周雪,陳團(tuán)營(yíng),牛靜

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 兒科醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450000; 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 兒科,河南 鄭州 450002)

特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)是自身免疫引起的出血性疾病。ITP在兒童中的發(fā)病率較高,每年每10萬(wàn)兒童中有5～10人發(fā)病,并呈上升趨勢(shì),在發(fā)病前期許多患兒無(wú)癥狀,血小板計(jì)數(shù)減少明顯[1-2]。對(duì)于有癥狀的患兒,出血是最常見(jiàn)的表現(xiàn)特征,可發(fā)生瘀點(diǎn)、紫癜和鼻出血等輕微出血或者是更嚴(yán)重的顱內(nèi)、胃腸道或泌尿生殖系統(tǒng)等出血[3-4]。對(duì)于兒童ITP的治療目標(biāo)一般集中在止血或預(yù)防出血,但是兒童自發(fā)性緩解的可能性較低,更容易出血[5]。目前一線治療方案主要包括糖皮質(zhì)激素、靜脈注射免疫球蛋白以及生物制劑如利妥昔單抗等,但是最近的一項(xiàng)隨訪研究[6]提示某些特定的ITP患者亞組在使用利妥昔單抗時(shí)需要更加謹(jǐn)慎。Moulis等[7]發(fā)現(xiàn)ITP在2.4%的兒童中是繼發(fā)性的,其中原發(fā)性免疫缺陷是最常見(jiàn)的病因。繼發(fā)性ITP的病理機(jī)制差異很大,對(duì)感染的反應(yīng)可能產(chǎn)生與血小板交叉反應(yīng)的抗體,這在病毒性疾病或接種疫苗后的兒童ITP中常見(jiàn)。更有研究[8-9]顯示ITP與靜脈和動(dòng)脈血栓形成以及疲勞和生活質(zhì)量下降有關(guān),具有比一般人群更高的死亡率,主要是由出血、感染、心血管事件和較高的血液病患病率造成的。由于基因與環(huán)境因素在人類(lèi)常見(jiàn)疾病中的相互作用,我們需要一種更綜合的生物學(xué)方法來(lái)解決這些復(fù)雜性。因此,基于生物信息學(xué)所衍生的DNA微陣列技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)研究的一項(xiàng)重要技術(shù),它能夠同時(shí)識(shí)別數(shù)千個(gè)基因,甚至整個(gè)基因組。高通量數(shù)據(jù)的系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)分析是解釋生命科學(xué)重要意義的最有用的技術(shù),在生物科學(xué)研究中至關(guān)重要。我們基于生物信息學(xué)分析兒童ITP的發(fā)病機(jī)制,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 差異表達(dá)基因(differential expression genes, DEGs)的篩選和獲取

檢索GEO(Gene Expression Omnibus database)數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),選擇“idiopathic thrombocytopenic purpura”或“immune thrombocytopenia”作為關(guān)鍵詞;“expression profiling by array”作為研究類(lèi)型;種族選為“home sapiens”,選取ITP相關(guān)芯片數(shù)據(jù)集。 通過(guò)GEO2R(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)篩選ITP患兒和正常兒童之間的DEGs。將P<0.05和|Log fold change(FC)|>2.5設(shè)置為閾值。

1.2 基因本體論(GO)和京都基因和基因組百科全書(shū)(KEGG)分析

通過(guò)DAVID在線注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥david.ncifcrf.gov/)對(duì)DEGs進(jìn)行GO注釋和KEGG通路富集分析,展示顯著富集結(jié)果圖。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建以及核心基因的篩選

DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析通過(guò)STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥stringdb.org/)構(gòu)建,并由Cytoscape軟件可視化。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中核心(Hub)基因(前10個(gè))由CytoHubba插件計(jì)算獲得。

1.4 基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)

使用GSEA4.1.0軟件對(duì)ITP組和正常組進(jìn)行GSEA分析,數(shù)據(jù)庫(kù)選擇c2.cp.kegg.v7.4. symbols.gmt[Curated],檢驗(yàn)次數(shù)為1 000。以|NES|>1、P<0.05、FDRq<0.25為差異顯著。

1.5 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)(immune cell infiltration,ICI)分析

將獲取的ITP相關(guān)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行ICI分析。采用CIBERSORT標(biāo)準(zhǔn),以perm=1 000、P<0.05為篩選條件。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs獲取

GSE46922數(shù)據(jù)集包含13個(gè)樣本,以P<0.05和|logFC|>2.5為篩選條件,獲得276個(gè)DEGs。其中上調(diào)的DEGs有191個(gè),下調(diào)的有85個(gè),并將|logFC|前20名上調(diào)和下調(diào)的差異基因的以熱圖形式展現(xiàn),見(jiàn)圖1。

圖1 DEGs熱圖Fig 1 Heat map of differentially expressed genes

2.2 GO和KEGG分析

GO生物過(guò)程(BP)分析顯示,DEGs靶基因在細(xì)胞黏附及其負(fù)調(diào)控、細(xì)胞基質(zhì)黏附力、肥大細(xì)胞激活的負(fù)調(diào)控、整合素信號(hào)通路以及細(xì)胞外基質(zhì)組織等方面特別富集;GO細(xì)胞組分(CC)分析顯示,靶基因主要富集于早胞內(nèi)體、血紅蛋白復(fù)合體、細(xì)胞表面及外區(qū)等方面;GO分子功能(MF)分析表明,靶基因在細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成、整合素結(jié)合、氧氣結(jié)合、氧轉(zhuǎn)運(yùn)體活性等方面顯著富集。此外,KEGG通路分析顯示,DEGs靶基因顯著富集于在受體酪氨酸激酶的抑制劑、ErbB信號(hào)通路、蛋白質(zhì)的消化吸收、Rap1信號(hào)通路、軸突導(dǎo)向、PI3K-Akt信號(hào)通路及補(bǔ)體及凝血系統(tǒng)等。見(jiàn)圖2、3。

圖3 KEGG分析氣泡圖Fig 3 The bubble chart of KEGG analysis

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)基因上傳至Cytoscape軟件,并使用Cytohubba插件篩選核心基因,獲取核心靶點(diǎn)基因有ITGB3、ARRB1、COL3A1、COL11A1、CFTR、HBB、ITGB5、KIFC1、CHEK1、MYBL2、DEPDC1、GTSE1等。見(jiàn)圖4。

圖4 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)Fig 4 PPI network target of DEGs

2.4 GSEA富集通路分析

GSEA富集通路分析顯示,顯著富集于神經(jīng)活性配體-受體相互作用、黑色素瘤、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、黏著斑等方面。見(jiàn)圖5。

圖5 GSEA富集通路分析圖Fig 5 The diagram of GSEA enrichment pathway analysis

2.5 ICI分析

ICI分析顯示,B細(xì)胞與靜息的記憶CD4+T細(xì)胞,激活的CD4+T細(xì)胞分別與中性粒細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、激活的肥大細(xì)胞呈正相關(guān),激活的肥大細(xì)胞分別與中性粒細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞呈正相關(guān),調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與激活的NK細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞也都呈正相關(guān);CD8+T細(xì)胞與靜息的CD4+T細(xì)胞、激活的CD4+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、激活的樹(shù)突狀細(xì)胞、激活的肥大細(xì)胞呈負(fù)相關(guān),激活的樹(shù)突狀細(xì)胞與靜息的肥大細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。見(jiàn)圖6。

圖6 免疫細(xì)胞表達(dá)相對(duì)含量相關(guān)性分析Fig 6 The relative content correlation analysis of immune cell expression

3 討 論

兒童ITP的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確,但是隨著測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展,可通過(guò)大數(shù)據(jù)基因差異分析來(lái)探究ITP的發(fā)病機(jī)制。本研究提取GSE46922中數(shù)據(jù),進(jìn)而篩選ITP與正常兒童之間的DEGs。最終篩選得到276個(gè)DEGs,其中上調(diào)的DEGs有191個(gè),下調(diào)的有85個(gè),上調(diào)明顯的有GRP180、IL-23R、LCORL等,下調(diào)明顯的有FOSL2、LDB2、NXF3等。研究[10-11]表明,IL-23R基因多態(tài)性rs1884444在隱性遺傳模型中與ITP易感性顯著相關(guān),IL-23刺激記憶CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ,激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1、TNF等促炎細(xì)胞因子,而且IL-23R是致病性Th17信號(hào)的關(guān)鍵組成部分,在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中發(fā)揮作用[12-13]。

GO和KEGG分析結(jié)果表明,ITP可能與細(xì)胞黏附及其負(fù)調(diào)控、血紅蛋白復(fù)合體、細(xì)整合素信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)組織等方面密切相關(guān)。Zeng等[14]使用抗αvβ3抗體預(yù)處理MKs,抑制黏附誘導(dǎo)的局灶性黏附激酶和原癌基因酪氨酸-蛋白激酶Src的磷酸化,發(fā)現(xiàn)針對(duì)整合素的自身抗體αvβ3通過(guò)阻礙MK遷移和黏附到血管生態(tài)位,加重ITP患者的血小板減少癥。此外,KEGG通路分析顯示,DEGs顯著富集于在受體酪氨酸激酶的抑制劑、ErbB信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、軸突導(dǎo)向、PI3K-Akt信號(hào)通路及補(bǔ)體和凝血系統(tǒng)等。

Samira等[15]研究發(fā)現(xiàn),ITP患者Notch通路被ErbB信號(hào)通路取代,從而表現(xiàn)出慢性期癥狀,而Notch信號(hào)通路與造血密切相關(guān),涉及造血系統(tǒng)的進(jìn)化產(chǎn)生造血干細(xì)胞以及T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的發(fā)育。也有研究表明ITP的發(fā)病機(jī)制可能與PI3K-Akt信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān),而且PI3K和Akt還是血小板中整合素αIIbβ3激活最重要的中介因子[16-17]。

通過(guò)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),獲取的核心靶點(diǎn)基因有ITGB3、ARRB1、COL3A1、COL11A1、CFTR、HBB、ITGB5、KIFC1、CHEK1、MYBL2等。Nam等[18]研究發(fā)現(xiàn),ITGB3在ITP中的表達(dá)明顯下調(diào),ITGB3可以促使整合素受體αIIbβ3改變構(gòu)象,使纖維蛋白原結(jié)合,在血栓收縮中起主要作用,并有助于增強(qiáng)血栓。通過(guò)GSEA分析,我們發(fā)現(xiàn)通路主要富集于神經(jīng)活性配體-受體相互作用、黑色素瘤、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、黏著斑等方面。有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)活性配體-受體相互作用和癌癥通路與ITP有著密切的聯(lián)系,可能與血小板生成素受體激動(dòng)劑有關(guān)[19-20]。

ICI結(jié)果表明ITP患兒M2巨噬細(xì)胞和濾泡輔助性T細(xì)胞相對(duì)含量增加,激活的樹(shù)突狀細(xì)胞和靜息的記憶CD4+T細(xì)胞相對(duì)含量減少。研究表明巨噬細(xì)胞在ITP的免疫耐受擾動(dòng)中活躍[21],尤其是在Fcγ受體激活與抑制的平衡紊亂中發(fā)揮重要作用。Chen等[22]研究發(fā)現(xiàn),ITP患者的濾泡輔助性T細(xì)胞水平顯著高于正常對(duì)照組,其相關(guān)的趨化因子CXCL13和凋亡血小板水平異常高,表明濾泡輔助性T細(xì)胞可能成為評(píng)估ITP疾病過(guò)程的潛在生物標(biāo)志物。

綜上所述,兒童ITP的發(fā)病可能是由于ITGB3、ARRB1、COL3A1、COL11A1、CFTR等基因的異常表達(dá),通過(guò)神經(jīng)活性配體-受體相互作用、整合素受體結(jié)合、細(xì)胞黏附調(diào)節(jié)等生物過(guò)程,以及介導(dǎo)ErbB和PI3K-Akt信號(hào)通路,從而造成免疫細(xì)胞的異常表達(dá)和血小板的減少。本研究從生物信息學(xué)角度對(duì)ITP發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探究,為臨床研究提供了一定的數(shù)據(jù)支撐,但是這里使用的數(shù)據(jù)集的樣本量不夠多。而且此次研究是僅基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè),還需要進(jìn)一步的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證我們的分析,期待今后進(jìn)一步研究論證。