李張暉,尚禹行,呂巧怡,王薈,趙楊靜,邵啟祥,2(.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 2203;2.江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院,江蘇淮安 223005)

近年來泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病率逐年攀升,已成為研究關(guān)注的熱點(diǎn)問題。信使RNA(mRNA)內(nèi)部修飾包括腺苷甲基化、胞嘧啶修飾和核糖修飾等,其中N-甲基腺苷(m6A)是真核mRNA中最常見的修飾[1]。m6A的修飾依賴于一系列酶,包括催化mRNA的m6A修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶即寫入蛋白(Writers)、去除m6A修飾的去甲基化酶即擦除蛋白(Erasers)和識別m6A修飾位點(diǎn)m6A結(jié)合蛋白即閱讀蛋白(Readers)[2]。它們在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中各自發(fā)揮重要作用(圖1)。

圖1 m6A修飾相關(guān)分子組成示意圖

非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)存在眾多種類,且具有不同功能。目前研究最多的有微小RNA(microRNA,miRNA)、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,LncRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)和PIWI相互作用RNA(PIWI-interacting RNA,piRNA)等[3]。既往m6A修飾的研究多集中在mRNA領(lǐng)域,而ncRNAs和mRNA均為轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物,存在相似的修飾方式。近年來的研究表明,m6A修飾調(diào)控ncRNA參與了個(gè)體發(fā)育,且在多種腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。本文重點(diǎn)闡述了m6A修飾調(diào)控ncRNA在泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中的診斷價(jià)值,并簡要概述應(yīng)用于m6A甲基化檢測的新技術(shù)及生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)方法。

1 女性生殖系統(tǒng)腫瘤

1.1宮頸癌(cervical cancer,CCA) 通常CCA的早期篩查有巴氏涂片(pap smear)與人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)檢查。雖然HPV的感染被認(rèn)為是CCA的主要致病因素,但許多研究發(fā)現(xiàn)HPV感染本身并不足以導(dǎo)致癌癥,約60%的HPV感染在1年內(nèi)自發(fā)消退,約90%在2年內(nèi)消退[4]。截至目前,CCA的致病因素仍然不明確。

近年來,隨著測序技術(shù)發(fā)展和表觀遺傳研究的深入,有研究發(fā)現(xiàn)在CCA中m6A修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶(METTL3)高表達(dá)增強(qiáng)了HK2mRNA的穩(wěn)定性,加速糖酵解或有氧糖酵解(Warburg效應(yīng)),從而促進(jìn)CCA細(xì)胞的增殖。在此過程中,METTL3可招募m6A修飾中的閱讀蛋白YTHDF1,增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性,并協(xié)助METTL3與HK2mRNA結(jié)合[5]。m6A修飾通過調(diào)控ncRNA,影響下游靶基因或者信號通路,從而促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。對于CCA中miR-193b表達(dá)下調(diào)的原因可能是METTL3改變了pri-miR-193b的m6A水平,影響了miR-193b的成熟過程[6]。METTL3通過結(jié)合m6A閱讀蛋白和調(diào)控ncRNA兩種途徑調(diào)控CCA的發(fā)生、發(fā)展,有望成為CCA新的診斷標(biāo)志物。

1.2子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer,EC) EC最常見的癥狀是異常子宮內(nèi)出血,宮腔鏡下的活檢仍然是診斷EC的“金標(biāo)準(zhǔn)”。近年來,EC的發(fā)生與甲基化研究多與DNA甲基化調(diào)控miRNA基因啟動(dòng)子密切相關(guān),研究表明miR-192-5p啟動(dòng)子甲基化水平與FIGO分期呈顯著正相關(guān),而其啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化會(huì)導(dǎo)致miR-192-5p沉默,并誘導(dǎo)ALX1(aristaless-like homeobox l)過表達(dá),從而促進(jìn)EC進(jìn)展[7]。

最近研究發(fā)現(xiàn)m6A閱讀蛋白YTHDF2在EC中的表達(dá)顯著上調(diào),YTHDF2與IRS1轉(zhuǎn)錄本P3 m6A修飾結(jié)合,抑制IRS1表達(dá),從而抑制AKT/MMP9信號通路,進(jìn)而降低EC細(xì)胞的侵襲和遷移能力[8]。在另一項(xiàng)研究中,Shen等[9]發(fā)現(xiàn)YTHDF2可調(diào)控LncRNA FENDRR在EC組織中的表達(dá),其經(jīng)RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP) 試驗(yàn)與RNA pull down試驗(yàn)證實(shí)LncRNA FENDRR可被m6A閱讀蛋白YTHDF2特異性識別,敲低YTHDF2有效降低了LncRNA FENDRR的降解,進(jìn)而減緩了腫瘤細(xì)胞的增殖。綜上,YTHDF2在EC中對AKT/MMP9信號通路和LncRNA FENDRR的調(diào)控有望成為EC治療的新靶點(diǎn)。

1.3卵巢癌(ovarian cancer,OC) OC是女性生殖系統(tǒng)中第三大常見癌癥,其早期診斷標(biāo)志物匱乏,臨床上多采用CA125和HE4聯(lián)合檢測,但特異性不高,尋找新的診斷標(biāo)志物迫在眉睫。一項(xiàng)體外試驗(yàn)證明,沉默METTL3可上調(diào)miR-126-5p表達(dá),并可通過抑制PTEN蛋白的表達(dá),從而阻斷PI3K/Akt/mTOR通路,減緩OC的進(jìn)展[10]。Cui等[11]研究發(fā)現(xiàn)METTL3不僅影響了LncRNA RHPN1-AS1的穩(wěn)定性,而且可上調(diào)LncRNA RHPN1-AS1的表達(dá),增強(qiáng)其在順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞中的m6A修飾水平。在卵巢癌中,將METTL3作為診斷標(biāo)志物或可提高診斷特異性。

2 男性生殖器官腫瘤

前列腺癌(prostate cancer,PCa) 是我國老年男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤,血清前列腺特異性抗原(prostate specific antigen,PSA)篩查是目前我國使用最廣泛、臨床認(rèn)可度較高的篩查PCa方法之一,但PSA存在檢測灰區(qū)(4～10 ng/mL),良性增生及外因損傷同樣會(huì)導(dǎo)致其升高,進(jìn)而降低檢測準(zhǔn)確性。

Jiang等[12]研究發(fā)現(xiàn),LINC00673與Krueppel樣因子4(Kruppel-like factor 4,KLF4)基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,將甲基轉(zhuǎn)移酶招募到KLF4基因啟動(dòng)子區(qū),沉默LINC00673可降低KLF4基因啟動(dòng)子甲基化,從而提高KLF4蛋白的表達(dá),抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和化療抵抗。表明LINC00673作為促進(jìn)PCa增殖的LncRNA,可被視為未來PCa治療的靶點(diǎn)。

3 泌尿系統(tǒng)腫瘤

3.1膀胱癌(bladder cancer,BCA) BCA是最常見的泌尿道惡性腫瘤,目前缺乏早期的診斷標(biāo)志物是BCA防治遇到的困境。研究證實(shí)甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL14介導(dǎo)m6A修飾,并可通過促進(jìn)LncRNA DBET的表達(dá),使其與FABP5相互作用,激活PPAR信號通路,促進(jìn)了BCA的惡性進(jìn)展[13-14]。在另一項(xiàng)研究中,研究者通過熒光素酶報(bào)告基因測定和m6A RIP檢測發(fā)現(xiàn),METTL3調(diào)控miR221/222的成熟,導(dǎo)致PTENmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低,在膀胱癌中發(fā)揮致癌作用[15]。METTL14和METTL3的出現(xiàn)有望成為BCA診斷標(biāo)志物。

3.2腎細(xì)胞癌(renal cell adenocarcinoma,RCC) RCC好發(fā)于60～70歲的男性,同樣RCC缺乏早期的特異性診斷標(biāo)志物。MiR-501-3p是腎細(xì)胞癌的潛在抑制因子,在癌性腎細(xì)胞和組織中通常被下調(diào)。既往研究表明,腎母細(xì)胞瘤1相關(guān)蛋白(Wilms tumor 1 associated protein,WTAP)是miR-501-3p的靶基因。敲低WTAP基因與miR-501-3p過表達(dá)類似,均可有效抑制RCC的發(fā)生,在此情況下RCC細(xì)胞中m6A修飾的水平均降低[16]。亦有研究發(fā)現(xiàn)miR-155直接結(jié)合至脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白質(zhì)(fat mass and obesity-associated protein,FTO) mRNA的3′-UTR上,并且降低了腎細(xì)胞癌細(xì)胞中FTO蛋白的水平,過表達(dá)miR-155可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖和整體mRNA m6A修飾水平,同時(shí)以FTO依賴的方式抵抗凋亡[17]。miR-501-3p和miR-155或許可以成為RCC的特異性診斷標(biāo)志物。

4 其他生殖泌尿系統(tǒng)腫瘤

4.1外陰癌(vulvar cancer,VC) VC按組織學(xué)形態(tài)可分為鱗狀上皮細(xì)胞癌、疣狀癌、腺癌、惡性黑色素瘤、基底細(xì)胞癌及外陰佩吉特病(paget disease of vulva,PDV)。其中外陰鱗狀上皮細(xì)胞癌(vulvar squamous cell carcinoma,VSCC)占比為80%～90%,其好發(fā)于60歲以上的女性群體中。VSCC的發(fā)病因素主要有高危HPV依賴途徑、非HPV依賴途徑、地衣硬化和TP53基因突變。VSCC發(fā)病率僅為0.02‰,屬于罕見病,目前關(guān)于VSCC預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物的研究非常有限[18-19]。

目前病理檢測尚無法解析VSCC與外陰硬化苔蘚病(vulvar lichen sclerosus,VLS)、高級別外陰上皮內(nèi)瘤變(vulvar intraepithelial neoplasia,VIN)之間的風(fēng)險(xiǎn)因素。意大利費(fèi)拉拉大學(xué)的一項(xiàng)研究表明,干擾素調(diào)節(jié)因子6(interferon regulatory factor 6,IRF6)調(diào)節(jié)VLS向VSCC的發(fā)展,IRF6啟動(dòng)子的甲基化可能是VLS患者癌癥風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志之一。在另一項(xiàng)關(guān)于視黃酸受體β(retinoic acid receptor β,RARβ)介導(dǎo)VLS向VSCC轉(zhuǎn)化的研究中發(fā)現(xiàn),高甲基化誘導(dǎo)的RARβ表達(dá)下調(diào)與VLS-VSCC相關(guān),并與c-Jun上調(diào)相關(guān)。RARβ啟動(dòng)子甲基化程度隨VLS-VSCC惡性程度的增加而增加。因此,RARβ基因異?？赡茉赩LS-VSCC的進(jìn)展中發(fā)揮作用,RARβ啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)可作為VLS-VSCC患者臨床治療的預(yù)后標(biāo)志物[20]。

4.2睪丸癌(testicular cancer,TC) TC現(xiàn)有的血清腫瘤標(biāo)志物包括α胎蛋白(α feta protein,AFP)、人絨毛膜促性腺激素β鏈(β chain human chorionic gonadotrophin,β-HCG)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)等,均對TC的檢測敏感性較低,在精原細(xì)胞瘤中的敏感性僅為20%?，F(xiàn)階段,基于TC均質(zhì)性樣本中ncRNA的檢測分析有望成為其潛在的生物學(xué)標(biāo)志物,部分前瞻性多中心臨床研究發(fā)現(xiàn),miR-371a-3p、miR-302/367在睪丸腫瘤和健康睪丸組織中的表達(dá)水平存在顯著差異,且敏感性和特異性均超過傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物[21-22]。

睪丸生殖細(xì)胞瘤(germinal cell tumor of testis,TGCT)占TC病例的90%以上,TCGT的發(fā)病具有顯著的地域差異,因放化療產(chǎn)生的生殖毒性可導(dǎo)致患者生殖功能受損,所以獲得了較高的關(guān)注度。TCGT表觀遺傳學(xué)方面的研究主要集中在DNA甲基化領(lǐng)域,特別是近年來關(guān)于ncRNA與生殖細(xì)胞分化相關(guān)基因調(diào)控有關(guān)的報(bào)道日趨增多,有望成為TGCT病程進(jìn)展及治療敏感性的監(jiān)測指標(biāo)[23]。

4.3陰莖癌(penile carcinoma,PeCa) PeCa較為罕見,治療及檢測方法在過去20年間的發(fā)展有限,其表觀遺傳機(jī)制相關(guān)的報(bào)道則更為少見,目前針對小樣本范圍內(nèi)特定基因的研究顯示ncRNA具有診斷潛能[24]。

張嘉宜等[25]通過回顧性分析發(fā)現(xiàn)miRNA-107是陰莖保留術(shù)預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素,可作為陰莖保留術(shù)預(yù)后的重要分子標(biāo)志物,組織學(xué)分級與miRNA-107高表達(dá)的陰莖保留患者預(yù)后較差。miRNA-107具有成為PeCa診斷標(biāo)志物的潛力。表1匯總了泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤有關(guān)的m6A-ncRNA。

表1 泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤m6A-ncRNA文獻(xiàn)匯總

5 m6A檢測技術(shù)及生物信息學(xué)應(yīng)用

5.1m6A檢測技術(shù)的研究進(jìn)展 目前檢測m6A的技術(shù)主要包括以下4大類型:基于抗體鑒定m6A位點(diǎn),基于酶法鑒定m6A位點(diǎn),基于化學(xué)法確定m6A位點(diǎn)和基于直接RNA測序鑒定m6A位點(diǎn)。

5.1.1基于抗體鑒定m6A位點(diǎn)原理的技術(shù) 主要包括甲基化RNA免疫沉淀測序(methylated RNA immunoprecipitation sequencing,MeRIP-seq)和m6A單核苷酸分辨率紫外交聯(lián)沉淀(m6A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation,miCLIP-seq)。二者前期RNA富集步驟與免疫沉淀試驗(yàn)(Immunoprecipitation,IP)類似,相比于miCLIP-seq,MeRIP-seq只能檢測到100～200個(gè)核苷酸長度的m6A修飾區(qū),而miCLIP-seq的分辨率可達(dá)到單核苷酸,并且miCLIP-seq可以在同一峰值內(nèi)檢測多個(gè)m6A位點(diǎn),重復(fù)性也比MeRIP-seq要高[26]。

5.1.2基于酶法鑒定m6A位點(diǎn)原理的技術(shù) 主要包括m6A敏感的RNA內(nèi)切酶促進(jìn)測序(m6A-sensitive RNA-endoribonuclease-facilitated sequencing,m6A-REF-seq)和MAZFER-seq。二者利用核大腸埃希菌毒素和RNA內(nèi)切核糖核酸酶MazF的能力,特異性切割5′末端未甲基化的ACA基序,從而保留甲基化ACA基序完整。該方法具有精度高和RNA起始需求量少的特點(diǎn),但是由于MazF酶在5′-UTR只對ACA基序有特異性,因此只能識別出16%～25%的甲基化位點(diǎn)[27]。

5.1.3基于化學(xué)法確定m6A位點(diǎn)原理的技術(shù) 主要包括m6A-label-seq和m6A-SEAL-seq(m6A selective chemical labelling sequencing)。m6A-label-seq通過標(biāo)記整個(gè)轉(zhuǎn)錄組RNA的m6A位點(diǎn),并將其轉(zhuǎn)化為N6-烯丙基腺嘌呤(N6 allyl adenine,a6A),在逆轉(zhuǎn)錄過程中引入堿基突變,可以實(shí)現(xiàn)m6A的單堿基分辨率檢測。m6A-SEAL-seq通過去甲基酶FTO將m6A轉(zhuǎn)化為N6-羥甲基腺嘌呤(N6 hydroxymethyladenine,dm6A),在m6A位點(diǎn)標(biāo)記生物素,通過鏈霉親和素珠捕獲,用高通量測序技術(shù)對富集m6A修飾的RNA片段進(jìn)行m6A檢測[28]。

5.1.4基于直接RNA測序鑒定m6A位點(diǎn)原理的技術(shù) 主要指第三代測序,包括Oxford公司的Nanopore和Pacific Biosciences公司的 Single Molecule Real-Time(SMRT)技術(shù)。SMRT技術(shù)的原理是將DNA聚合酶和模板結(jié)合,用熒光標(biāo)記4種堿基,在堿基配對階段,根據(jù)熒光的波長與峰值可判斷堿基類型。Nanopore的原理是基于電信號而不是光信號的測序技術(shù),該技術(shù)采用一種特殊的納米孔,當(dāng)DNA堿基通過納米孔時(shí),電荷發(fā)生變化,因每種堿基所影響的電流變化幅度不同,通過檢測到電流變化,從而鑒定所通過的堿基。SMRT技術(shù)的原理是將DNA聚合酶和模板結(jié)合,用熒光標(biāo)記4種堿基,在堿基配對階段,根據(jù)熒光的波長與峰值可判斷堿基類型[29]。

綜上所述,基于化學(xué)法確定m6A位點(diǎn)的技術(shù)雖然不需要與抗體結(jié)合直接識別m6A位點(diǎn),并且可以以更高的分辨率鑒定m6A位點(diǎn),但缺乏化學(xué)計(jì)量信息;第三代測序成本過高;基于酶法鑒定m6A位點(diǎn)的技術(shù)雖然效率高,但特異性低。綜合考慮成本和效率,與其他方法相比,盡管MeRIP-seq具有重復(fù)性低的缺點(diǎn),但它仍然被大多數(shù)研究機(jī)構(gòu)采用[26]。

5.2生物信息學(xué)的應(yīng)用 隨著生物信息學(xué)分析方法日趨成熟,越來越多的研究者貢獻(xiàn)了包括基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)、cistromics、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等具有研究價(jià)值的臨床數(shù)據(jù),各具特色的腫瘤數(shù)據(jù)庫逐步完善,促進(jìn)了泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤領(lǐng)域的開拓探索。Dasgupta等[30]通過二代測序發(fā)現(xiàn)VSCC中存在195個(gè)高甲基化狀態(tài)基因,且證實(shí)多數(shù)高甲基化基因參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性。Singh等[31]通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),LncRNA-H19在神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌(neuroendocrine prostate cancer,NEPC)中豐度增加,沉默LncRNA-H19可恢復(fù)NEPC對雄激素剝奪療法(androgen deprivation therapy,ADT)的敏感性,LncRNA-H19水平與接受ADT患者的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移相關(guān)。Thuijs等[32]采用定量多重甲基化特異性PCR(quantitative multiple methylation-specific PCR,M-MSP)檢測了患者VSCC、癌旁VIN組織、VIN隨訪期無進(jìn)展及正常外陰組織的12個(gè)甲基化相關(guān)標(biāo)志物,結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲基化水平隨病程進(jìn)展顯著升高,外陰癌變與DNA甲基化水平呈正相關(guān),具備預(yù)測VIN向VSCC發(fā)展的潛能。Cheng等[33]在前列腺癌組織與癌旁組織間篩選出48個(gè)與總生存(overall survival,OS)相關(guān)的甲基化CpG位點(diǎn),采用最小絕對收縮和選擇算子(least absolute shrinkage and selection operator,LASSO)進(jìn)一步縮小至16個(gè)CpG位點(diǎn)并建立了風(fēng)險(xiǎn)評分公式,為PeCa預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物的選擇提供了新的研究思路。

6 結(jié)語

泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的研究受限于癌癥種類、發(fā)病率及樣本數(shù)量,出現(xiàn)了明顯的兩極分化現(xiàn)象,對于泌尿道罕見惡性腫瘤,其表觀遺傳學(xué)的研究不足,導(dǎo)致潛在診斷標(biāo)志物的篩選困難。對于常見泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤而言,例如AFP、PSA、β-hCG及LDH等經(jīng)典生物學(xué)標(biāo)志物在臨床應(yīng)用廣泛,但它們的敏感性和特異性并不理想,導(dǎo)致在癌種的覆蓋范圍上仍然較為局限。CCA、EC的相關(guān)研究已經(jīng)初步揭示了表觀遺傳變化,如DNA甲基化、m6A甲基化調(diào)控ncRNA等,均具有診斷、監(jiān)測腫瘤發(fā)生、耐藥及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的潛能;在PCa的相關(guān)研究中,m6A相對比經(jīng)典生物學(xué)標(biāo)志物的準(zhǔn)確性更高,這些研究或有望顛覆該領(lǐng)域現(xiàn)有的診斷路徑和方法。但總體生殖泌尿系統(tǒng)腫瘤的m6A RNA修飾研究還處于探索階段,未來應(yīng)對m6A的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究,將m6A與臨床經(jīng)典生物學(xué)標(biāo)志物聯(lián)合分析患者的預(yù)后,開發(fā)探索特異性和靈敏度更高的m6A檢測技術(shù),為臨床的精準(zhǔn)診斷和治療提供更多更可靠的依據(jù)。