高瑞娜

(朔州職業(yè)技術(shù)學院,山西朔州 036000)

病毒性蠶病發(fā)病率高、傳染性強、防治難度大、危害嚴重,每年因蠶病暴發(fā)造成的損失占蠶業(yè)生產(chǎn)總收入的20%左右,由家蠶核型多角體病毒、家蠶質(zhì)型多角體病毒和家蠶濃核病毒侵染引發(fā)的三大病毒病造成的損失占蠶病總損失的80%左右[1]。因病毒種類和寄生部位不同,目前生產(chǎn)上常見的病毒病主要有家蠶核型多角體病毒病(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,BmNPV)、質(zhì)型多角體病毒病(Bombyxmoricytoplasmic polyhedrovirus,BmCPV)、濃核病(Bombyxmoridensonuclopsisvirus,BmDNV)和軟化病(Bombyxmoriinfectious flacherie virus,BmFV),其中寄生于各種組織細胞核形成多角體的為核型多角體病毒,寄生于中腸細胞的細胞質(zhì)形成多角體的為質(zhì)型多角體病毒,寄生于中腸杯形細胞、中腸前段呈空頭的為軟化病病毒。濃核病病毒是從軟化病病毒分離鑒定出來的一株病毒,發(fā)病與軟化病病毒類似[2]。現(xiàn)對近十年來的家蠶病毒病的研究成果進行綜述,希望對家蠶抗性理論研究提供參考,對抗病毒藥物研發(fā)提供新的思路。

1 家蠶抗核型多角體病毒的研究

1.1 抗性品種的選育

徐安英[3-4]等人通過傳統(tǒng)的雜交技術(shù)培育了耐家蠶核型多角體病毒病蠶品種“華康2號”,并通過桑葉涂抹法添食,發(fā)現(xiàn)新選育的品種及其雜交種對BmNPV的LC50均超過1×109個/mL,高于對照組2個或3個數(shù)量級以上,充分說明了新品種對BmNPV具有很強的抵抗性。該團隊于2021年又培育出了家蠶抗血液型膿病品種華康3號,該新品種綜合性狀優(yōu)良、體質(zhì)強健、抗膿病性能強,對BmNPV多角體的LC50均超過5.41×1011個/mL,深受蠶農(nóng)和絲廠的喜愛[5]。邵榆嵐[6]等人對云南蠶區(qū)200個家蠶品系進行了抗性研究,發(fā)現(xiàn)731、795、854B、872A、966B、B黃肉色繭、P50、山河B、選二甲白和竹印為抗性品種,但大多數(shù)抗BmNPV能力屬于中等水平,其中P50為BmNPV抗性最強品種。唐蕓[7]等開展了對湖南蠶區(qū)品系洞·庭×碧·波抗血液型膿病能力的改造,并育成了1對具有很強抗血液型膿病的家蠶新品種華·康×湘·泰,通過多角體懸浮液經(jīng)口添毒試驗顯示,新品種華·康×湘·泰的各種級家蠶對BmNPV多角體的半致死濃度(LC50)值均在1×109個/m L以上,具有明顯優(yōu)勢。董戰(zhàn)旗[18]等人還對家蠶抗性品系NC99R進行口服感染和體腔注射BmNPV包涵體,研究了其抗BmNPV的分子機制。

CRISPR/Cas9介導的基因編輯已經(jīng)被證明可以通過破壞病原體的基因來有效地抑制感染[9]。西南大學的DONG Z等[10]學者構(gòu)建了表達CRISPR/Cas9的4個家蠶轉(zhuǎn)基因系和以家蠶核型多角體病毒(BmNPV)為目標的sgRNA,研究證明了Cas9(C)/sgRNA(C)轉(zhuǎn)基因系有效地編輯了家蠶核型多角體病毒(BmNPV)基因組的目標位點,并在BmNPV感染后觀察到大片段缺失。對該轉(zhuǎn)基因系的抗病毒分析也進一步表明,半致死劑量(LD50)比正常接種包涵體后的值高出1 000倍。表明CRISPR/Cas9介導的基因編輯可以更有效地靶向家蠶核型多角體病毒(BmNPV)基因組,可作為一種昆蟲抗病毒的新方法。

1.2 抗性功能基因的研究

云南農(nóng)大唐芬芬[11]等發(fā)現(xiàn)短時熱激能夠提高家蠶對BmNPV的抗性,猜測熱激蛋白基因Bmhsp25.4和抗菌肽基因Bmglve2可能在家蠶熱激響應的抗病毒免疫中發(fā)揮關聯(lián)功能。

江蘇科技大學研究團隊發(fā)現(xiàn)BmNPV可誘導上調(diào)家蠶miRNA(bmo-miR-217)的表達水平,bmo-miR-217又可顯著下調(diào)BmNPV的主要復制基因lef-1的表達,因bmo-miR-217基因表達量的變化是家蠶先天免疫的一種有效策略[12]。宋秋云[13]通過RNA干擾技術(shù)使宿主細胞BmTret1-X1基因沉默后發(fā)現(xiàn)siRNA、gp64在病毒侵染后有一定水平的表達上升,顯著促進BmNPV病毒基因的表達,這也說明BmTret1-X1基因在抗病毒方面具有一定的作用。高娟[14]等用BmNPV懸濁液浸漬的桑葉攻毒,發(fā)現(xiàn)對BmSMYD4-X1基因表達的影響作用不明顯,沒有病毒侵染誘導表達現(xiàn)象,但過表達BmSMYD4-X1基因條件下,lef-3、vp39和p10這些關鍵基因從病毒感染6 h開始出現(xiàn)表達抑制,通過RNA干擾BmSMYD4-X1對BmNPV病毒增殖效率也無明顯影響。研究者推測BmSMYD4-X1基因高表達可能是宿主家蠶對BmNPV抵抗性的分子機制之一。有研究學者通過免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)BiP在家蠶核型多角體病毒BmNPV感染的細胞中表達上調(diào),通過RNA干擾技術(shù)敲低該基因的表達后,感染效率也顯著降低。

西南大學研究團隊[16]在Bm N-SWU1細胞中過表達BmNPV核衣殼蛋白VP39,發(fā)現(xiàn)VP39會影響B(tài)mNPV的擴散,從而導致BmNPV感染細胞數(shù)目大量減少。該團隊[17]在對家蠶品系871與871C抗家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的差異及機制研究中又發(fā)現(xiàn)BmCLT-S5具有顯著抑制BmNPV復制增殖的能力。2020年,該團隊[18]又發(fā)現(xiàn)BmNPV病毒感染家蠶后,會通過增強p-Akt蛋白從而抑制BmFoxO的表達,過表達BmFoxO后會誘導BmPEPCK-2上調(diào)表達,從而促進細胞受到病毒感染后的自噬與凋亡免疫途徑,從而抑制BmNPV病毒的繁殖,降低病毒拷貝數(shù)和家蠶死亡率。

江蘇大學研究團隊[19]通過二代高通量測序技術(shù),對BmNPV抗性品系NB和感性品系306親本進行簡化基因組測序,共獲得62 185個標記,進行基因結(jié)構(gòu)分析、連鎖分析、克隆測序分析后發(fā)現(xiàn)有2個酯酶基因發(fā)生突變,添毒后24 h中腸內(nèi)膜系統(tǒng)的V-ATPase酶活性也出現(xiàn)升高,表明V-ATPase為BmNPV抗性基因。2018年,該研究團隊[20]又發(fā)現(xiàn)家蠶BmSocs2基因在抗性品系和感性品系中表達量有差異,生物信息學分析發(fā)現(xiàn)BmSocs2基因可能在Jak-STAT信號通路中發(fā)揮著重要作用。通過構(gòu)建含BmSocs2目的基因的重組真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細胞BmN,體外過表達實驗研究,結(jié)果顯示在細胞水平上家蠶BmSocs2基因確實在抗BmNPV侵染的過程中發(fā)揮了重要作用。

Hu[21]等發(fā)現(xiàn)絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A(PP2A)定位于家蠶細胞質(zhì)中,在家蠶表皮和中腸中均有高表達,家蠶核多角體病毒(BmNPV)感染可誘導其表達下調(diào),反過來通過過表達上調(diào)該基因又可顯著抑制BmNPV的增殖,通過RNA干擾和PP2A抑制劑治療下調(diào)BmPP2A,可增加BmNPV的復制。這充分說明PP2A在家蠶中具有抗病毒作用。

1.3 抗性功能蛋白的研究

廖金旭[22-23]等發(fā)現(xiàn)家蠶胸腺素BmTHY是家蠶重要的免疫因子,BmNPV感染可降低蠶體及部分組織中該基因轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)表達水平,能夠與actin互作影響微管蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,從而抑制BmNPV病毒的增殖和復制。且高劑量r Bm THY添食處理可以在一定程度上提高家蠶抗BmNPV病毒感染的能力。

陳艷萍[24]通過SDS-PAGE、生物質(zhì)譜和熒光定量PCR等技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)BmNPV感染家蠶后圍食膜蛋白質(zhì)在感染不同時期發(fā)生不同的變化。該研究室查緒樂[25]后來也證實了家蠶圍食膜因子會抑制BmNPV的增殖復制這一結(jié)論。他們通過系統(tǒng)發(fā)生分析、時空表達分析、基因敲除分析,發(fā)現(xiàn)家蠶圍食膜因子Bm001504基因在幼蟲期的中腸特異表達,而幼蟲食下感染BmNPV后該基因的表達顯著升高,過表達后感染BmNPV病毒關鍵基因ie1,vp39,p10的表達就受到抑制,家蠶幼蟲感染BmNPV后的存活率也顯著升高。

沙雷氏菌和多角體病毒本都是蠶的致病微生物,但西南大學研究團隊卻發(fā)現(xiàn)了沙雷氏菌分泌的一種次生代謝產(chǎn)物靈菌紅素prodigiosin具有抑制多角體病毒的作用,有抗病毒活性,能顯著地抑制子代病毒BV的產(chǎn)生,對BmNPV極早期基因ie-1、晚期基因vp39和極晚期基因p10的轉(zhuǎn)錄均有強烈的抑制作用,還可有效抑制BmNPV介導的膜融合。

1.4 表觀遺傳學的研究

高旭[27]通過q PCR以及WB檢測顯示家蠶感染BmNPV后,糖酵解途徑中的果糖-1,6-二磷酸醛縮酶Bm ALDO K42的乙?；贒NA復制水平和蛋白質(zhì)水平顯著促進了病毒的增殖。2-脫氧葡萄糖(2-DG)是己糖激酶的抑制劑,能抑制細胞糖酵解在DNA復制水平和蛋白質(zhì)水平,顯著抑制了病毒的增殖。

黃昊凌[28]用家蠶細胞感染BmNPV 48-96 h后可誘導DNA甲基化酶(Dnmt)基因的表達,通過甲基化酶抑制劑Zeb作用后,顯著降低了BmNPV滴度、BmNPV核衣殼蛋白39(VP39)的表達水平和BmNPVie-1及l(fā)ef-3基因的拷貝數(shù),同時對抗凋亡基因iap1的表達也有抑制作用。說明抑制DNA甲基化酶可以抑制BmNPV的增殖。

陳曦[29]等利用Red重組技術(shù)和Bac-to-Bac系統(tǒng)分別構(gòu)建lef-6敲除型(lef-6-KO-Bacmid)和補回型(lef-6-RE-Bacmid)的病毒,再利用定點突變技術(shù)將賴氨酸(K)突變?yōu)楣劝滨０?Q)模擬乙?；揎?將賴氨酸(K)突變?yōu)榫彼?R)模擬去乙酰化修飾,利用實時熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)分析病毒基因組的復制情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)lef-6-KO-Bacmid型病毒基因組拷貝數(shù)顯著下降,2個賴氨酸位點的乙?；揎棇Σ《净蚪M復制也具有顯著抑制作用(P<0.01),而去乙?；揎棝]有顯著影響;病毒增殖能力檢測和滴度分析結(jié)果也顯示乙?；揎椏梢燥@著抑制病毒活力,降低子代病毒的產(chǎn)量;LEF-6乙?；揎棇Σ《就砥诨騰p39轉(zhuǎn)錄具有顯著抑制作用。

2 家蠶抗質(zhì)型多角體病毒的研究

近年有研究對質(zhì)型多角體病毒也做了大量的實驗,發(fā)現(xiàn)了兩個抗CPV的候選基因BmPGRP-S2和BmSCP1[30],其中BmPGRP-S2的增量表達可以通過激活Imd通路誘導抗菌肽基因升高,繼而提高家蠶抗BmCPV能力,同時還不會影響家蠶的經(jīng)濟性狀;而BmSCP1在感染初期就能抑制病毒,增量表達也不會影響家蠶的主要經(jīng)濟性狀。彭正文[31]等人通過串聯(lián)干涉病毒多個基因的方法制備了對BmCPV具有潛在抗性的轉(zhuǎn)基因家蠶品系,而且該品系沒有影響到家蠶的經(jīng)濟效益,還提高了家蠶抗性。也有學者[32]發(fā)現(xiàn)中腸細胞自噬在CPV病毒感染的早期具有一定的調(diào)節(jié)作用。

3 家蠶抗?jié)夂瞬〔《镜难芯?/h2>

有研究[33]將家蠶品系798感染BmBDV后,發(fā)現(xiàn)6個常見的家蠶抗病毒基因轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著變化,而在其他品系中有上調(diào)或下調(diào)現(xiàn)象。說明家蠶品系798是抗家蠶BmBDV品系。

而通過高通量測序技術(shù),發(fā)現(xiàn)家蠶品種JS口服感染BmBDV-ZJ的數(shù)字基因表達譜中,差異表達的基因絕大多數(shù)屬于KEGG路徑中和細胞質(zhì)中DNA識別通路,其中編碼RNA聚合酶III的基因有9個[34],這些基因都將成為后續(xù)研究的基礎。

關于家蠶抗軟化病病毒的研究甚少,這里不再進行綜述。

4 家蠶抗病毒病的研究趨勢

綜上所述,已經(jīng)有大量的工作分別從抗性品系選育、基因、蛋白質(zhì)、表觀遺傳上對家蠶抗性進行了研究,也鑒定出了多個抗性品系和多個可能起抗病毒作用的基因和蛋白質(zhì),為最終解釋家蠶抗病毒機制提供了重要的資料。但有的研究僅在基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)變化就認為該基因是抗病毒基因,并沒有用相應的蛋白水平進行驗證;但也有研究應用了多種技術(shù)進行了基因-蛋白相互驗證。因此,接下來的研究應該運用多種技術(shù)從基因和蛋白水平研究,證實篩選的基因或蛋白與家蠶抗性的相關性,確認其抗病毒功能。另外再通過 CRISPR/Cas9等技術(shù),找到抗性基因或蛋白的上、下游作用因子,弄清楚家蠶抗病毒的詳細機制,為抗病毒藥物、抗病毒疫苗的研發(fā)提供新的思路。