周睿璇　彭嘉穎　向晶　焦子遠　張冠林　王萍　卓越　張泓

〔摘要〕 目的 觀察電針刺激上巨虛、天樞對潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis， UC）模型大鼠輔助性T細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）相關(guān)特異性因子及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regulatory cell， Treg）的影響，探討合募配穴理論指導(dǎo)下電針刺激大腸腑下合穴、募穴治療UC的作用機制，為特定穴的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。方法 50只SD大鼠隨機分出10只作為空白組，剩余40只UC模型造模成功的大鼠隨機分為模型組、合募配穴組、天樞組和上巨虛組，每組10只。2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid， TNBS）/乙醇法制備UC大鼠模型。合募配穴組予以電針刺激雙側(cè)天樞、上巨虛，天樞組予以電針刺激雙側(cè)天樞，上巨虛組予以電針刺激雙側(cè)上巨虛，每次20 min，每天1次，共10次。觀察大鼠一般情況，計算大鼠疾病活動指數(shù)（disease active index， DAI）；肉眼觀察大鼠結(jié)腸黏膜損傷情況，評估結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（colonic mucosa damage index， CMDI），HE染色觀察結(jié)腸形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞百分比，熒光定量PCR檢測大鼠結(jié)腸組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）、維甲酸相關(guān)孤兒受體γ t（retinoid acid related orphan receptor gamma t， RORγ t）、白細(xì)胞介素-17A（interleukin-17A， IL-17A）mRNA相對表達量。結(jié)果 （1）與空白組比較，模型組一般情況不佳，腸黏膜壞死，有明顯潰瘍面，炎性浸潤嚴(yán)重，DAI及CMDI評分顯著升高（P<0.05），Treg細(xì)胞百分比及TGF-β mRNA相對表達量顯著降低（P<0.05），RORγ t、IL-17A mRNA相對表達量顯著升高（P<0.05）；（2）與模型組比較，合募配穴組、天樞組及上巨虛組一般情況明顯好轉(zhuǎn)，炎性浸潤和結(jié)腸黏膜壞死情況明顯減輕，DAI及CDMI評分顯著降低（P<0.05），Treg細(xì)胞百分比及TGF-β mRNA相對表達量顯著升高（P<0.05），RORγ t、IL-17A mRNA相對表達量顯著降低（P<0.05）；（3）與天樞組和上巨虛組比較，合募配穴組Treg細(xì)胞百分比顯著升高（P<0.05），RORγ t mRNA相對表達量顯著降低（P<0.05）。結(jié)論 電針刺激大腸合募穴上巨虛、天樞對UC有良好的治療作用，合募配穴療效優(yōu)于單穴療效，其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，降低炎性細(xì)胞因子表達，以調(diào)控腸黏膜免疫失衡狀態(tài)，恢復(fù)腸黏膜免疫穩(wěn)態(tài)，減輕炎癥反應(yīng)。

〔關(guān)鍵詞〕 潰瘍性結(jié)腸炎；電針；輔助性T細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡；合募配穴；維甲酸相關(guān)孤兒受體γ t；免疫平衡

〔中圖分類號〕R245.9? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.017

Effects of electroacupuncture at 'Shangjuxu' （ST37） and 'Tianshu' （ST25） on Th17-related specificity factors and Treg cells in rats with ulcerative colitis

ZHOU Ruixuan PENG Jiaying XIANG Jing JIAO Ziyuan ZHANG Guanlin WANG Ping ZHUO Yue ZHANG Hong

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Changde Wuling District

Center for Dlsease Control and Prevention， Changde， Hunan 415000， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of electroacupuncture （EA） at 'Shangjuxu' （ST37） and 'Tianshu' （ST25）， the lower He-sea point and front-Mu point of the large intestine respectively， on T helper cell 17 （Th17）-related specificity factors and T regulatory （Treg） cells in rats with ulcerative colitis （UC）， and to explore the mechanism of EA at these two points in treating UC under the guidance of the theory of "He and Mu point combination"， so as to provide experimental evidence for the clinical application of the specific points. Methods A total of 10 out of 50 SD rats were randomly selected as blank group， and the remaining 40， after being successfully used to establish UC models， were randomly subdivided into model group， "He and Mu point combination" group， 'Tianshu' （ST25） group and 'Shangjuxu' （ST37） group， with 10 rats in each group. The UC rat model was established by enema of 2-4-6 trinitrobenzene sulfonic acid （100 mg/kg） + 50% ethanol （0.25 mL）. EA （10 Hz/50 Hz） was respectively performed at bilateral 'Shangjuxu' （ST37） and 'Tianshu' （ST25） of the rats in "He and Mu point combination" group， bilateral 'Shangjuxu' （ST37） in 'Shangjuxu' （ST37） group and bilateral 'Tianshu' （ST25） in 'Tianshu' （ST25） group for 20 min， once a day， for a total of 10 times. The general condition of the rats was recorded to calculate the score of disease activity index （DAI， 0-4 points）. Colonic tissue was sampled for colonic mucosal damage index （CMDI） scoring by naked eyes， and histopathological changes were observed by HE staining. Flow cytometry was used to determine the percentage of Treg cells in rat spleen CD4+T cells. The relative quantity of transforming growth factor-β （TGF-β）， retinoid acid related orphan receptor gammat （RORγ t） and interleukin-17A （IL-17A） mRNA in colonic tissue was examined by quantitative real-time PCR. Results Compared with blank group， with poor general condition， intestinal mucosal necrosis， obvious ulcers and severe inflammatory infiltration， the scores of DAI and CMDI in model group significantly increased （P<0.05）， so did the relative quantity of RORγ t and IL-17A mRNA （P<0.05）， while the percentage of Treg cells， and the relative quantity of TGF-β mRNA significantly decreased （P<0.05）; compared with model group， with the better general condition and obviously alleviated inflammatory infiltration and intestinal mucosal necrosis， the scores of DAI and CDMI in "He and Mu point combination" group， 'Tianshu' （ST25） group and 'Shangjuxu' （ST37） group significantly dropped （P<0.05）， so did the relative quantity of RORγ t and IL-17A mRNA （P<0.05）， while the percentage of Treg cells and the relative quantity of TGF-β mRNA significantly elevated （P<0.05）; in contrast with 'Tianshu' （ST25） group and 'Shangjuxu' （ST37） group， the percentage of Treg cells in "He and Mu point combination" group significantly went up （P<0.05）， while the relative quantity of RORγ t mRNA significantly went down （P<0.05）. Conclusion EA at 'Shangjuxu' （ST37） and 'Tianshu' （ST25） under the guidance of "He and Mu point combination" theory has good therapeutic effects on UC rats. The efficacy of He and Mu point combination is better than that of single acupoint selection， and its mechanism of action may be regulating Th17/Treg balance and reducing the expression of inflammatory cytokines， so as to regulate intestinal mucosal immune imbalance， restore intestinal mucosal immune homeostasis and relieve inflammatory response.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 ulcerative colitis; electroacupuncture; T helper cell 17/T regulatory cell balance; He and Mu point combination; retinoid acid related orphan receptor γ t; immune balance

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis， UC）是慢性非特異性腸道炎癥性疾病，以腹痛、黏液血便、大便形狀/質(zhì)地改變?yōu)槌Ｒ娕R床癥狀表現(xiàn)[1]。研究表明，UC在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率逐年上升，且UC病情易反復(fù)、病程長、癌變風(fēng)險高，已成為世界公認(rèn)的難治性疾病[2-3]。

UC發(fā)病機制尚未明確，在諸多發(fā)病因素中免疫因素至關(guān)重要，有研究表明，腸黏膜免疫失衡是導(dǎo)致UC發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程的直接原因[4]，輔助性T細(xì)胞17（T helper cell 17， Th17）/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regulatory cell， Treg）平衡失調(diào)被認(rèn)為是導(dǎo)致腸黏膜免疫失衡的主要原因[5]。已有研究表明，針灸治療UC療效明確，可通過多個靶點保護腸黏膜，抑制其炎癥反應(yīng)[6-7]。下合穴與募穴是中醫(yī)經(jīng)典中針灸治療相應(yīng)臟腑病變的特定選穴，臨床上采用合募配穴治療相應(yīng)臟腑病療效顯著[8-10]，但是對于治療UC這一典型大腸腑病的確切治病機制和配伍規(guī)律的佐證還有待深入的實驗研究。前期有研究表明，電針刺激上巨虛、天樞能明顯改善UC模型大鼠臨床癥狀及炎癥反應(yīng)[11-13]。同時，有多項研究證明，針灸能調(diào)節(jié)UC模型大鼠Th17/Treg平衡[14-15]。本研究利用2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid， TNBS）/乙醇法制備UC大鼠模型，選擇大腸腑下合穴上巨虛和募穴天樞，觀察電針刺激上巨虛、天樞對UC模型大鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中Treg百分比、結(jié)腸組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）、維甲酸相關(guān)孤兒受體γ t（retinoid acid related orphan receptor gamma t， RORγ t）和白細(xì)胞介素-17A（interleukin-17A， IL-17A）mRNA表達的影響，探討合募配穴理論指導(dǎo)下電針刺激大腸腑下合穴、募穴治療UC的作用機制，為特定穴的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1? 實驗動物

50只SPF級健康SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20） g。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（湘）2019-0009。飼養(yǎng)溫度24～26 ℃，相對濕度50%～70%。動物實驗倫理編號：LL2022022305，實驗中對動物的所有處置均嚴(yán)格遵循2006年中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》[16]。

1.2? 主要試劑及藥品

5% TNBS（美國Sigma公司，批號：SLCM5598）；乙醇（上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20210723）；戊巴比妥鈉（德國Merck KGaA公司，編號：P3761，批號：2203161）；蒸餾水（常德比克曼生物科技有限公司，批號：B-ZLS500）；無菌去離子水（北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號：0516A22）；Stain Buffer（美國BD公司，批號：2063415）；FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2，HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper），ChanQ Universal SYBR qPCR Master Mix（均為南京諾唯贊生物科技股份有限公司，貨號依次為：RC112-01，R233-01，Q711-02）；大鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液試劑盒（天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，貨號：LTS1083PK）；Fitc anti-rat CD4，APC anti-rat CD25，PE anti-mouse/rat/human FOXP3，True-NuclearTM Transcription Factor Buffer Set（均來自美國 Biolegend公司，批號依次為：B336282，B350930，B346122，B360640）。

1.3? 主要儀器

實時熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司，型號：Light Cycler480Ⅱ）；基因擴增儀（德國耶拿公司，型號：Biometra TAdvanced 96 SG）；分析流式細(xì)胞儀（美國BD公司，型號：BD LSRFortessa SORP）；高速冷凍離心機（美國Theromo公司，型號：Sorvall ST 16R）；臺式高速離心機（湖南湘立科學(xué)儀器有限公司，型號：CenLee 20K）；電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品廠，型號：SDZ-V）；環(huán)球牌一次性使用無菌平柄針灸針（蘇州針灸用品有限公司，規(guī)格：0.25 mm×25 mm）。

2 方法

2.1? 造模方法

采用改良后TNBS/乙醇法建立潰瘍性結(jié)腸炎SD大鼠模型[11，17-18]。所有造模大鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d后，造模前24 h禁食不禁水，稱重，腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg），完全麻醉后，取直徑2 mm的12 cm長聚乙丙烯管，剪開數(shù)處側(cè)孔，從肛門輕柔緩慢插入8 cm至結(jié)腸部位，快速注入TNBS（100 mg/kg）+50%乙醇0.25 mL造模液，再注入約0.4 mL的空氣，以保證造模液全部灌注腸腔，緊捏肛門，提取大鼠尾巴使其頭部朝下、尾部朝上3 min，加深造模液對腸壁浸潤，并防止藥液溢出，待大鼠清醒后正常喂養(yǎng)。觀察記錄大鼠經(jīng)過造模后的行為學(xué)改變（包括懶動、厭食、便稀或軟、大便次數(shù)增加、大便帶黏液），有一項記1分，無則記0分，累計總分，2分及以上即提示造模成功[19]。

2.2? 分組方法

根據(jù)前期預(yù)實驗數(shù)據(jù)，14 d內(nèi)模型大鼠死亡率約為20%（n=10），50只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后按隨機數(shù)字表法隨機抽取10只為空白組，剩余40只UC模型造模成功后二次隨機分為模型組、合募配穴組、天樞組和上巨虛組，每組10只。空白組給予與造模組等量生理鹽水灌腸。

2.3? 干預(yù)方法

穴位定位參照“十三五”國家規(guī)劃統(tǒng)編教材《實驗針灸學(xué)》[20]大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜和華興邦等制定的《大鼠穴位圖譜的研制》[21]。造模成功24 h后，將大鼠置于特制鼠板上，仰臥位固定。合募配穴組予雙側(cè)天樞3 mm直刺，上巨虛5 mm直刺、天樞組予雙側(cè)天樞3 mm直刺，上巨虛組予雙側(cè)上巨虛5 mm直刺。針刺后接電針治療儀，合募配穴組同側(cè)穴位接同對電極，天樞組與上巨虛組雙側(cè)穴接同對電極，電針時間為20 min，每天1次，共10次。電針參數(shù)為疏密波（疏波10 Hz/密波50 Hz），強度定于該治療儀“1”檔左右，電源電壓9 V，以大鼠肢體末端輕微抖動為宜。模型組行同種固定方式固定20 min，每天1次，共10次。空白組不干預(yù)。

2.4? 一般情況觀察

觀察各組大鼠一般情況：精神、毛色光澤變化情況、體質(zhì)量、大便性狀及便血情況，以及飲水、攝食、行動等行為學(xué)改變情況。

采用DAI評分量表[22]評估大鼠疾病活動指數(shù)（disease active index， DAI）：DAI=（體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血情況分?jǐn)?shù)）/3。具體評分細(xì)則為：體質(zhì)量下降率為0，大便正常，無便血，積0分；體質(zhì)量下降率大于0小于等于5%，積1分；體質(zhì)量下降率大于5%小于等于10%，大便松散，大便隱血陽性，積2分；體質(zhì)量下降率大于10%小于等于15%，積3分；體質(zhì)量下降率大于15%，大便呈稀便，大便顯性出血，積5分。

2.5? 肉眼結(jié)合HE染色觀察結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化

治療結(jié)束后，腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg），大鼠完全麻醉后，沿腹正中線打開大鼠腹腔，剖取遠端結(jié)腸部分約8 cm，縱向剪開后用預(yù)冷生理鹽水沖洗，先行結(jié)腸形態(tài)損傷指數(shù)（colonic mucosa damage index， CMDI）評分[23]（具體評分細(xì)則見表1），再從腸近端至遠端取兩份100 mg結(jié)腸組織。一份迅速置于-80 ℃低溫冰箱保存，以備檢測結(jié)腸組織相關(guān)蛋白表達用；另一份于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，行結(jié)腸組織HE染色，鏡下觀察HE染色結(jié)果。

2.6? 流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞百分比

每組隨機抽取5只大鼠，剖取200 mg脾臟，依照大鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液試劑盒指示，于70 μm篩網(wǎng)上輔以勻漿液剪碎研磨脾臟，收集細(xì)胞懸液，經(jīng)500 g離心10 min，棄上清；用樣本稀釋液重懸，調(diào)整濃度為2×108/mL，取15 mL離心管，加入4 mL淋巴分離液，將稀釋后懸液加于分離液液面上，500 g離心20 min；離心后吸取淋巴細(xì)胞層細(xì)胞，加入10 mL清洗液，重懸混勻，250 g離心棄上清液；加入5 mL清洗液，重懸混勻，250 g離心棄上清液；重復(fù)上一步驟再次洗滌，最后加入0.5 mL PBS，重懸混勻為單個核細(xì)胞懸液，行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

2.7? RT-qPCR檢測大鼠結(jié)腸組織中TGF-β、RORγ t、IL-17A mRNA含量

每組隨機抽取5只大鼠，取20 mg結(jié)腸組織，根據(jù)FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2試劑盒柱式提取總RNA，根據(jù)HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，作為擴增模板，擴增條件如下。預(yù)變性：95 °C 30 s；循環(huán)反應(yīng)：95 °C 10 s，60 °C 30 s，循環(huán)40次；熔解曲線：95 °C 15 s，60 °C 60 s，95 °C 15 s。根據(jù)2-△△Ct法計算目標(biāo)mRNA的相對表達量，引物序列詳見表2。

2.8? 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0軟件進行處理。計量資料均以“ｘ±s”表示。若各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，采用單因素方差分析，組間進一步比較用LSD法；不符合正態(tài)分布或方差不齊者則采用非參數(shù)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 各組大鼠一般情況觀察

干預(yù)過程中，除空白組外，其余組別均有大鼠死亡，包括模型組2只、合募配穴組1只、天樞組2只、上巨虛組2只。死亡時間主要集中在造模后5 d內(nèi)，所有死亡大鼠均在死亡前幾天有腹脹、不排大便以及食欲不佳表現(xiàn)。經(jīng)解剖死亡大鼠后發(fā)現(xiàn)，死亡大鼠均有大便堆集在結(jié)腸潰瘍上段，同時，死亡大鼠均出現(xiàn)不同程度的結(jié)腸穿孔。

空白組一般情況良好，二便無明顯異常。其余大鼠造模24 h后觀察出現(xiàn)肉眼便血、稀便、精神萎靡、食量驟減，前3天體質(zhì)量逐天降低，多于第4、5天開始緩慢恢復(fù)食欲及體質(zhì)量。模型組大鼠還可見毛色無澤、肛周不潔，甚者出現(xiàn)黏液膿血樣便或水樣便。合募配穴組、天樞組及上巨虛組在治療后上述情況均明顯改善，且合募配穴組大鼠的腹瀉明顯改善和大便性狀恢復(fù)時間基本早于天樞組與上巨虛組1～2 d。

3.2? 各組大鼠DAI評分比較

與空白組比較，模型組評分顯著上升（P<0.05）；與模型組比較，合募配穴組、天樞組與上巨虛組評分顯著下降（P<0.05）。詳見表3。

3.3? 各組CDMI評分及大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)比較

與空白組比較，模型組評分顯著上升（P<0.05）；與模型組比較，合募配穴組、天樞組和上巨虛組評分均顯著下降（P<0.05）。詳見表4。

肉眼觀察各組大鼠結(jié)腸發(fā)現(xiàn)：空白組結(jié)腸組織表面光滑完整，呈淺淡粉白色，未見腸壁增厚，結(jié)腸內(nèi)部未見水腫、充血、潰瘍等病理表現(xiàn)；模型組結(jié)腸組織可見部分腸壁增厚，部分腸段質(zhì)地變硬，內(nèi)部可見局部紅腫充血、潰瘍面深淺不一，甚者在剖取時與臟器粘連；合募配穴組、天樞組和上巨虛組結(jié)腸黏膜潰瘍、充血、水腫明顯好轉(zhuǎn)。光鏡下觀察，空白組大鼠結(jié)腸黏膜完整，隱窩規(guī)則排列，未觀察到明顯炎性浸潤；模型組大鼠結(jié)腸組織隱窩結(jié)構(gòu)改變，出現(xiàn)明顯炎性異常浸潤，可見明顯隱窩炎；合募配穴組、天樞組與上巨虛組大鼠結(jié)腸組織均可見少量基底部漿細(xì)胞增多、少量杯狀細(xì)胞黏液分泌減少，隱窩結(jié)構(gòu)較模型組規(guī)則，炎性浸潤好轉(zhuǎn)。詳見圖1。

3.4? 大鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞百分比比較

與空白組比較，模型組Treg細(xì)胞百分比顯著下降（P<0.05）；與模型組比較，合募配穴組、天樞組和上巨虛組的Treg細(xì)胞百分比顯著上升（P<0.05）；與天樞組和上巨虛組比較，合募配穴組的Treg細(xì)胞百分比顯著上升（P<0.05）。詳見圖2、表5。

3.5? 各組大鼠結(jié)腸組織TGF-β、RORγ t、IL-17A mRNA表達的比較

與空白組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織中TGF-β表達顯著下降（P<0.05），RORγ t及IL-17A表達顯著上升（P<0.05）；與模型組相比，合募配穴組、天樞組及上巨虛組大鼠的結(jié)腸組織中TGF-β表達均顯著上升（P<0.05），RORγ t及IL-17A表達均顯著下降（P<0.05）；與天樞組及上巨虛組相比，合募配穴組大鼠的結(jié)腸組織中RORγ t表達顯著下降（P<0.05）。詳見表6。

4 討論

UC發(fā)病機制尚未完全明確，現(xiàn)有研究認(rèn)為UC發(fā)病機制主要包括黏膜屏障缺陷、免疫學(xué)因素、腸道菌群失調(diào)、腸道感染及精神神經(jīng)因素。在眾多發(fā)病因素中以免疫因素最為重要，其中Th17/Treg平衡失調(diào)是導(dǎo)致腸黏膜免疫失調(diào)及腸黏膜屏障受損的主要原因，與UC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5，24-25]。臨床研究顯示，在UC患者外周血及腸黏膜組織中的Th17細(xì)胞明顯增多，而Treg細(xì)胞明顯減少，Th17/Treg比例明顯失衡，并與腸道炎癥活動度密切相關(guān)[26-27]。

CD4+T細(xì)胞是適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，受不同的微環(huán)境影響，可分化為不同的細(xì)胞亞群。其中，Th17細(xì)胞是一類具有促炎作用的CD4+T細(xì)胞亞群，通過釋放白細(xì)胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、IL-17A等多種炎癥因子調(diào)節(jié)炎癥發(fā)生，Treg細(xì)胞則是CD4+T細(xì)胞亞群中具有抗炎作用的一種細(xì)胞，能夠通過釋放細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10（interleukin-10， IL-10）和TGF-β，并通過直接接觸Th細(xì)胞表面來抑制其他輔助性T細(xì)胞（T helper cells， Th）亞型，參與對抗細(xì)菌激增的免疫反應(yīng)，起到免疫抑制作用[28]。研究顯示，Treg細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可能可以抑制效應(yīng)T細(xì)胞，對維持腸黏膜穩(wěn)態(tài)具有重要意義[29]。Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞在功能上相互拮抗，共同維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)。在環(huán)境、遺傳等多重因素的作用下，原始CD4+T細(xì)胞分化向Th17偏移，Th17細(xì)胞增多，IL-17A等炎癥因子分泌增加，Treg細(xì)胞的分化受到抑制，TGF-β、IL-10等細(xì)胞因子分泌減少，腸黏膜免疫系統(tǒng)紊亂，是導(dǎo)致UC腸道免疫炎癥反應(yīng)過度激活和難于自限的直接原因[30]。TGF-β是誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Treg分化的重要因子，并可抑制其向Th17的分化，已有研究證實，在高濃度TGF-β的微環(huán)境下，RORγ t表達被抑制，CD4+T細(xì)胞分化向Treg方向偏移[31]。RORγ t是Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在RORγ t缺陷小鼠中，Th17細(xì)胞已被證明顯著減少[18]。有大量文獻證明，RORγ t對CD4+T細(xì)胞分化向Th17偏移的積極影響[32-33]。RORγ t的表達上升，會促使CD4+T細(xì)胞向Th17方向偏移，Th17細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的占比增加，而Th17細(xì)胞分泌的標(biāo)志性炎性因子IL-17A的含量及表達也會明顯升高，進而誘導(dǎo)其他促炎因子和趨化因子，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇[34]。

中醫(yī)學(xué)將潰瘍性結(jié)腸炎歸屬于“痢疾”“腸澼”“久痢”等范疇[35]，主要病機包括濕熱下注、肝郁脾虛、脾腎陽虛等類型，病位在大腸，涉及脾、肝、腎、肺諸臟，為本虛標(biāo)實之證。下合穴與募穴是中醫(yī)經(jīng)典中針灸治療相應(yīng)臟腑病變的特定選穴，對于“合募配穴”，古今醫(yī)家及醫(yī)籍均有大量的論述和記載，如：《針灸大成·雜病穴法歌》載“足三里配中脘……主治胃脘痛”；《針灸大成·百癥賦》有“天樞配巨虛主治痢疾”等。大量文獻報道，合募配穴應(yīng)用于臨床針灸治病，療效顯著[36-37]。本研究取上巨虛、天樞兩穴，上巨虛為足陽明胃經(jīng)之腧穴，大腸之下合穴，主治胃腸病。研究證明，針刺上巨虛能減輕UC模型大鼠腸黏膜損傷，抑制炎性反應(yīng)，產(chǎn)生治療效果[12-13]。天樞屬足陽明胃經(jīng)之腧穴、大腸經(jīng)之募穴，為大腸經(jīng)氣所聚之處，為氣機升降之樞紐，針刺天樞通過神經(jīng)、體液調(diào)節(jié)，抑制胃腸蠕動，起到緩急止痛的效果[38]。下合穴重在通降，募穴主重在內(nèi)腑或陽病，兩者相結(jié)合治療六腑疾病，可到達協(xié)同作用，增加療效。下合穴其位在下，與臟腑縱向關(guān)聯(lián)；募穴其位在上，與臟腑有橫向關(guān)聯(lián)，屬上下近遠配穴。陰陽互助，一降一升，縱橫協(xié)調(diào)，遠近相配，其腑病可除。

本研究中模型組RORγ t、IL-17A表達顯著升高，提示Th17細(xì)胞比例上升，TGF-β表達顯著下降，脾臟CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞百分比顯著降低，提示Treg細(xì)胞比例降低，二者說明CD4+T細(xì)胞分化向Th17方向偏移，大鼠體內(nèi)Th17/Treg失衡；合募配穴組、天樞組及上巨虛組Treg百分比、TGF-β mRNA表達顯著上升，提示Treg細(xì)胞比例上升，RORγ t、IL-17A mRNA表達顯著降低，提示Th17細(xì)胞比例下降，二者說明電針治療下，CD4+T細(xì)胞分化向Treg細(xì)胞偏移，Th17/Treg平衡失衡得到改善。同時，TGF-β是抗炎因子，IL-17A是促炎因子，TGF-β mRNA表達的上升和IL-17A mRNA表達的下降，可提示電針治療下UC大鼠體內(nèi)炎性反應(yīng)減輕。與天樞組及上巨虛組比較，合募配穴組Treg細(xì)胞比例顯著升高，RORγ t表達顯著降低，提示合募配穴對于Th17/Treg平衡影響優(yōu)于單穴，TGF-β表達量有升高趨勢，IL-17有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，原因可能在于樣本量偏少，后期實驗加大樣本量或可得到更準(zhǔn)確的結(jié)果。

綜上所述，電針對UC有良好的治療作用，且合募配穴療效優(yōu)于單穴療效，其作用機制可能是通過提高TGF-β表達、抑制RORγ t表達，促使CD4+T細(xì)胞分化向Treg細(xì)胞偏移，調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，降低IL-17A表達，以調(diào)控腸黏膜免疫失衡狀態(tài)，恢復(fù)腸黏膜免疫穩(wěn)態(tài)，減輕炎性反應(yīng)。

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