王玉玲 羅丹 陳家鈴 任姝靜 張明浩 劉衛(wèi)

通過體外細胞實驗，研究透明質(zhì)酸鈉/植物鞘氨醇/三肽-1經(jīng)皮共輸送納米載體對皮膚屏障的修復作用。采用細胞實驗考察透明質(zhì)酸鈉/植物鞘氨醇/三肽-1納米載體對角質(zhì)形成細胞（HaCaT）的增殖能力，細胞遷移能力，細胞分泌絲聚蛋白、水通道蛋白3及緊密連接蛋白-1水平的影響。結(jié)果表明，與游離活性物比較，透明質(zhì)酸鈉/植物鞘氨醇/三肽-1納米載體能顯著提高HaCaT細胞增殖能力（P<0.05），增加HaCaT細胞遷移能力（P<0.01），且能顯著促進HaCaT細胞分泌絲聚蛋白、水通道蛋白3及緊密連接蛋白-1水平（P<0.05）。說明透明質(zhì)酸鈉/植物鞘氨醇/三肽-1納米載體具有修復皮膚屏障的作用，在新型高性能皮膚屏障修復護膚品領域具有良好的應用前景。

關鍵詞：透明質(zhì)酸鈉，植物鞘氨醇，三肽-1，經(jīng)皮輸送納米載體，屏障修復

皮膚作為人體重要的屏障，能夠保護人體免受外界環(huán)境傷害和維持人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。皮膚屏障一旦受損，會導致鎖水力下降、耐受力降低、外界有害物質(zhì)刺激增加，從而使得濕疹、皮炎等皮膚疾病的發(fā)病率上升[1]。角質(zhì)層作為一個連續(xù)性屏障，主要由角質(zhì)細胞和細胞間脂質(zhì)構(gòu)成，角質(zhì)形成細胞在角化過程中產(chǎn)生脂質(zhì)并分泌至表層形成脂膜，角質(zhì)形成細胞與胞外活性物緊密結(jié)合，形成初步的物理保護屏障[2]。

透明質(zhì)酸鈉（HA）對皮膚的作用主要取決于分子量大小。大分子HA主要用于皮膚的保濕，涂于皮膚表面的HA能軟化皮膚的角質(zhì)層，進一步增強皮膚角質(zhì)層對活性物的吸收利用，使皮膚變得細膩光滑。小分子HA能透過正常皮膚屏障滲入真皮，直接促進細胞生長、分化、重建與修復，還可促進角質(zhì)形成細胞的增殖和遷移[3，4]。

植物鞘氨醇為神經(jīng)酰胺的前體，植物鞘氨醇不僅參與神經(jīng)酰胺生成，同樣具有促進人體表皮角化細胞分化作用[5]。三肽-1作為一種信號肽，具有促進細胞外基質(zhì)如I和III型膠原蛋白，彈性蛋白，結(jié)構(gòu)糖蛋白如層粘連蛋白和纖維連接蛋白的合成，能夠促進皮膚組織更新重建[6]。

鑒于皮膚自有屏障功能的影響，上述活性成分難以透過角質(zhì)層，在皮膚屏障內(nèi)側(cè)難以蓄積至有效濃度范圍，導致皮膚屏障修復效果減弱甚至消失。采用經(jīng)皮給藥納米載體技術(shù)，從保護皮膚屏障功能、補充細胞間脂質(zhì)成分、促進角質(zhì)層修復三大途徑出發(fā)，將這三種途徑的屏障修復活性成分同時包載于同一納米載體中，可有效促進活性成分透皮吸收、提高其在皮膚中的儲留量，實現(xiàn)不同作用機制活性成分的協(xié)同增效[7，8]。本研究構(gòu)建透明質(zhì)酸鈉、植物鞘氨醇和三肽-1的經(jīng)皮共輸送納米載體—屏障修復納米載體，通過體外細胞實驗對皮膚屏障修復功效進行系統(tǒng)研究和評價，以期為高性能的屏障修復功效護膚品開發(fā)提供實驗依據(jù)。

01實驗部分

1.1實驗材料

透明質(zhì)酸鈉，華熙生物科技股份有限公司；植物鞘氨醇，韓國斗山；三肽-1，潤輝生物技術(shù)（威海）有限公司；1，3-丙二醇，韓國B&B；卵磷脂，上海太偉藥業(yè)股份有限公司；聚甘油-10油酸酯，日本日光化學。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青鏈霉素、胰酶，購自美國Gbico公司；CCK-8試劑盒，日本同仁化學；絲聚蛋白（FLG）、水通道蛋白3（AQP3）和緊密連接蛋白-1（Claudin-1）Elisa試劑盒，購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；人角質(zhì)形成細胞（HaCaT），購自中國科學院昆明細胞庫。

1.2實驗儀器

高速剪切機，德國IKA公司；Zetasizer/Nano-ZS90納米電位粒徑分析儀，英國Malvern公司；AMH-3微射流高壓均質(zhì)機，安拓思納米技術(shù)（蘇州）有限公司；多標記酶標儀，美國PerkinElmer公司；AxioLabA1顯微鏡，蔡司中國公司；超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；BB150CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司。

1.3實驗方法

1.3.1屏障修復納米載體的制備

稱取適量植物鞘氨醇、聚甘油-10油酸酯和卵磷脂，45℃水浴加熱溶解，得到油相；另稱取透明質(zhì)酸鈉、三肽-1和1，3-丙二醇加到純化水中，45℃水浴加熱溶解，得到水相；將水相緩慢滴加至油相中并在45℃、800rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌30min，采用微射流高壓均質(zhì)機將混合溶液均質(zhì)后，冷卻至室溫，得到屏障修復納米載體。

1.3.2粒徑、PDI與Zeta電位

取適量屏障修復納米載體，超純水稀釋一定倍數(shù)，用納米電位粒徑分析儀測定粒徑、多分散指數(shù)（Polymerdispersityindex，PDI）和Zeta電位，粒徑測定角度為90°，測試溫度為25℃。

1.3.3細胞毒性實驗

收集對數(shù)生長期的HaCaT以1.5×104個/孔的密度接種于96孔板中，每孔100μL，于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24h。待細胞貼壁后，每孔分別加入100μL含有不同濃度的游離活性物和屏障修復納米載體的DMEM完全培養(yǎng)基（對應HA濃度為0.2、1、5、25和125μg/mL），對照組僅加100μLDMEM完全培養(yǎng)基，每組3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入10μLCCK-8溶液，孵育2h后于450nm處測量各孔的吸光度（A），計算細胞存活率。

1.3.4HaCaT細胞增殖實驗

收集對數(shù)生長期的HaCaT以8×103個/孔的密度接種于96孔板中，每孔100μL，于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24h。待細胞貼壁后，每孔分別加入100μL含有不同濃度的游離活性物和屏障修復納米載體的DMEM完全培養(yǎng)基（對應HA濃度為1μg/mL、5μg/mL和25μg/mL），對照組僅加100μLDMEM完全培養(yǎng)基，每組3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入10μLCCK-8溶液，孵育2h后于450nm處測量各孔的吸光度（A），計算細胞存活率。

1.3.5HaCaT細胞劃痕實驗

收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)整HaCaT細胞密度為5×105個/mL，接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜。用微量槍頭在細胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分，用PBS沖洗劃掉的部分，每孔分別加入含有游離活性物、屏障修復納米載體的DMEM完全培養(yǎng)基（對應HA的濃度為5μg/mL），對照組僅加DMEM完全培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中孵育24h后，然后于倒置顯微鏡下觀察劃痕區(qū)細胞的愈合情況并拍照記錄，采用ImageProPlus軟件計算出劃痕面積的平均值，計算劃痕區(qū)愈合率。

1.3.6屏障修復相關因子檢測實驗

將HaCaT細胞以1×105個/mL的密度接種到24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔500μL，于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24h。每孔分別加入500μL含有不同濃度的游離活性物、屏障修復納米載體的DMEM完全培養(yǎng)基（對應HA的濃度為1μg/mL、5μg/mL和25μg/mL），對照組僅加500μLDMEM完全培養(yǎng)基，每組3個復孔，于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)48h后取上清液，用Elisa試劑盒測試FLG、AQP3及Claudin-1含量。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學處理，所有數(shù)據(jù)均采用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，使用ANOVA法評估兩組結(jié)果差異，P<0.05被認為有統(tǒng)計學差異。

02結(jié)果與討論

2.1理化性質(zhì)表征

采用納米電位粒徑分析儀測得屏障修復納米載體粒徑為134.2±1.3nm，PDI為0.271±0.014，Zeta電位為-18.2±1.5mV，屏障修復納米載體的粒徑分布見圖1。

2.2對HaCaT細胞安全性影響

表皮角質(zhì)形成細胞是構(gòu)成皮膚表皮層的主要細胞類型，并且具有表皮構(gòu)成、創(chuàng)傷修復、細胞角化、細胞因子分泌和免疫監(jiān)視等功能，常被用于生物醫(yī)學領域作為體外皮膚研究的細胞系，對皮膚屏障修復具有顯著影響[9]。采用CCK-8法檢測評價屏障修復納米載體安全性，并為后續(xù)實驗確定合適的給藥劑量。

如圖2所示，當屏障修復納米載體中HA濃度在0.2～125μg/mL范圍內(nèi)，游離活性物和屏障修復納米載體組HaCaT細胞活性均在80%以上，無明顯細胞毒性。但HA濃度在125μg/mL時，屏障修復納米載體HaCaT細胞存活率降低，后續(xù)實驗選擇的HA濃度為1μg/mL、5μg/mL和25μg/mL。

2.3促進HaCaT細胞增殖

將不同濃度的游離活性物與屏障修復納米載體處理HaCaT細胞48h后，采用CCK-8法檢測HaCaT細胞存活率變化見圖3。

如圖3所示，與空白對照比較，游離活性物和屏障修復載體均能促進HaCaT細胞增殖（P<0.05或P<0.01）；與游離活性物比較，HA濃度為5μg/mL和25μg/mL時，屏障修復載體對HaCaT細胞具有明顯的促增殖作用（P<0.05或P<0.01），說明屏障修復載體能促進HaCaT細胞增殖，且效果優(yōu)于同濃度游離活性物。

2.4促進HaCaT細胞遷移

在傷口愈合的早期階段，表皮中角質(zhì)形成細胞被激活，并遷移到創(chuàng)傷部位誘導傷口收縮，接著進行細胞增殖以皮膚修復重建，因此，角質(zhì)形成細胞對于傷口愈合有重要作用[10]。采用細胞劃痕實驗，比較0h和24h劃痕面積變化，探討游離活性物和屏障修復納米載體對HaCaT細胞遷移能力的影響，結(jié)果見圖4。

如圖4所示，在HaCaT細胞中，HA濃度為5μg/mL時，與空白對照組比較，游離活性物和屏障修復納米載體均能極顯著增加HaCaT細胞遷移率（P<0.01），與游離活性物組比較，屏障修復納米載體均能極顯著增加HaCaT細胞遷移率（P<0.01），說明復合屏障修復載體能夠顯著促進HaCaT細胞的遷移融合，具有良好的皮膚屏障修護效果，且效果優(yōu)于同濃度游離活性物。

2.5提高屏障修復因子FLG水平

FLG分布于表皮顆粒層和透明層，對維持角質(zhì)層的物理強度和阻止外來抗原侵入至關重要。FLG可促進表皮分化，在FLG單體協(xié)助連接下，角蛋白成纖維束有規(guī)則地聚集，進而引起細胞緊密的狀態(tài)，形成表皮角質(zhì)層的屏障結(jié)構(gòu)，其降解可形成天然保濕因子[11]。采用ELISA法檢測屏障修復納米載體對HaCaT細胞外基質(zhì)中FLG的影響，結(jié)果見圖5。

如圖5所示，與空白對照比較，游離活性物和屏障修復納米載體均能極顯著促進HaCaT細胞分泌FLG（P<0.01）；HA濃度1μg/mL、5μg/mL時，與游離活性物比較，屏障修復納米載體促進HaCaT細胞分泌FLG水平顯著提高（P<0.05或P<0.01）。

2.6提高屏障修復因子AQP3水平

AQPs是角質(zhì)形成細胞中與水分子通透性有關的一個跨膜轉(zhuǎn)運蛋白通道，AQP3可將水分、甘油、甘油三脂轉(zhuǎn)運至表皮，保持表皮水分，對皮膚屏障修復、保濕具有積極作用[12]。采用ELISA法檢測屏障修復納米載體對HaCaT細胞外基質(zhì)中AQP3的影響，結(jié)果見圖6。

如圖6所示，與空白對照比較，游離活性物HA濃度5μg/mL、25μg/mL時，屏障修復納米載體HA濃度1μg/mL、5μg/mL、25μg/mL時，HaCaT細胞分泌AQP3含量顯著提高（P<0.05或P<0.01）。HA濃度1μg/mL時，與游離活性物比較，屏障修復納米載體促進HaCaT細胞分泌AQP3水平顯著提高（P<0.01）。

2.7提高屏障修復因子Claudin-1水平

緊密連接蛋白包括Claudin家族蛋白、閉合蛋白Occludin、連接黏附分子家族蛋白以及緊密連接斑塊蛋白，對于維持表皮細胞的選擇滲透性屏障功能至關重要。其中，Claudin-1是構(gòu)成緊密連接結(jié)構(gòu)最重要的組成活性物，與多種皮膚疾病的發(fā)生息息相關[13]。采用ELISA法檢測屏障修復納米載體對HaCaT細胞外基質(zhì)中Claudin-1的影響，結(jié)果見圖7。

如圖7所示，與空白對照比較，游離活性物HA濃度5μg/mL、25μg/mL時，屏障修復納米載體HA濃度1μg/mL、5μg/mL、25μg/mL時，HaCaT細胞分泌Claudin-1含量顯著提高（P<0.01）。HA濃度25μg/mL時，與游離活性物比較，屏障修復納米載體促進HaCaT細胞分泌Claudin-1水平顯著提高（P<0.05）。

03結(jié)論

本研究制備的屏障修復經(jīng)皮共輸送納米載體包含透明質(zhì)酸鈉、植物鞘氨醇和三肽-1三種主要活性成分，按照屏障修復作用機制進行配伍，協(xié)同增效。體外細胞實驗結(jié)果證明，屏障修復納米載體對HaCaT細胞安全無毒性，與游離活性物比較，屏障修復納米載體可促進HaCaT細胞增殖及細胞遷移，且能增加HaCaT細胞分泌屏障相關因子FLG、AQP3和Claudin-1的水平。本研究提示，透明質(zhì)酸鈉、植物鞘氨醇和三肽-1等活性成分經(jīng)納米載體包裹后得到的屏障修復經(jīng)皮共輸送納米載體，在高性能屏障修復化妝品產(chǎn)品中具有良好的應用前景。