阿力木·艾麥爾，慕麗紅，劉曉穎，韓 鵬，王新繪，李金耀?

(1.新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830017；2.新疆大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830017)

0 引言

樹突狀細(xì)胞（Dendritic Cell,DC）被認(rèn)為是免疫治療中最具潛力的細(xì)胞[1].DC是專職的抗原遞呈細(xì)胞，在抗原特異性免疫反應(yīng)中起決定性作用[2].當(dāng)病原體入侵時，機(jī)體外周組織未成熟的DC能夠吞噬病原體，通過模式識別受體（Pattern Recognition Receptor,PRR）來識別病原體相關(guān)模式分子（Pathogen Associated Molecular Patterns,PAMP）促進(jìn)DC的成熟，高表達(dá)趨化因子受體CCR7（C-C Chemokine Receptor 7），相應(yīng)趨化因子信號遷移至引流淋巴結(jié)，將抗原遞呈給初始T細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng).成熟的DC抗原吞噬能力降低，高表達(dá)共刺激分子CD40、CD80、CD86和主要組織相容性復(fù)合體（Major Histocompatibility Complex,MHC），分泌高水平細(xì)胞因子，參與DC和T細(xì)胞相互作用，調(diào)控獲得性免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和類型[3－4].DC吞噬抗原，加工并遞呈給初始T細(xì)胞的過程中，MHCⅡ遞呈的抗原被輔助性CD4+T細(xì)胞識別，這一過程對于初始T細(xì)胞的激活至關(guān)重要.成熟DC表面的共刺激分子CD40、CD86有效刺激初始T細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的獲得性免疫反應(yīng)[5].DC分泌的細(xì)胞因子IL-12誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化成Th1細(xì)胞并分泌IFN-γ，DC分泌的細(xì)胞因子IL-23和IL-1誘導(dǎo)Th17分化并分泌IL-17，進(jìn)而參與炎癥反應(yīng)和抗感染[6].

DC按功能分為免疫應(yīng)答性DC和耐受性DC.免疫應(yīng)答性DC具有激活T細(xì)胞和B細(xì)胞的功能，而免疫耐受性DC通過建立和維持外周T細(xì)胞耐受性來維持免疫穩(wěn)態(tài).耐受性DC在誘導(dǎo)Treg的生成中起重要作用[7].DC在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis,RA）的發(fā)展中起重要作用，提高DC的耐受性，抑制TNF-α、IL-6和IL-1等促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以治療RA[8].

中草藥用于治療多種人類疾病有著悠久的歷史.越來越多的證據(jù)表明中藥及其活性成分可調(diào)節(jié)DC的成熟和功能[9].中醫(yī)用刺山柑（Capparis spinosa L.）治療痛風(fēng)和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎.本課題組前期研究顯示，刺山柑果實經(jīng)無水乙醇提取后，石油醚和乙酸乙酯萃取得到的水相能夠抑制LPS（Lipopolysaccharides）誘導(dǎo)的DC成熟以及炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[10].刺山柑果實總生物堿通過MAPK和NF-κB信號通路抑制LPS誘導(dǎo)的DC成熟及促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，增加抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)[11].本文在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分離刺山柑果實95%乙醇提取物獲得正丁醇相（Capparis spinosa L.fruit n-Butanol Extract,CSBE），研究CSBE的免疫抑制效果及有效成分，并對其作用機(jī)理進(jìn)行初步研究.

本文檢測了CSBE在體外抑制DC成熟及促炎細(xì)胞因子分泌情況，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）鑒定CSBE抗炎活性成分，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測CSBE的抗炎作用靶點及通路，western blot驗證關(guān)鍵靶點表達(dá)水平，探討CSBE抑制DC成熟的作用及機(jī)理，為CSBE作為免疫抑制劑用于治療RA等自身免疫性疾病提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

6～8周齡BALB/c小鼠購于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；刺山柑果產(chǎn)地為中國新疆伊犁；胎牛血清購于江蘇恩莫阿賽生物技術(shù)有限公司；Penicillin-streptomycin雙抗購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor tumor necrosis factor,GM-CSF）購于Peprotech公司；流式抗體PE-CD40、APC-CD86購于BD Biosciences公司；RPMI-1640培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖溶液（PBS）購于Gibco公司；LPS購于Sigma公司；western blot抗體及ELISA試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；95%乙醇、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯及NaCl等均為國產(chǎn)分析純.

1.2 CSBE的制備

伊犁刺山柑果實打粉，過40目篩，按照料液比1∶6與95%乙醇混勻后超聲20 min，60 ℃水浴提取2 h，提取3次并合并提取液，60 ℃旋蒸濃縮后，加適量蒸餾水使其重懸，加入NaCl至過飽和，分別利用石油醚、乙酸乙酯和水飽和正丁醇逐級萃取后收集正丁醇相，旋蒸濃縮后凍干置-80 ℃保存.

1.3 CSBE對DC成熟的影響

根據(jù)文獻(xiàn)[12]獲得DC，第7天收集細(xì)胞和上清培養(yǎng)液[13].用不同濃度的CSBE單獨或與LPS聯(lián)用處理DC 12 h后，加入PE-CD40、APC-CD86抗體，采用流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，BD Biosciences）檢測表面分子表達(dá)情況，F(xiàn)lowJo 7.6軟件分析數(shù)據(jù).DC用不同濃度的CSBE單獨或與LPS聯(lián)用處理12 h后，加入50 μg·mL－1FITCDextran共孵育1 h，采用流式細(xì)胞儀檢測抗原吞噬能力.上清培養(yǎng)液根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測IL-6、TNF-α，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算相應(yīng)細(xì)胞因子濃度.

1.4 LC-MS鑒定抗炎活性成分

色譜條件：C18色譜柱，正模式0.1%甲酸作為流動相A，負(fù)模式5 mmol·L－1醋酸銨作為流動相A，甲醇在兩種模式下是流動相B.洗脫條件：0～1.5 min，2% B；0～1.5 min，2% B；1.5～12 min，100% B；12～14 min，100%B；14～14.1 min，2% B；14.1～17 min，2% B；柱溫：40 ℃；流速：0.2 mL·min－1.

質(zhì)譜條件：掃描范圍100～1 050 m·z－1.ESI源設(shè)置：噴淋電壓為3.2 kV，氣流量為40 arb，輔氣流量為10 arb，毛細(xì)管溫度為320 ℃.

使用CD 3.1軟件和Python（V3.5.0）對化合物進(jìn)行定性定量分析，通過HMDB和Lipidmaps數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝物注釋，獲得活性成分名稱及含量等信息.

1.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測靶點及通路

對CSBE的LC-MS結(jié)果進(jìn)行分析，在NCBI查找相關(guān)文獻(xiàn)篩選出具有抗炎活性的化合物.在Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中根據(jù)活性成分名稱查詢相應(yīng)的SMILE編號，導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http://www.Swisstarget prediction.ch）進(jìn)行化合物靶點預(yù)測[14].在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecar ds.org）中以“rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得疾病靶點.將藥物預(yù)測靶點與疾病靶點繪制韋恩圖并取交集部分，得到關(guān)鍵靶點.將活性成分與關(guān)鍵靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2構(gòu)建CSBE活性成分-靶點的互作圖.關(guān)鍵靶點導(dǎo)入Metascape（http://metascape.org）進(jìn)行GO及KEGG富集分析，探討作用靶點涉及的信號通路及參與的生物學(xué)功能，并通過R語言進(jìn)行可視化.

1.6 蛋白質(zhì)印跡（western blot）驗證靶點

DC細(xì)胞以8×106個/毫升加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，2 mg·mL－1濃度的CSBE刺激細(xì)胞，未刺激組為對照.2 h后加Golgistop，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，按照蛋白抽提試劑盒說明書上的操作步驟提取蛋白.取含30 μg蛋白的提取液，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳.轉(zhuǎn)至NC膜，用5%脫脂奶粉在37 ℃封閉2 h，TBST緩沖液（20 mmol·L－1TrisHCl、150 mmol·L－1NaCl、0.05% Tween 20）洗滌3次，分別加入相應(yīng)的一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜.TBST洗膜后與HRP標(biāo)記的二抗（1∶1 000）37 ℃孵育2 h，加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在Image Quant LAS 4000mini上曝光.β-actin作為胞質(zhì)蛋白的內(nèi)參.

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 5分析數(shù)據(jù)，通過單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行處理組與對照組之間的比較，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 實驗結(jié)果

2.1 CSBE抑制LPS誘導(dǎo)的DC成熟

DC表面共刺激分子CD40、CD86與DC成熟及功能相關(guān)，抑制其表達(dá)能降低DC成熟.CSBE單獨處理發(fā)現(xiàn)DC表面分子CD40與未處理組相比，沒有顯著性差異.1、2、3 mg·mL－1CSBE處理DC均能顯著抑制CD86的表達(dá)；與LPS聯(lián)合使用時，CSBE顯著抑制CD40和CD86的表達(dá)，且具有劑量依賴性（圖1A）.細(xì)胞因子在免疫系統(tǒng)中起到復(fù)雜而重要的作用.成熟的DC分泌TNF-α等細(xì)胞因子的分泌能力增加[1].CSBE單獨處理DC時，TNFα和IL-6分泌與未處理組相比無顯著差異；CSBE與LPS聯(lián)合處理DC時，CSBE顯著抑制了TNF-α和IL-6的分泌水平，并呈劑量依賴性（圖1B）.CSBE單獨或與LPS聯(lián)用，都能顯著增強(qiáng)DC胞內(nèi)FITC-Dextran含量，說明CSBE增強(qiáng)了DC抗原吞噬能力（圖1C）.以上結(jié)果說明，CSBE能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的DC成熟，但對未成熟DC無過度抑制作用.

圖1 CSBE對DC成熟的影響

2.2 LC-MS鑒定CSBE活性成分

為鑒定CSBE抑制DC成熟的活性成分，對CSBE進(jìn)行LC-MS分析.LC-MS結(jié)果顯示，正離子模式下鑒定化合物774種，總離子流圖（Total Ion Chromatogram,TIC）見圖2A.篩選出具有抗炎活性的化合物49種，其中黃酮類、生物堿類、萜類、香豆素類、酚類、苯丙素類、有機(jī)酸類和其它類活性成分分別為8、11、9、2、6、5、3、5種（圖2B、表1）.各類化合物的相對含量百分比分別為黃酮類3%、生物堿類19%、萜類3%、香豆素類0%、酚類58%、苯丙素類1%、有機(jī)酸類6%、其它類10%.其中：酚類含量最高，香豆素類含量最低（圖2C）.各化合物結(jié)構(gòu)式見圖2D.

表1 正丁醇相正離子模式下具有抗炎活性的化合物

圖2 CSBE正離子模式下的LC-MS結(jié)果

LC-MS負(fù)離子模式下的TIC見圖3A.共鑒定出化合物395種，篩選出具有抗炎活性的化合物42種，其中黃酮類、糖苷類、生物堿類、萜類、有機(jī)酸類、苯丙素類、香豆素類和其它類活性成分分別為9、3、6、9、1、6、2、6種（圖3B、表2）.各類化合物的相對含量百分比分別為黃酮類91%、糖苷類0%、生物堿類1%、有機(jī)酸類3%、萜類1%、苯丙素類2%、香豆素類1%、其它類1%.其中：黃酮類含量最高，糖苷類含量最低（圖3C）.各化合物結(jié)構(gòu)式見圖3D.

表2 正丁醇相負(fù)離子模式下具有抗炎活性的化合物

圖3 CSBE負(fù)離子模式下的LC-MS結(jié)果

2.3 CSBE治療RA靶點預(yù)測

上述9大類化合物基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行RA靶點預(yù)測.通過GeneCards檢索到RA靶點4 374個，通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測CSBE中具有抗炎活性化合物的靶點，并將各大類化合物靶點分別與RA靶點取交集作為關(guān)鍵靶點.預(yù)測到黃酮類、苯丙素類、香豆素類、酚類化合物關(guān)鍵靶點242個，其中黃酮類、苯丙素類、香豆素類和酚類獨有靶點分別為45、48、11、7個（圖4A）.構(gòu)建化合物類型和疾病靶點網(wǎng)絡(luò)，包括246個節(jié)點、458條相互作用關(guān)系.展示了天然產(chǎn)物具有多成分、多靶點的作用（圖4B）.將關(guān)鍵靶點構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，其中degree值排名前20的靶點作為核心靶點，包括AKT1、GAPDH、TNF、ALB、VEGFA、EGFR、CTNNB1、HSP90AA1和MMP9等（圖4C）.

圖4 CSBE中黃酮類、苯丙素類、香豆素類、酚類化合物靶點預(yù)測

萜類、生物堿類、糖苷類、有機(jī)酸類、其它類化合物關(guān)鍵靶點350個，其中萜類、生物堿類、糖苷類、有機(jī)酸類和其它類獨有靶點分別為44、91、1、4、21個（圖5A）.構(gòu)建化合物類型和疾病靶點網(wǎng)絡(luò)，包括355個節(jié)點、641條相互作用關(guān)系（圖5B）.核心靶點包括AKT1、TNF、IL-6、GAPDH、VEGFA、IL-1β、SRC、EGFR、MMP9和TLR4等20個（圖5C）.CSBE與炎癥相關(guān)較強(qiáng)的靶點有TNF、IL-6、IL-1β和MMP9等.

圖5 CSBE中萜類、生物堿類、糖苷類、有機(jī)酸類、其它類化合物靶點預(yù)測

2.4 CSBE作用機(jī)制分析

采用western blot對上述預(yù)測的靶點進(jìn)行驗證.采用2 mg·mL－1CSBE與LPS聯(lián)用處理DC，12 h后收集細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，western blot檢測MMP9和MMP13的表達(dá).結(jié)果顯示CSBE顯著降低LPS誘導(dǎo)的DC胞內(nèi)MMP9和MMP13的表達(dá)（圖6A），這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果一致，證明CSBE可以通過抑制MMPs的表達(dá)抑制DC遷移，進(jìn)而影響DC功能.

圖6 CSBE作用機(jī)制

通過Metascape數(shù)據(jù)庫對化合物關(guān)鍵靶點進(jìn)行GO生物學(xué)過程（GOBP）和KEGG通路富集分析，有機(jī)酸類化合物與RA，尤其是與Th17分化更相關(guān)，其中涉及的生物學(xué)過程包括輔助性T細(xì)胞的分化（T-helper cell differentiation）、Th17輔助性細(xì)胞的分化（T-helper 17 cell differentiation）和Th17型免疫反應(yīng)（T-helper 17 type immune response）等（圖6B）.涉及的KEGG通路包括磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路（PI3K-AKT signaling pathway）、Th17細(xì)胞分化（Th17 cell differentiation）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）和IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）等（圖6C）.以上分析結(jié)果提示：有機(jī)酸類化合物是CSBE中治療RA的主要活性物質(zhì)，通過多靶點抑制DC成熟、促炎細(xì)胞因子分泌，通過抑制MMPs表達(dá)抑制DC遷移，進(jìn)而抑制Th17細(xì)胞分化和IL-17產(chǎn)生，具有潛在的免疫抑制及治療RA的作用.

3 討論

DC作為先天免疫和獲得性免疫反應(yīng)的橋梁被廣泛關(guān)注.根據(jù)疾病的發(fā)病機(jī)理，通過抑制DC的成熟程度來治療炎癥目前是醫(yī)藥界的熱點之一，其中抑制DC來治療RA取得顯著的治療效果[15].中藥用于治療疾病歷史悠久，具有免疫調(diào)節(jié)及副作用低的優(yōu)點.本文中CSBE顯著抑制LPS誘導(dǎo)的DC表面分子的表達(dá)以及炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的分泌，通過抑制Th17分化及IL-17分泌治療RA，有機(jī)酸類化合物是主要活性物質(zhì)，為開發(fā)利用中藥刺山柑治療RA等疾病提供理論依據(jù).

本文結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和LC-MS鑒定的化合物對潛在靶點進(jìn)行富集分析，結(jié)合信號通路描述了成分與作用靶點的關(guān)系.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CSBE作用于RA共有的關(guān)鍵靶點degree值較高的包括AKT1、TNF、SRC、EGFR、MAPK3、STAT3、HSP90AA1和CASP3等，其中AKT1是AKT家族成員，活化的AKT上調(diào)CyclinD1、參與細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡.有研究表明抑制PI3K/AKT/NF-κB信號通路能有效減緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展[16].舒芬太尼可通過上調(diào)miR-365-3p表達(dá)而抑制AKT1表達(dá)，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞遷移及侵襲[17].黃芪三仙湯通過抑制PI3K/AKT信號通路活化起抗骨質(zhì)疏松的作用[18].高根胺通過激活A(yù)KT1和抑制EGFR/JAK2/c-JUN信號減輕過敏性鼻炎[19]，可見AKT1可調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移，參與多種自身免疫疾病，是治療自身免疫疾病的靶點之一.CSBE可能通過AKT1發(fā)揮免疫抑制及抗炎活性.

炎癥是抵抗感染和損傷的保護(hù)性反應(yīng)，TNF-α在慢性炎癥發(fā)生中起重要作用，通過NF-κB和MAPK信號通路參與腫瘤和炎癥發(fā)生.近年來，越來越多的證據(jù)表明炎癥與多種慢性或惡性疾病密切相關(guān)，如2型糖尿病、動脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和癌癥等[20].TNF-α誘導(dǎo)STAT3、SRC和EGFR的活化，在腫瘤中TNFα-SRC-EGFR-STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)炎癥誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，在慢性炎癥引起的疾病中，TNF-α表達(dá)升高，與TNFα受體結(jié)合并激活EGFR，活化下游STAT3，因此，推斷EGFR是慢性炎癥誘導(dǎo)腫瘤的橋梁[21].CSBE顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的DC分泌的TNF-α，提示CSBE可能通過TNF信號通路抑制炎癥反應(yīng).HSP90AA1編碼的熱休克蛋白90α是熱休克蛋白家族的成員，研究發(fā)現(xiàn)HSP90AA1是骨關(guān)節(jié)病中與自噬缺陷相關(guān)的生物標(biāo)志物[22]，進(jìn)一步證明HSP90AA1參與自身免疫疾病，是治療自身免疫疾病的靶點之一，提示CSBE可能通過HSP90AA1發(fā)揮免疫抑制活性.Caspase3是一種與凋亡相關(guān)的蛋白酶，Caspase3活化時激活凋亡信號通路，分泌大量細(xì)胞因子，造成嚴(yán)重炎癥反應(yīng).兒咳靈糖漿可以明顯改善支氣管哮喘小鼠肺組織中Caspase-3和TNF-α表達(dá)水平，該糖漿可能通過抗凋亡和改善炎癥損傷發(fā)揮作用[23]，提示CSBE可能通過抗凋亡作用進(jìn)而改善炎癥損傷.

趨化因子廣泛存在于炎癥反應(yīng)組織中，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞向炎癥組織遷移并參與免疫應(yīng)答.有研究報道骨關(guān)節(jié)炎的軟骨、滑膜和關(guān)節(jié)液等組織中發(fā)現(xiàn)了大量趨化因子表達(dá)[24].本文網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果中與趨化因子相關(guān)的蛋白包括AKT、SRC和STAT等，表明CSBE通過調(diào)節(jié)趨化因子信號通路調(diào)節(jié)免疫反應(yīng).HIF-1（低氧誘導(dǎo)因子）在低氧下能激活多種靶基因的表達(dá)，在關(guān)節(jié)炎、動脈硬化和自身免疫疾病患者的炎癥部位發(fā)現(xiàn)了HIF的激活，HIF可以激活NF-κB，缺乏HIF-1的巨噬細(xì)胞遷移能力降低，炎性細(xì)胞因子的分泌降低[25].本文發(fā)現(xiàn)CSBE與LPS共同處理的DC的MMPs表達(dá)量下降，炎性細(xì)胞因子分泌水平降低，說明CSBE可能作用于HIF信號通路，降低細(xì)胞遷移以及炎性細(xì)胞因子的表達(dá).

RA患者中Th17細(xì)胞數(shù)量增加，Th17/Treg平衡破壞在RA發(fā)病中起主要作用.IL-17是Th17細(xì)胞產(chǎn)生的特征性細(xì)胞因子，RA患者滑膜和滑液中Th17及其細(xì)胞因子IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子明顯升高.IL-17缺乏或IL-17中和抗體能夠緩解關(guān)節(jié)炎.IL-17促進(jìn)IL-6、TNF-α、IL-1β和趨化因子加重RA的關(guān)節(jié)炎癥.IL-17也可誘導(dǎo)軟骨MMPs促進(jìn)骨破壞[26]，提示CSBE通過抑制Th17細(xì)胞來減少IL-17，從而在治療RA的過程中發(fā)揮作用.

MMPs參與細(xì)胞遷移、分化與凋亡、炎癥反應(yīng)和組織重構(gòu)等多種生物學(xué)過程.MMP13在骨關(guān)節(jié)炎中調(diào)控TNF-α和IL-1β引起骨關(guān)節(jié)炎病程的進(jìn)展.破骨細(xì)胞分泌和表達(dá)最多的是MMP9，MMP9敲除小鼠出現(xiàn)軟骨細(xì)胞分化受損[27].缺血性腦白質(zhì)病變中，MMP3、MMP9升高與疾病嚴(yán)重程度成正相關(guān)[28]，因此，MMP表達(dá)量升高會引起疾病.CSBE顯著降低了LPS誘導(dǎo)的DC胞內(nèi)MMP9及MMP13蛋白的表達(dá)，提示CSBE可能通過抑制MMP活性發(fā)揮抗炎功能.激活的STAT3被證明與細(xì)胞因子、生長因子、MMPs和血管生成因子的表達(dá)增加有關(guān)[29]，提示CSBE可能通過抑制STAT3來抑制MMP9和MMP13的表達(dá)，從而通過阻斷DC遷移抑制炎癥.

綜上所述，CSBE治療RA的活性成分主要是有機(jī)酸類化合物，主要作用于AKT1、TNF、SRC、EGFR、MAPK3、STAT3、HSP90AA1和CASP3等蛋白，調(diào)控Th17細(xì)胞分化和IL-17信號通路等信號通路，通過多靶點抑制DC成熟和促炎細(xì)胞因子分泌以及遷移，具有潛在的免疫抑制及治療RA的作用，但其作用靶點及信號通路仍需要進(jìn)一步探討.