金瀟,秦應(yīng)祥,羅凱

(中國(guó)科學(xué)院大學(xué)重慶仁濟(jì)醫(yī)院1.眼科,2.藥劑科,重慶 400000)

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)在氧化還原代謝中發(fā)揮核心作用,煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶1(nicotinamide nucleotide adenylyltransferase 1,NMNAT1)還可作為許多酶的底物,包括SIRTs、PARPs、CD38、CD157 和 SARM1等,與衰老、細(xì)胞增殖、免疫、神經(jīng)變性、分化和發(fā)育等多種生物學(xué)過(guò)程有關(guān)[1-5]。在哺乳動(dòng)物組織中,視網(wǎng)膜似乎特別依賴(lài)于適量的NMNAT1來(lái)維持細(xì)胞生存和發(fā)揮生理功能[6-8]。NMNAT1是一種高度保守蛋白,可催化煙酰胺單核苷酸(NMN)或煙酸單核苷酸(NaMN)的腺苷?；饔靡孕纬蒒MNAT1,這是所有哺乳動(dòng)物NMNAT1生物合成途徑的關(guān)鍵步驟[9-10]。目前NMNAT1的多種超出其在氧化還原代謝中典型作用的功能受到了廣泛的關(guān)注,本實(shí)驗(yàn)旨在探討NMNAT1對(duì)小鼠視網(wǎng)膜中心碳代謝過(guò)程的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型

NMNAT1fl/fl小鼠(維通利華)與野生型 129/SV-E小鼠(維通利華)充分回交。將NMNAT1fl/fl小鼠與Six3啟動(dòng)子下表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠(Six3-Cre)雜交,獲得條件敲除小鼠[11]。雜交產(chǎn)生雜合的Nmnatfl/wt和Six3-Cre Nmnatfl/wt后代,它們與NMNAT1fl/fl小鼠進(jìn)一步雜交以產(chǎn)生接近孟德?tīng)柋嚷实臈l件敲除(Six3-Cre Nmnatfl/fl)和同窩對(duì)照(NMNAT1fl/fl)小鼠。實(shí)驗(yàn)小鼠定期與野生型129/SV-E小鼠回交以保持遺傳完整性。將實(shí)驗(yàn)小鼠維持在標(biāo)準(zhǔn)的12 h光照/黑暗循環(huán)下,提供充足的食物和水。

使用來(lái)自耳部穿刺活檢的基因組DNA,通過(guò)PCR對(duì)小鼠進(jìn)行基因分型。Six3-Cre引物:5′-GCCCTGGCAGTGTCTTAG-3′;5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。NMNAT 1引物:5′-CCTTGTACCTGACCATGTCAACA-3′;5′-CCTGGGAGGCATAGACCATGTA-3′。引物以0.75 μmol·L-1的終濃度添加到PCR反應(yīng)中。熱循環(huán)條件為95 ℃ 2 min,隨后完成35個(gè)熱循環(huán)(95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s),最后延伸步驟72 ℃ 5 min。

1.2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)靶向代謝組學(xué)

在出生后第4天,對(duì)NMNAT1敲除組和空白對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜組織中的涉及基本生化途徑的112種細(xì)胞代謝物的含量水平進(jìn)行量化。將小鼠用斷頸法處死后摘除眼球,將視網(wǎng)膜解剖后置于漢克平衡鹽溶液(HBSS)中,并在液氮上快速冷凍。根據(jù)既往報(bào)道的方案[12]提取代謝物。代謝物提取物通過(guò)Shimadzu LC Nexera X2 UHPLC與QTRAP 5500 LC-MS/MS(AB Sciex)聯(lián)用進(jìn)行分析。ACQUITY UPLC BEH Amide分析柱(2.1×50 mm,1.7 μCorp.,Milford,MA)用于色譜分離。流動(dòng)相是含有10 mmol·L-1乙酸銨(pH 8.9) 的水(A)和含有10 mmol·L-1乙酸銨(pH 8.2)的乙腈/水(體積比為95/5)(B)(所有溶劑均為Fisher Scientific的LC-MS Optima級(jí))。總運(yùn)行時(shí)間為11 min。流速為 0.5 ml·min-1。進(jìn)樣體積為5 μl,梯度洗脫為6 min時(shí)體積分?jǐn)?shù)95%～61%(B)、8 min時(shí)體積分?jǐn)?shù)61%～44%(B)、8.2 min時(shí)體積分?jǐn)?shù)61%～27%(B)和9 min時(shí)體積分?jǐn)?shù)27%～95%(B)。在每次運(yùn)行結(jié)束時(shí)用體積分?jǐn)?shù)95%(B)平衡色譜柱。碰撞氣體為N2。正負(fù)模式下的離子源條件為:氣簾(CUR)=25 psi,碰撞氣(CAD)=高,離子噴霧電壓(IS)=3 800/-3 800 V,溫度(TEM)=500 ℃,離子源氣體1(GS1)=50 psi,離子源氣體2(GS2)=40 psi。每種代謝物都使用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了調(diào)整,以獲得最佳轉(zhuǎn)換。 D4-煙酰胺(Cambridge Isotope Laboratories, Tewksbury, MA)用作內(nèi)標(biāo)。使用 MultiQuant 3.0.3 軟件(AB Sciex, Concord, ON, CA)對(duì)提取的 MRM 峰進(jìn)行積分。

1.3 視網(wǎng)膜RNA提取、測(cè)序和分析

將小鼠用斷頸法處死后摘除眼球,將視網(wǎng)膜解剖后置于含有少量 Trizol?試劑(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)的無(wú)菌微量離心管中,并在干冰上快速冷凍。用手持勻漿器勻漿解凍樣品并孵育5 min,提取總RNA。向每個(gè)樣品中加入 20 μl氯仿,將樣品短暫渦旋,在室溫下孵育4 min,然后以12 000 r·min-1離心10 min。將上清液移置含有50 μl異丙醇的離心管中,并在室溫下孵育10 min。最后,樣品再次以12 000 r·min-1離心10 min。去除上清液,用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗滌沉淀3次,干燥后重懸于DEPC處理過(guò)的水中。 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在NovaSeq 6000平臺(tái)上使用 Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit進(jìn)行,每個(gè)樣本的總讀數(shù)深度為100 M。使用FastQC驗(yàn)證讀取質(zhì)量,并使用BBTools 包的Bbduk實(shí)用程序修剪引物。使用HISAT2 2.1.0進(jìn)行讀取比對(duì),使用 StringTie 1.3.6組裝和量化轉(zhuǎn)錄本。使用DESeq2 R包鑒定差異表達(dá)的基因。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。每組實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn),檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn):α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 NMNAT1敲除小鼠視網(wǎng)膜的整體代謝改變

LC-MS/MS分析顯示,NMNAT1敲除小鼠視網(wǎng)膜中共有39種代謝物的含量發(fā)生了顯著改變(P<0.05)。代謝物集富集分析發(fā)現(xiàn)多種不同生化途徑的均受到了不同程度的破壞,主要包括氨基酸代謝、糖酵解/糖異生、煙酸和煙酰胺代謝以及嘌呤代謝(圖1)。

A.代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的示意圖;B.NMNAT1敲除小鼠視網(wǎng)膜中顯著變化的代謝物的集富集分析圖1 代謝組學(xué)富集分析A.Schematic diagram of the experimental approach to metabolomics;B.Set enrichment analysis of significantly altered metabolites in the retina of NMNAT1 knockout miceFig 1 Metabolomics enrichment analysis

2.2 視網(wǎng)膜NMNAT1缺乏對(duì)NMNAT1通路的影響

NMNAT1敲除組小鼠視網(wǎng)膜總NMNAT1水平和煙酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD) 水平降低約 40%(圖2A)。NMNAT1和NaAD均是 NMNAT1 的催化產(chǎn)物(圖2B)。下游代謝物NADP和煙酰胺(NAM)的水平分別降低了約25%和55%,而NADH 的水平略有降低(P>0.05)(圖2A)。 NAD前體煙酰胺核苷(NR)和煙酰胺單核苷酸(NMN)在NMNAT1敲除組小鼠視網(wǎng)膜中的顯著積累(圖2A);色氨酸水平?jīng)]有顯著變化,色氨酸是這個(gè)時(shí)期從頭合成NAD的起點(diǎn)(圖2A)。

A.質(zhì)譜法評(píng)估小鼠視網(wǎng)膜中 NMNAT1通路代謝物的相對(duì)豐度;B.哺乳動(dòng)物NMNAT1合成途徑(NMNAT1催化的步驟以星號(hào)表示)圖2 NMNAT1敲除小鼠視網(wǎng)膜組織NMNAT1通路代謝物含量的變化A.The relative abundance of NMNAT1 pathway metabolites in the retinas of mice assessed by mass spectrometry;B.Mammalian NMNAT1 synthesis pathway(steps catalyzed by NMNAT1 were indicated with asterisk)Fig 2 Changes of the content of NMNAT1 pathway metabolites in the retinal tissues of NMNAT1 knockout mice

2.3 NMNAT1敲除組小鼠視網(wǎng)膜組織中的糖酵解、三羧酸循環(huán)和肌酐代謝的變化

NMNAT1敲除組小鼠視網(wǎng)膜中顯著改變的代謝物中富含與糖酵解、糖異生和瓦博格效應(yīng)相關(guān)的代謝物(圖1B)。 對(duì)這些途徑的進(jìn)一步檢查顯示上游糖酵解代謝物葡萄糖、葡萄糖6-磷酸(G6P) 和果糖1,6-二磷酸(F16BP) 的水平大幅升高,同時(shí)磷酸二羥丙酮(DHAP)和葡萄糖 3-磷酸(G3P) 的水平大幅降低(圖3)。這表明葡萄糖利用的中斷,與這種效應(yīng)一致的是,在NMNAT1敲除組小鼠視網(wǎng)膜中,三羧酸循環(huán)中間體 α-酮戊二酸(a-KG) 和琥珀酸的水平降低了約30%(圖3)。NMNAT1敲除組小鼠視網(wǎng)膜中ATP循環(huán)代謝物磷酸肌酸和肌酸的水平降低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3B)。

A.質(zhì)譜法評(píng)估NMNAT1敲除組小鼠視網(wǎng)膜中糖酵解、三羧酸循環(huán)和肌酐代謝物的相對(duì)豐度;B.根據(jù)(A) 中代謝物變化著色的糖酵解/三羧酸循環(huán)途徑(二磷酸果糖酶催化的步驟用單星號(hào)表示, GAPDH催化的步驟用雙星號(hào)標(biāo)記)圖3 NMNAT1敲除組小鼠視網(wǎng)膜組織糖酵解、三羧酸循環(huán)和肌酐代謝的變化A.Mass spectrometry was used to assess the relative abundance of glycolysis, TCA cycle and creatinine metabolites in the retinas of NMNAT1 knockout group mice;B.Glycolysis/tricarboxylic acid cycle pathway coloured according to metabolite changes in(A)(steps catalysed by fructokinase diphosphate were indicated with a single asterisk, whereas those catalysed by GAPDH were marked with a double asterisk)Fig 3 Changes of glycolysis, tricarboxylic acid cycle and creatinine metabolism in retinal tissues of NMNAT1 knockout group mice

2.4 NMNAT1敲除組小鼠視網(wǎng)膜糖酵解和三羧酸循環(huán)相關(guān)酶表達(dá)水平的變化

高通量mRNA測(cè)序分析顯示, NMNAT1敲除組小鼠視網(wǎng)膜中16種糖酵解和4種三羧酸循環(huán)酶的表達(dá)水平發(fā)生改變(圖4)。

圖4 NMNAT1敲除組小鼠(-/-)和對(duì)照組(+/+)糖酵解和三羧酸循環(huán)相關(guān)酶表達(dá)水平的熱圖Fig 4 Heat map of glycolysis and tricarboxylic acid cycle-related enzyme expression levels in NMNAT1 knockout mice(-/-) and controls(+/+)

2.5 NMNAT1敲除組小鼠視網(wǎng)膜組織磷酸戊糖途徑代謝物相對(duì)豐度的特異性改變

LC-MS/MS結(jié)果表明,NMNAT1敲除組小鼠視網(wǎng)膜組織中的赤蘚糖醇(Erythritol)水平顯著降低(P<0.05),提示戊糖磷酸途徑(PPP) 可能受到破壞(圖5)。這與NMNAT1敲除組小鼠視網(wǎng)膜組織中糖酵解通路的破壞和NMNAT1敲除組視網(wǎng)膜中 NADP水平的降低一致。

圖5 NMNAT1敲除組小鼠視網(wǎng)膜組織磷酸戊糖途徑代謝物相對(duì)豐度的特異性改變Fig 5 Specifically alteration of the relative abundance of pentose phosphate pathway metabolites in the retinal tissues of NMNAT1 knockout mice

3 討 論

NMNAT1在不同組織細(xì)胞中廣泛表達(dá),并且其中許多突變會(huì)降低NMNAT1的催化活性或壓力相關(guān)穩(wěn)定性[13-15], 目前已有超過(guò)30種NMNAT1基因突變被證明與Leber 先天性黑蒙和視錐視桿細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)[9-10,13-14,16-17]。但NMNAT1的突變很少會(huì)導(dǎo)致眼外表型[18],此外另外兩種 NMNAT 亞型(高爾基體相關(guān) NMNAT2 和線粒體相關(guān)NMNAT3)均可在視網(wǎng)膜中檢測(cè)到但與失明無(wú)關(guān)[19],因此NMNAT1在視網(wǎng)膜中的作用備受關(guān)注。

此前有研究通過(guò)對(duì)光感受器中缺乏NMNAT1途徑酶NAMPT小鼠的研究,描述了視網(wǎng)膜中NMNAT1具有關(guān)鍵作用[6]。此外NMNAT1是迄今為止唯一與失明有關(guān)的NMNAT1途徑酶,因此NMNAT1異常導(dǎo)致的視網(wǎng)膜發(fā)育異常的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。最近已有幾項(xiàng)報(bào)告指出,視網(wǎng)膜NMNAT1部分或完全抑制時(shí),小鼠在出生后第1周內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)視網(wǎng)膜變性,并在1個(gè)月大時(shí)基本完成視網(wǎng)膜變性[20],而小鼠中NMNAT1的整體缺失將導(dǎo)致小鼠在胚胎死亡[21]。目前的研究結(jié)果表明NMNAT1在視網(wǎng)膜中具有多種潛在的不同作用,體外研究表明 NMNAT1促進(jìn)去乙酰化酶功能以促進(jìn)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的存活[19],而成熟小鼠中NMNAT1的缺乏導(dǎo)致由NADase SARM1介導(dǎo)的光感受器快速死亡[22]。雖然這些研究表明視網(wǎng)膜 NMNAT1的多種功能超出其在氧化還原代謝中的典型作用,但這些功能重疊的程度以及動(dòng)物模型和患者中NMNAT1相關(guān)視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良嚴(yán)重程度的機(jī)制尚未被全面探索。

根據(jù)代謝組學(xué)結(jié)果可以推測(cè)出NMNAT1合成了視網(wǎng)膜總NMNAT1池中的約40%,這與之前的報(bào)道的模型[22]大致一致。糖酵解通量受損似乎是組織中NMNAT1耗竭的一個(gè)普遍特征,因?yàn)榧韧芯繄?bào)告了投射神經(jīng)元和骨骼肌肌管NAMPT抑制或缺失時(shí),將導(dǎo)致GAPDH上游糖酵解代謝物的積累[23]。值得注意的是,Lundt等[23]提出了在NAMPT抑制的肌管中糖酵解通量逆轉(zhuǎn)的證據(jù),因此我們認(rèn)為這一效應(yīng)可能解釋了我們模型中G3P和DHAP水平的下降。

除了糖酵解障礙,我們還檢測(cè)到NMNAT1基因敲除小鼠視網(wǎng)膜中嘌呤核苷酸和氨基酸代謝途徑的特異性缺陷。作為一種特別增生的組織,視網(wǎng)膜被認(rèn)為高度依賴(lài)于足夠的核苷酸和氨基酸來(lái)支持細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯[24]。本實(shí)驗(yàn)中的一些代謝變化,例如嘌呤前體黃嘌呤和氨基酸天冬氨酸的積累,似乎與NMNAT1不足或視網(wǎng)膜變性有更廣泛的聯(lián)系。另一方面,我們還確定了這些途徑中的一系列代謝變化,這些變化在NMNAT1基因敲除視網(wǎng)膜中尚未被報(bào)道,因此在未來(lái)的研究中有待進(jìn)一步探索。

在這項(xiàng)研究中,我們通過(guò)生成和表征視網(wǎng)膜特異性NMNAT1敲除小鼠模型來(lái)研究 NMNAT1介導(dǎo)的NMNAT1代謝在視網(wǎng)膜中的作用。利用代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法,我們證明了NMNAT1缺失會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜中嚴(yán)重的特異性代謝缺陷,并導(dǎo)致中央碳、嘌呤核苷酸和氨基酸代謝均受到損害,并且可能是導(dǎo)致嚴(yán)重視網(wǎng)膜變性的原因?？傮w而言,我們的結(jié)果揭示了 NMNAT1相關(guān)視網(wǎng)膜變性中以前未被重視的復(fù)雜性,為NMNAT1缺陷的視網(wǎng)膜特異性表現(xiàn)提供了可能的解釋,并為進(jìn)一步研究視網(wǎng)膜中NMNAT1代謝奠定了基礎(chǔ)。