李易非，王道銓，何 偉，羅登炎，常明彬，王銳亮，姜煥元，林志平，李金蘭，闕文豪，李華杰

福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，福建省廈門市濱水路298 號 361021

傳統(tǒng)煙梗加工工藝普遍存在醇化過程煙梗顏色加深、制梗絲過程煙梗較難回潮等問題，直接影響后續(xù)制梗絲工序加工質(zhì)量和煙梗在卷煙產(chǎn)品中的使用。技術(shù)缺陷主要表現(xiàn)為：一是工藝流程復(fù)雜，設(shè)備投資大；二是制造的梗絲呈大片狀，形態(tài)結(jié)構(gòu)與葉絲差異較大，物理質(zhì)量與卷煙產(chǎn)品匹配性不好；三是制造的梗絲雜氣、刺激性相對凸顯，感官質(zhì)量存在缺陷。為了提升梗絲質(zhì)量，近年各卷煙工業(yè)企業(yè)圍繞煙梗壓切成型工藝進行了深入研究。研究表明，改進煙梗潤梗浸梗技術(shù)［1-2］，改變煙梗切絲方式［3-4］，優(yōu)化梗絲干燥工藝參數(shù)［5-7］，均能夠在一定程度上提升梗絲內(nèi)在質(zhì)量。除了對制梗絲工序進行研究外，前端的煙梗復(fù)烤工序也有文獻報道，主要集中在對不同產(chǎn)地、部位、年份、等級、形態(tài)煙梗的理化特性和吸濕性能等方面的研究［8-12］。目前，大多數(shù)研究均是在煙梗復(fù)烤和制梗絲環(huán)節(jié)圍繞提高梗絲形態(tài)和感官質(zhì)量來進行，對打葉復(fù)烤之后醇化過程中煙梗的內(nèi)在質(zhì)量變化研究較少。煙草原料的醇化主要包括化學(xué)變化、酶催化和微生物作用，其中微生物作用對原料內(nèi)在質(zhì)量的影響起至關(guān)重要的作用。已有研究表明，利用“四段式氣調(diào)法”改變片煙醇化過程中氧氣濃度可以改變細菌群落結(jié)構(gòu)分布，明顯改善片煙的感官質(zhì)量，延長質(zhì)量高點的保持時間［13］。高通量基因測序是檢測菌群分布的重要手段，目前該方法已經(jīng)在食品發(fā)酵與安全［14-15］、環(huán)境保護［16］、生態(tài)養(yǎng)殖［17］、醫(yī)學(xué)檢驗［18-19］等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，在煙草行業(yè)也有應(yīng)用研究。包可翔等［20］利用Illumina MiSeq測序平臺對不同產(chǎn)地和部位自然醇化片煙中細菌16S rDNA 進行高通量測序分析，尋找到不同樣品中的優(yōu)勢菌門和優(yōu)勢菌屬；劉亭亭等［21］采用Biolog ECO代謝表型及高通量測序技術(shù)研究了赤星病發(fā)生期不同成熟度（成熟、適熟、未熟）煙葉葉際微生物代謝功能與群落結(jié)構(gòu)，明確了真菌群落和細菌群落的優(yōu)勢菌群及豐富度與煙葉成熟度的相關(guān)性；李梅云等［23-24］對煙葉微生物發(fā)酵機理進行了研究，明確了假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和芽孢桿菌屬是3種優(yōu)勢產(chǎn)香菌屬，假單胞菌屬在煙草中的主要代謝產(chǎn)物為吡嗪類物質(zhì)，鞘氨醇單胞菌屬能夠?qū)Ψ枷慊衔锝到猱a(chǎn)香，芽孢桿菌屬是煙草醇化過程氨態(tài)氮和酰胺氮含量增加的關(guān)鍵因素。本文中以云南和福建的煙梗為研究對象，在打葉復(fù)烤過程葉梗分離后將煙梗制成片狀，采用四段式氣調(diào)技術(shù)進行倉儲醇化，旨在探尋不同形態(tài)煙梗四段式醇化過程質(zhì)量變化和制得梗絲的品質(zhì)差別，為煙梗壓片復(fù)烤及制絲創(chuàng)新工藝技術(shù)研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

試驗樣品為打葉后2019年云南B梗和福建C梗（長度≥20.0 mm），不同產(chǎn)地、兩個等級的煙梗分別進行傳統(tǒng)烤梗和制梗片復(fù)烤加工（梗片厚度約為0.8～1.5 mm，烤后煙梗含水率為11.0%），具體加工工藝流程見圖1和圖2。制得的梗條和梗片以50 kg為單位打包，在煙葉倉庫四段式氣調(diào)條件下醇化18個月，每隔3個月取樣一次，取樣過程中所用的取樣袋、手套、剪刀等物品均經(jīng)過滅菌處理。采用5點取樣法，每個取樣點取約500 g 樣品，分別置于無菌自封袋中，-10 ℃冷庫存放，具體樣品編號及相關(guān)信息如表1所示。

表1 煙梗樣品信息表Tab.1 Information of tobacco stem samples

圖1 傳統(tǒng)烤梗工藝流程Fig.1 Technological process of traditional tobacco stem redrying

圖2 制梗片復(fù)烤工藝流程Fig.2 Technological process of tobacco stem redrying in flake shape

儀器：7890/5975 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）；MINOLTA-CR-410 型色彩色差計（日本Konica公司）；ML204/02分析天平（感量0.000 1 g、瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 方法

1.2.1 倉儲養(yǎng)護方法

在四段式氣調(diào)貯存條件下，對云南B梗和福建C梗的梗條和梗片進行18個月的跟蹤取樣。四段式氣調(diào)技術(shù)參數(shù)如表2所示。

表2 四段式氣調(diào)技術(shù)參數(shù)Tab.2 Technical parameters of a four-stage controlled atmosphere aging technology

1.2.2 色差值檢測

取不同醇化時間的梗條和梗片各100 g，均勻鋪灑于托盤內(nèi)（20 cm×20 cm），用標(biāo)準(zhǔn)比色卡（CR-43，日本Konica公司）進行零點校準(zhǔn)，分別在托盤的4個角和中心點位置進行樣品色度的檢測，記錄各點樣品色差值△E，計算△E的均值。

1.2.3 含水率檢測

取色差值檢測后樣品50 g，按照YC/T 31—1996《煙草及煙草制品 試樣的制備和水分測定 烘箱法》對煙梗進行破碎，檢測樣品含水率。

1.2.4 煙梗感官質(zhì)量評價

分別將梗條和梗片制成梗絲，卷制成煙支，參照YC/T 415—2011 標(biāo)準(zhǔn)［22］進行感官評吸，評吸人員不少于5 人。感官質(zhì)量總分=香氣特性+煙氣特性+口感特性，其中，香氣特性=香氣質(zhì)+香氣量+透發(fā)性+雜氣，煙氣特性=濃度+勁頭+細膩程度+成團性，口感特性=刺激性+干燥感+干凈程度+回甜。單項感官評價指標(biāo)滿分為9分，最小計分單位為0.5分。

1.2.5 細菌群落高通量測序

1.2.5.1 基因組DNA提取

使用事先經(jīng)濕熱滅菌處理的剪刀將各樣品剪成小片，使用OMEGA Soil DNA Kit 試劑盒（美國Omega 公司）提取樣品基因組DNA，使用Quabit 2.0（美國Life公司）測量DNA濃度，確保提取了足夠數(shù)量的高質(zhì)量基因組DNA。

1.2.5.2 PCR擴增

擴增區(qū)域為細菌16S rRNA基因的“V3-V4”區(qū)。引物：PCR正向引物（5'-CCTACGGGGNGGCWGCAG-3'）和PCR反向引物（5'-GACTACHVGGTATCTATCC-3'）。反應(yīng)體系：模板DNA（10 ng/μL）2 μL；PCR正向引物（10 μmol）1 μL；PCR 反向引物（10 μmol）1 μL；2×KAPA HiFi Hot Start Ready Mix 15 μL，用dd H2O補足至30 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，先執(zhí)行5個熱循環(huán)（95 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），再執(zhí)行20個熱循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最終在72 ℃再延伸5 min。在TBE緩沖液中，使用1%（質(zhì)量濃度）瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物，使用溴化乙錠染色，并在紫外光下觀察。

1.2.5.3 MiSeq測序

樣本送到上海生工生物股份有限公司，采用通用Illumina 接頭和標(biāo)簽進行文庫構(gòu)建，使用AMPure XP 磁珠試劑對樣本進行目標(biāo)片段的純化，并利用Illumina MiSeq高通量測序平臺進行細菌16S rDNA測序。

1.2.5.4 數(shù)據(jù)處理與分析

測序下機的雙端序列數(shù)據(jù)，通過cutadapt去除接頭序列，根據(jù)PE reads 之間的overlap 關(guān)系使用PEAR 將成對reads 拼接成一條序列。根據(jù)barcode序列和引物序列從拼接后的數(shù)據(jù)中拆分出各樣本的數(shù)據(jù)，并使用PRINSEQ切除序列尾部質(zhì)量值20以下的堿基，過濾含N 序列和短序列（200 bp 以下）。按照97%相似性對序列進行OTU 聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。將所有優(yōu)化序列比對至OTU代表序列，選出與代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。細菌使用RDP數(shù)據(jù)庫對不同OTU代表序列進行物種注釋，真菌使用unite 數(shù)據(jù)庫進行注釋。使用OTU 表格和物種豐度表進行α/β多樣性及其他下游分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同形態(tài)煙梗醇化過程含水率和顏色變化

經(jīng)檢測分析，由表3可知，在四段式醇化過程中，兩種形態(tài)的煙梗含水率均略有增加，梗條含水率增加0.95百分點，梗片增加0.47百分點，梗片較梗條含水率波動小。由圖3可知，云南B梗的色差值較福建C 梗小，顏色淺，在醇化過程中，梗條和梗片的顏色均逐漸轉(zhuǎn)深，其中，云南梗條樣品的△E極差為4.53，梗片樣品的△E極差為2.39，福建梗條樣品的△E極差為2.75，梗片樣品的△E極差為1.03，由極差值可知，在四段式貯存條件下，云南B梗和福建C梗的梗條顏色轉(zhuǎn)深程度及速率均大于梗片，顏色轉(zhuǎn)深對梗絲與葉絲的外觀配伍有不良的影響。因此，在四段式醇化條件下，梗片醇化過程含水率和顏色較穩(wěn)定，色差值變化小，轉(zhuǎn)深速率較低。

表3 不同形態(tài)煙梗在四段式醇化過程中含水率變化Tab.3 Changes in moisture content of tobacco stems by shapes during four-stage controlled atmosphere aging（%）

圖3 不同形態(tài)煙梗在倉儲醇化過程中的色差變化Fig.3 Changes in color difference of tobacco stems by shapes during storage and aging

2.2 不同形態(tài)煙梗醇化過程中表面細菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 測序結(jié)果α多樣性分析

由表4可知，云南B梗和福建C梗在四段式氣調(diào)貯存過程中梗片和梗條的12個樣品獲得了45 599～59 534 條優(yōu)質(zhì)序列（reads），獲得的細菌OTU 數(shù)為117～544個。云南B梗的梗片和梗條在貯存過程中的OTU 總數(shù)分別為297/261（6 個月）、544/117（12 個月）、478/359（18 個月）。福建C 梗的梗片和梗條在貯存過程中的OTU 總數(shù)分別為359/120（6 個月）、190/191（12個月）、485/161（18個月）。為了解云南B梗和福建C梗的梗片、梗條分別貯存6～18個月細菌群落的共性和特性，將云南B 梗和福建C 梗樣品OTU 數(shù)據(jù)合并后，進行韋恩圖分析（圖4），由圖4 可知，云南B 梗的梗片和梗條在貯存過程中獨有的OTU 數(shù)分別為48/34（6 個月）、251/7（12 個月）、161/85（18 個月），福建C 梗的梗片和梗條在貯存過程中獨有的OTU 數(shù)分別為53/2（6 個月）、4/3（12 個月）、147/7（18個月）。以上結(jié)果表明云南B梗和福建C梗梗片貯存OTU 總數(shù)和獨有OTU 數(shù)在6 個月、12 個月、18個月大于梗條貯存。

表4 測序結(jié)果reads、OTU、多樣性指數(shù)數(shù)據(jù)Tab.4 Sequencing reads，OTU and diversity index data

圖4 云南B梗和福建C梗梗片、梗條貯存不同時間細菌OTUs分布韋恩圖Fig.4 Wayne diagrams of OTU distribution of flake-shaped and bar-shaped Yunnan B stems and Fujian C stems stored for different periods

由圖5可以看出，云南B梗和福建C梗梗片貯存6～18個月的Chao值和ACE值的平均值均大于梗條貯存。

圖5 云南B梗和福建C梗貯存6～18個月的Chao值和ACE值均值Fig.5 Average Chao values and ACE values of Yunnan B stems and Fujian C stems stored for 6-18 months

綜上，在四段式醇化條件下，梗片醇化6～18 個月的OTU 數(shù)、Chao 值和ACE 值的平均值均大于梗條，細菌群落豐度高于梗條。

2.2.2 門、屬水平細菌群落結(jié)構(gòu)差異分析

圖6、圖7分別為云南B梗和福建C梗12份樣品門、屬水平細菌組成。由圖6可知，云南和福建12份梗片、梗條樣品的細菌群落主要歸屬于4個門，分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria），變形菌門為12 份煙梗樣品的優(yōu)勢菌門。云南B梗和福建C梗變形菌門平均占比超過60%（云南B梗62.43%，福建C梗71.28%）。

圖6 云南B梗和福建C梗12份樣品門水平細菌組成Fig.6 Bacterial composition（phylum level）of 12 samples of Yunnan B stems and Fujian C stems

圖7 云南B梗和福建C梗12份樣品屬水平細菌組成Fig.7 Bacterial composition（genus level）of 12 samples of Yunnan B stems and Fujian C stems

由圖7 可知，在能鑒定至屬水平的菌屬中，云南B梗含有的主要菌屬（6個樣品平均占比≥1%）有鏈霉菌屬（Streptomyces）（50.48%）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）（5.74%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（4.86%）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）（1.64%）4 種，福建C 梗的主要菌屬（6 個樣品平均占比≥1%）為鏈霉菌屬（46.11%）、新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobiumsilvae）（4.91%）、甲基桿菌屬（4.86%）、勞爾氏菌屬（Ralstonia）（3.68%）、假單胞菌屬（2.71%）、鞘氨醇單胞菌屬（2.63%）和新根瘤菌屬（Neorhizobium）（1.79%）7 種。鏈霉菌屬、甲基桿菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬是云南B 梗和福建C 梗共有的優(yōu)勢菌屬，福建C 梗的屬水平群落結(jié)構(gòu)較云南B 梗豐富。芽孢桿菌屬（Bacillas）、假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬是梗片的優(yōu)勢菌屬。鏈霉菌屬主要分布于含水量較低、有機質(zhì)含量豐富的中性或微堿性土壤中，煙梗是煙葉的農(nóng)副產(chǎn)品，因此其在菌屬中占比較高；芽孢桿菌屬可消除煙葉青雜氣、降低刺激性，被認(rèn)為是在醇化過程中的有益菌屬［23-24］，其在梗片貯存過程中的占比明顯大于梗條貯存，云南B 梗和福建C 梗的梗片在6～18 個月的平均占比分別為3.53%和3.07%，而在梗條貯存6～18 個月時的平均占比分別為1.08%和1.27%；假單胞菌屬在煙草中的代謝產(chǎn)物主要為吡嗪類物質(zhì)，該類物質(zhì)是煙草抽吸的重要香味成分前體物之一，鞘氨醇單胞菌屬是芳香化合物好氧降解過程最關(guān)鍵的酶，可以在芳香化合物中不斷生長［23-24］，梗片貯存過程各取樣時間點假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬占比均高于梗條，云南B 梗和福建C 梗梗片假單胞菌屬在6～18 個月平均占比為2.68%和2.53%，梗條平均占比為0.86%和0.77%，梗片鞘氨醇單胞菌屬在6～18 個月平均占比為1.48%和1.23%，梗條平均占比為0.12%和0.27%，這將促進梗片有利香味成分的生成，加快醇化進程，更快到達感官質(zhì)量高點。

2.3 醇化后梗片和梗條所制梗絲的感官質(zhì)量對比

四段式醇化條件下，梗條和梗片制成的梗絲感官質(zhì)量評價結(jié)果見表5。結(jié)果表明，梗片制得的梗絲感官質(zhì)量綜合得分高于在相同貯存時間下梗條制得的梗絲。其中，云南梗片所制梗絲的最高分為51.5分，梗條所制梗絲的最高分為51.0分；福建梗片所制梗絲的最高分為50.5 分，梗條所制梗絲的最高分為50.0 分。梗片所制梗絲的雜氣、刺激和干凈程度等指標(biāo)優(yōu)于梗條。同時，云南梗片達到感官質(zhì)量高點的貯存時間為9個月，梗條為15個月；福建梗片達到感官質(zhì)量高點的貯存時間為6個月，梗條為12個月，表明梗片的醇化速率較梗條快，這與梗條和梗片的微生物群落分析中3 種優(yōu)勢產(chǎn)香菌屬的梗片占比較高的規(guī)律是一致的。

表5 梗條和梗片不同貯存時間的感官質(zhì)量對比Tab.5 Sensory quality scores of bar-shaped and flake-shaped tobacco stems stored for different periods

3 結(jié)論

在四段式醇化過程中，①兩種形態(tài)的煙梗含水率均略有增加，梗條含水率增加0.95百分點，梗片增加0.47百分點，梗片較梗條含水率波動小；梗條和梗片的顏色均逐漸轉(zhuǎn)深，貯存18個月梗片的色差值極差小于梗條，梗條顏色轉(zhuǎn)深程度及速率均大于梗片。因此，在四段式醇化條件下，梗片醇化過程含水率和顏色較穩(wěn)定，色差值變化小，轉(zhuǎn)深速率較低。②梗片四段式醇化過程不同形態(tài)煙梗的細菌群落優(yōu)勢菌門均為變形菌門，云南B 梗和福建C 梗共有的優(yōu)勢菌屬為鏈霉菌屬、甲基桿菌屬、假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬4 種，梗片醇化6～18 個月的OTU 數(shù)、Chao值和ACE值的平均值均大于梗條，細菌群落豐度高于梗條，其中假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和芽孢桿菌屬3種優(yōu)勢產(chǎn)香菌屬含量高于梗條，這對煙梗貯存過程品質(zhì)改善起有利作用，加快梗片醇化進度。③在煙梗四段式氣調(diào)技術(shù)醇化過程中，梗片較早出現(xiàn)感官質(zhì)量高點，醇化后采用梗片投料制得的梗絲感官質(zhì)量明顯優(yōu)于梗條制得的梗絲，主要表現(xiàn)在雜氣降低、刺激性減弱、口腔殘留較少。綜上所述，煙梗適宜采用梗片形態(tài)在四段式醇化條件下貯存，有利于提高煙梗含水率和顏色的穩(wěn)定性，增加優(yōu)勢菌屬豐度和有益菌屬占比，縮短醇化周期，改善制得梗絲的感官質(zhì)量，起到降本增效的作用。