甲醇提取時(shí)，所測(cè)11種成分的提取率相對(duì)較高。接著以提取率為指標(biāo)，對(duì)不同提取方式（超聲提取1 h、加熱回流提取1 h）進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)回流提取時(shí)，11種成分的提取率最高，超聲提取時(shí)，雜質(zhì)較多，干擾正常檢測(cè)。進(jìn)而對(duì)提取時(shí)間0.5、1、1.5、2 h進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)提取1 h時(shí)，各成分的提取率最高，雜質(zhì)最少，隨著提取時(shí)間的延長，雜質(zhì)增加，對(duì)含量檢測(cè)造成干擾。綜合考慮，最終確定以60%甲醇回流提取1 h為半夏天麻丸供試品最佳提取方式。

3.3? 結(jié)果評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)采用兩種方法（外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法）測(cè)定半夏天麻丸中11種成分含量，通過比較，兩種方法無顯著性差異（P＞0.5）。本文驗(yàn)證了HPLC-QAMS法的可行性，也為降低檢驗(yàn)成本及制劑檢測(cè)多指標(biāo)成分提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?；瘜W(xué)計(jì)量學(xué)在對(duì)12批樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行處理時(shí)快速、全面地對(duì)樣品進(jìn)行歸類，梳理相關(guān)性與差異性，利用CA和PCA互相驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)批間關(guān)聯(lián)性和差異性。選取特征值大于1的公因子為主成分，結(jié)果前2個(gè)主成分特征值分別為7.588和2.547，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為92.142%，12批半夏天麻丸聚為三大類，第一主成分綜合了芒柄花素、7，2'-二羥基-3'，4'-二甲氧基異黃烷、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、柚皮蕓香苷、橙皮苷和川陳皮素的信息，第二主成分綜合了毛蕊異黃酮葡萄糖苷、天麻素和巴利森苷的信息。通過數(shù)據(jù)分析，以VIP＞1.0為指標(biāo)找出橙皮苷、天麻素、柚皮蕓香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和巴利森苷等成分可能是影響半夏天麻丸產(chǎn)品質(zhì)量的主要潛在標(biāo)志物，為藥企在今后生產(chǎn)該制劑時(shí)指明方向。提示生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)關(guān)注上述成分所對(duì)應(yīng)原藥材進(jìn)廠控制標(biāo)準(zhǔn)、制劑生產(chǎn)過程中各成分轉(zhuǎn)化率等數(shù)據(jù)的收集，通過不斷探索，完善原藥材內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化細(xì)化生產(chǎn)過程參數(shù)控制，有效地將產(chǎn)品質(zhì)量控制與臨床療效研究成果相結(jié)合，為臨床合理用藥提供數(shù)據(jù)支持。

本試驗(yàn)采用HPLC-QAMS法建立了半夏天麻丸11種指標(biāo)成分定量質(zhì)控模式，對(duì)市場(chǎng)流通的12批不同階段生產(chǎn)的樣品進(jìn)行檢測(cè)，又通過化學(xué)計(jì)量學(xué)識(shí)別模式對(duì)多指標(biāo)成分含量檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)影響產(chǎn)品質(zhì)量差異性的主要物質(zhì)性成分，以期最大限度地保證半夏天麻丸的質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)

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