舒良銀,易思雷,舒 琴,張小強(qiáng),金 蘋(píng),唐根云,2,3

(1.湖南醫(yī)藥學(xué)院,湖南 懷化 418000; 2.侗醫(yī)藥研究湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 懷化 418000; 3.腦與神經(jīng)內(nèi)分泌疾病湖南省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 懷化 418000)

0 引言

黃蠟果(StauntoniabrachyantheraHand.-Mazz)為木通科野木瓜屬植物,常生長(zhǎng)于海拔400～1 400 m的山地雜木林中[1],產(chǎn)于湖南、貴州、廣西等地區(qū)[2]。果實(shí)的形態(tài)與三葉木通較為相似,果皮成熟時(shí)為黃色,平滑或稍具小疣凸,相比于三葉木通略微小[3]。人們通常將其當(dāng)作預(yù)知子藥用。湖南侗藥稱(chēng)之為“豬腰子”[4],用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷、小便淋痛、月經(jīng)不調(diào)等癥的治療[5]。學(xué)者對(duì)黃蠟果葉[6]、根[7]、果實(shí)[8]、種子[9]、果皮[3]、藤莖[10]的化學(xué)成分均有研究,其主要成分為皂苷類(lèi)及黃酮類(lèi)化合物,但對(duì)黃蠟果的總皂苷研究較少。本研究對(duì)黃蠟果不同部位的總皂苷含量進(jìn)行測(cè)定。采集湖南省懷化市中方縣的黃蠟果葉、藤莖、根3個(gè)不同部位的藥材,干燥粉碎,采用超聲輔助萃取法,從中萃取出浸膏,利用D101大孔樹(shù)脂對(duì)黃蠟果浸膏的總皂苷進(jìn)行富集,并對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。從定量角度客觀評(píng)價(jià)黃蠟果不同部位總皂苷含量的差異,所建立的黃蠟果總皂苷含量測(cè)定方法可為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器、材料與方法

1.1 儀器

AUW120D 型電子分析天平(日本島津有限公司生產(chǎn)),MY-50分級(jí)連續(xù)投料粉碎機(jī)(廣州市揚(yáng)鷹醫(yī)療儀器有限公司生產(chǎn)),DZKW-S-8 電熱恒溫水浴鍋(北京市光明醫(yī)療儀器有限公司生產(chǎn)),L53R 醫(yī)用離心機(jī)(長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)有限公司生產(chǎn)), KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)),紫外分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司生產(chǎn))。

1.2 材料

黃蠟果藥材采集于懷化市中方縣,由湖南醫(yī)藥學(xué)院汪冶教授鑒定并保存于湖南醫(yī)藥學(xué)院。齊墩果酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院提供,110709-201808)。提取與分離純化及紫外分光光度儀測(cè)定使用的試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 黃蠟果總皂苷的制備

取湖南省懷化市地區(qū)的黃蠟果葉(2.009 5 g)、藤莖(2.004 0 g)、根(2.004 2 g)粗品,干燥,打成粉末,過(guò)16目篩,按物料比25∶1加入70%乙醇,50 ℃超聲萃取5次至萃取液無(wú)色。將萃取液減壓干燥得到浸膏,將浸膏加入正丁醇超聲萃取5次至無(wú)色得總浸膏。將總浸膏用50 mL的40%乙醇溶解,加入4 g氧化鎂加熱回流1 h過(guò)濾,減壓濃縮,氮吹干燥,得葉總皂苷(0.222 6 g)、藤莖總皂苷(0.121 9 g)、根總皂苷(0.155 3 g)。

1.3.2 黃蠟果總皂苷含量的測(cè)定

1)對(duì)照品溶液的制備。取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品0.008 0 g定容于100 mL容量瓶中,得0.08 mg/mL齊墩果酸對(duì)照品溶液。

2)供試品溶液的制備。分別取根、藤莖、葉總皂苷的根(0.009 5 g)、藤莖(0.006 4 g)、葉(0.008 1 g),精密移取1.000 mL甲醇加熱超聲,使其完全溶解,得供試品溶液根(9.5 mg/mL)、藤莖(6.4 mg/mL)、葉(8.1 mg/mL)。

3)吸光度吸收曲線制備。精密吸取0.08 mg/mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.625 mL加入具塞試管中,揮干溶劑,加入新制5%香草醛-冰乙酸0.2 mL,再加入0.8 mL高氯酸溶液,在70 ℃水浴中加熱15 min,取出,流水冷卻10 min,使之反應(yīng)完全。加入4 mL乙酸乙酯,搖勻進(jìn)行紫外460～800 nm波長(zhǎng)掃描得吸收曲線,如圖1所示。

圖1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度曲線Fig.1 Absorption curve of oleanolic acid standard solution

4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。分別精密吸取0.08 mg/mL的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.062 6 mL、0.125 mL、0.25 mL、0.375 mL、0.5 mL、0.625 mL、0.75 mL加入具塞試管中,揮干溶劑,加入新制5 %香草醛-冰乙酸0.2 mL,再加入0.8 mL高氯酸溶液,在70 ℃水浴中加熱15 min,取出,流水冷卻10 min,使之反應(yīng)完全。加入4 mL乙酸乙酯,搖勻,在561 nm下對(duì)其分別進(jìn)行測(cè)定,將測(cè)定的吸光度進(jìn)行線性回歸計(jì)算,如表1所示,得線性回歸方程,如圖2所示。

表1 線性回歸方程數(shù)據(jù)Tab.1 Linear regression equation data

圖2 線性回歸方程圖Fig.2 Linear regression equation

2 結(jié)果與分析

2.1 總皂苷含量方法學(xué)考察

1)重復(fù)性試驗(yàn)。分別取葉、藤莖、根供試液樣品6份,每份50 uL,按“1.3”中的方法操作得吸光度,計(jì)算RSD值,如表2、表3、表4所示。RSD分別為 1.85%、1.41%、1.11%,表明該方法重復(fù)性良好。

表2 葉重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Tab.2 Leaf repeatability test

表3 藤莖重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Tab.3 Vine stem repeatability test

表4 根重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Tab.4 Root repeatability test

2)精密度試驗(yàn)。對(duì)照品按“1.3”中的方法重復(fù)操作6次,根據(jù)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行精密度計(jì)算,算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),判斷方法儀器精密度,如表5所示。RSD為0.79 %,證明該試驗(yàn)條件下精密度良好。

表5 精密度實(shí)驗(yàn)Tab.5 Precision test

3)穩(wěn)定性試驗(yàn)。分別精密吸取葉、藤莖、根供試品溶液50 μL,按“1.3”中的方法操作,每隔3 min測(cè)定一次吸光度值變化,計(jì)算RSD值,如表6、表7、表8所示。葉、藤莖、根供試品的吸光度RSD分別為 0.67%、0.96%、0.60%,表明葉、藤莖、根的供試品溶液在15 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表6 葉穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Tab.6 Leaf stability test

表7 藤莖穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Tab.7 Vine stem stability test

表8 根穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Tab.8 Root stability test

4)加樣回收實(shí)驗(yàn)。分別吸取葉、藤莖、根50 μL的供試品溶液,加入0.3 mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,按“1.3”中的方法操作計(jì)算其含量,計(jì)算其回收率,如表9、表10、表11所示。平均值分別為 97.45%、98.75%、97.91%。

表9 葉加樣回收實(shí)驗(yàn)Tab.9 Adding sample recovery test of leaf

表10 藤莖加樣回收實(shí)驗(yàn)Tab.10 Adding sample recovery test of stem

表11 根加樣回收實(shí)驗(yàn)Tab.11 Adding sample recovery test of root

2.2 紫外分光光度法測(cè)定總皂苷含量

分別取葉、藤莖、根供試品溶液50 μL,按“1.3”中的方法操作計(jì)算其含量,如表12、表13、表14所示,葉、藤莖、根的平均含量分別為0.701%、0.420 3%、0.493 7%。

表12 葉皂苷含量測(cè)定Tab.12 Saponin content of leaf determination test

表13 藤莖皂苷含量測(cè)定Tab.13 Saponin content of vine stem determination test

表14 根皂苷含量測(cè)定Tab.14 Saponin content of root determination test

3 討論與結(jié)論

侗藥黃蠟果總皂苷可以單獨(dú)或與其他藥物組合作為原料藥用于抗腫瘤、抗炎、利尿及相關(guān)疾病治療的藥劑中[11]。通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂富集皂苷并對(duì)總皂苷進(jìn)行純化,采用紫外分光光度法,測(cè)定黃蠟果不同部位總皂苷含量并進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),葉總皂苷含量顯著高于藤莖和根的含量。結(jié)果表明,利用分光光度法測(cè)定總皂苷的方法要求各項(xiàng)內(nèi)容良好,可用于黃蠟果總皂苷含量測(cè)定并進(jìn)行比較。該方法簡(jiǎn)單、快速,可用于其他藥材皂苷的含量測(cè)定及比較,可為黃蠟果的定性分析與質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)支撐及參考方法。