諸充,康樂,瞿曉燕,楊尚,閆薔,許浩宇,和斌,

(同濟(jì)大學(xué)1.附屬楊浦醫(yī)院臨床研究與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心,2.附屬第一婦嬰保健院生殖醫(yī)學(xué)中心,上海 200120)

近年來(lái),子宮內(nèi)膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma,UCEC)的發(fā)病率逐年升高,UCEC是發(fā)達(dá)國(guó)家最常見的婦科癌癥,在發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率僅次于宮頸癌[1]。目前對(duì)UCEC的治療提倡早期診斷、早期治療,晚期UCEC患者的治療效果和預(yù)后情況并不樂觀[2]。因此,探索UCEC新的預(yù)后指標(biāo)及治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)是近年來(lái)的研究熱點(diǎn),指由細(xì)胞外可溶性化合物、基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞組成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)[3-5],與腫瘤有著密切關(guān)系,是腫瘤細(xì)胞的“庇護(hù)所”,其中的各種成分與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等有著密切關(guān)系[6-8],從而影響癌癥的發(fā)生發(fā)展。因此,通過(guò)靶向調(diào)節(jié)癌基因和相關(guān)信號(hào)通路來(lái)重塑TME成為了治療腫瘤的新策略。在本研究中,我們通過(guò)R軟件對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中UCEC樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘分析,鑒定出與UCEC的免疫微環(huán)境相關(guān)的關(guān)鍵基因,分析其與UCEC的臨床病理特征、生存預(yù)后、TME中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系,探尋潛在的分子機(jī)制以及UCEC腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn),提高其診治率。

1 資料與方法

1.1 資料

從UCEC XENA(https:∥xena.ucsc.edu/)數(shù)據(jù)庫(kù)下載TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中UCEC組織和正常子宮內(nèi)膜組織的基因表達(dá)、臨床特征和生存數(shù)據(jù)。

1.2 方法

主要通過(guò)R軟件(4.2.1版本)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、可視化分析。

1.2.1 分析鑒定差異基因(differentially expressed genes,DEGs)、GO/KEGG富集分析 通過(guò)R軟件中Estimate包(1.0.13版本)對(duì)腫瘤樣本免疫浸潤(rùn)、腫瘤純度進(jìn)行評(píng)分,以樣本的免疫細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞綜合評(píng)分(ESTIMATE Score)的中位值將樣本分為ESTIMATE Score高、低兩組。以DESeq2包版本(1.36.0版本)、tidyvers包(1.3.2版本)計(jì)算組間DEGs,兩組DEGs取并集。通過(guò)org.Hs.eg.db包(3.15.0版本)、clusterProfiler包(4.4.4版本)對(duì)DEGs進(jìn)行GO/KEGG富集分析。

1.2.2 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)富集分析、鑒定關(guān)鍵基因 通過(guò)R軟件中WGCNA包(1.71版本)對(duì)DEGs進(jìn)行聚類分析,分析聚類的基因模塊中基因與UCEC的病理分級(jí)、患者生存時(shí)長(zhǎng)之間的關(guān)系。通過(guò)DESeq2包(1.36.0版本)、tidyverse包(1.3.2版本)分析關(guān)鍵基因在UCEC組織和正常內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平,結(jié)合基因表達(dá)水平和在UCEC、正常內(nèi)膜組織中差異表達(dá)程度確定目的基因。

1.2.3 分析目的基因與UCEC的病理特征、患者生存的關(guān)系 以目的基因的表達(dá)水平(FPKM值)的中位值為界值,將UCEC樣本分為目的基因表達(dá)高、低兩組。分析不同分期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期)、分級(jí)(1、2、3、高級(jí)別)的UCEC中目的基因的表達(dá)水平差異。LinkedOmics(http:∥linkedomics.org/login.php)數(shù)據(jù)庫(kù)下載不同組織學(xué)分型的UCEC中目的基因的表達(dá)數(shù)據(jù),并進(jìn)行分析,以上分析結(jié)果通過(guò)ggplot2包(3.3.6版本)可視化。

1.2.4 生存曲線 以目的基因在UCEC中表達(dá)水平(FPKM值)的1/4界值將樣本分為兩組,survival包(3.3-1版本)對(duì)兩組的生存資料進(jìn)行分析并可視化。

1.2.5 GSEA富集分析、構(gòu)建目的基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò) GSEA官網(wǎng)(https:∥www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)下載msigdb_v7.5.1_GMTs文件,應(yīng)用org.Hs.eg.db包(3.15.0版本)、clusterProfiler包(4.4.4版本)進(jìn)行GSEA富集分析,結(jié)果通過(guò)enrichplot包(1.16.1版本)進(jìn)行可視化。String數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥cn.string-db.org/)構(gòu)建目的基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.2.6 免疫浸潤(rùn)分析 依據(jù)目的基因表達(dá)水平(FPKM值)的中位值將UCEC分為高、低表達(dá)組,分析兩組的免疫評(píng)分(Immune Score)、基質(zhì)評(píng)分(Stromal Score)、腫瘤細(xì)胞豐度(Tumor Purity)的差異。TISIDB官網(wǎng)(http:∥cis.hku.hk/TISIDB/index.php)下載TILs.txt文件整理為cellMarker文件,通過(guò)GSVA包(1.44.2版本)對(duì)兩組進(jìn)行定量免疫浸潤(rùn)分析,結(jié)果通過(guò)ggplot2(3.3.6版本)可視化。通過(guò)Corrplot包(0.92版本)分析目的基因的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性并進(jìn)行可視化。

2 結(jié) 果

2.1 DEGS的鑒定及GO/KEGG富集分析

樣本由533個(gè)UCEC樣本、35個(gè)正常內(nèi)膜組織樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)組成。ESTIMATE包計(jì)算得到UCEC樣本的ESTIMATE Score區(qū)間,為-3 205.840 811～3 976.557 046。以ESTIMATE Score的中位值(-614.951 2)分組,計(jì)算組間DEGs(log2FoldChange絕對(duì)值>1,P<0.05)取并集,得到1 068個(gè)DEGs。對(duì)DEGs進(jìn)行GO功能注釋和KEGG途徑富集分析。GO功能分析結(jié)果顯示,DEGs在生物過(guò)程(BP)方面主要富集在白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、細(xì)胞活化正向調(diào)節(jié)、白細(xì)胞-細(xì)胞黏附、單核細(xì)胞分化、淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、T細(xì)胞活化調(diào)節(jié)、免疫效應(yīng)過(guò)程的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞增生、細(xì)胞殺傷等通路上;在細(xì)胞成分(CC)方面主要富集在質(zhì)膜外側(cè)、細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)吞小泡等通路及MHC蛋白復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔側(cè)等;分子功能(MF)方面主要富集在免疫受體活性、碳水化合物結(jié)合、細(xì)胞因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體活性、趨化因子受體結(jié)合、趨化因子活性、MHC蛋白復(fù)合物結(jié)合、G蛋白-偶聯(lián)化學(xué)吸引受體活性、趨化因子受體活性,見圖1。KEGG分析結(jié)果顯示,DEGs主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞黏附分子、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、細(xì)胞吞噬體等信號(hào)通路上,見圖2。

圖1 GO富集分析

圖2 KEGG富集分析

2.2 WGCNA聚類分析結(jié)合UCEC和正常內(nèi)膜組織基因表達(dá)水平確定目的基因CLDN9

為了找出與UCEC的病理特征及患者生存相關(guān)的DEGs,對(duì)1 068個(gè)DEGS進(jìn)行WGCNA,得到10個(gè)基因模塊。其中包含77個(gè)DEGs的棕色(brown)模塊與UCEC的分期、分級(jí)、生存時(shí)間顯著相關(guān)(圖3)。進(jìn)一步分析這77個(gè)DEGs在UCEC、正常內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平,DESeq2包對(duì)這77個(gè)DEGs差異分析的結(jié)果中baseMean值前10位基因?yàn)镃LDN6、HMGA2、SST、FBN3、EGFL6、CLDN9、NKAIN4、PNMA3、CRTAC1、CTCFL(表1)。綜合考慮目的基因表達(dá)水平和在UCEC、正常內(nèi)膜組織中差異表達(dá)程度,我們將CLDN9作為研究對(duì)象,對(duì)CLDN9在537個(gè)UCEC樣本和35個(gè)正常內(nèi)膜組織樣本表達(dá)水平進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)CLDN9在UCEC組織中的表達(dá)水平顯著升高(圖4)。

A.最佳軟閾值(Soft Threshold)的確定

D.不同基因模塊與腫瘤分期、分級(jí)、生存的相關(guān)性圖3 WGCNA富集分析

表1 UCEC和正常內(nèi)膜組織中baseMean值前10 位基因

圖4 CLDN9在UCEC和正常內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況

2.3 CLDN9與UCEC病理特征、患者生存時(shí)間的相關(guān)性

為了進(jìn)一步分析CLDN9與UCEC病理特征的相關(guān)性,我們將UCEC樣本按照分期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期)、分級(jí)(1、2、3、高級(jí)別)進(jìn)行分組。并對(duì)各組中CLDN9的表達(dá)水平進(jìn)行了分析統(tǒng)計(jì)可視化(圖5),結(jié)果顯示不同分期、分級(jí)的UCEC組織間CLDN9的表達(dá)差異顯著,與病理分級(jí)呈正相關(guān)(P<0.05)。我們還通過(guò)LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)下載了不同組織學(xué)分型的UCEC中CLDN9的表達(dá)數(shù)據(jù),并通過(guò)ggplot2包進(jìn)行可視化,結(jié)果顯示CLDN9在子宮內(nèi)膜樣子宮內(nèi)膜腺癌、漿液型和子宮內(nèi)膜型混合、漿液性子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中漿液性子宮內(nèi)膜腺癌中CLDN9的表達(dá)水平最高(圖6)。接著我們分析統(tǒng)計(jì)UCEC患者的生存數(shù)據(jù),并以患者CLDN9的表達(dá)水平的中位值(1.203 173)為界值將患者分為CLDN9高、低表達(dá)組,構(gòu)建兩組患者的生存曲線(圖7),結(jié)果顯示CLDN9高表達(dá)組的生存比率顯著低于低表達(dá)組(P<0.05)。

a P<0.05;b P>0.05圖5 不同分期、分級(jí)UCEC中CLDN9的表達(dá)水平

a P<0.05;b P>0.05圖6 不同組織學(xué)類型的UCEC中CLDN9的表達(dá)水平

圖7 CLDN9的表達(dá)水平與UCEC患者生存期的關(guān)系

2.4 CLDN9相關(guān)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

為了了解CLDN9在子宮內(nèi)膜癌TME及免疫浸潤(rùn)中可能存在的調(diào)控機(jī)制及相關(guān)蛋白,我們基于String數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CLDN9為核心的蛋白網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了預(yù)測(cè)(圖8),與CLDN9存在互作可能的相關(guān)蛋白包括OCLN、TJP3、CLDN23、CLDN10、CLDN22、CLDN12、TJP1、CLDN16、CLDN11、CLDN1。

圖8 CLDN9蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.5 GSEA富集分析

以腫瘤樣本中CLDN9的表達(dá)水平(FPKM值)的中位值(1.203 173)作為界值,將樣本分為CLDN9高、低表達(dá)組,分析鑒定組間DEGs(log2FoldChange絕對(duì)值>0,P<0.05),對(duì)得到的DEGs進(jìn)行GSEA基因集富集分析。結(jié)果顯示CLDN9高表達(dá)組DEGs主要富集在KRAS基因(KRAS基因是一種在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)以及血管生成等過(guò)程的信號(hào)傳導(dǎo)通路中起著重要調(diào)控作用的基因)激活下調(diào)的信號(hào)通路、骨骼肌發(fā)育、雄性配子(精子)發(fā)生相關(guān)信號(hào)通路以及免疫相關(guān)的外周血中抑制CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)的生物學(xué)通路,CLDN9低表達(dá)組DEGs主要富集在異生代謝、脂肪酸代謝、雄激素反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路中(圖9)。

圖9 CLDN9的GSEA富集分析結(jié)果

2.6 UCEC中CLDN9與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

為了進(jìn)一步了解CLDN9表達(dá)與UCEC免疫微環(huán)境之間的關(guān)系,通過(guò)CLDN9表達(dá)水平的中位值將樣本分為CLDN9高、低表達(dá)組,分析兩組的免疫評(píng)分(Immune Score)、基質(zhì)評(píng)分(Stromal Score)、腫瘤細(xì)胞豐度(Tumor Purity)的差異性(圖10)。在R中通過(guò)GSVA包對(duì)UCEC中28種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況進(jìn)行了計(jì)算分析,以CLDN9表達(dá)水平的中位值為界值分組,分析兩組間免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況的,結(jié)果顯示CLDN9的低表達(dá)組有著更高的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),包括被激活的CD4+細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD56自然殺傷細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及2、17型輔助T細(xì)胞。尤其是CD4+、CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)水平增高在腫瘤免疫治療中具有重要意義(圖11)。

圖10 CLDN9的表達(dá)與免疫、基質(zhì)評(píng)分以及腫瘤細(xì)胞豐度的關(guān)系

圖11 CLDN9表達(dá)與UCEC腫瘤微環(huán)境中CD4+、CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)水平的關(guān)系

3 討 論

UCEC起源于子宮內(nèi)膜,是全球常見的婦科惡性腫瘤[9],雖然早期UCEC的治療效果比較好,但因復(fù)發(fā)率高、死亡率高,UCEC的整體預(yù)后仍然較差[10]。因此,研究UCEC預(yù)后相關(guān)分子及免疫治療靶點(diǎn)具有深刻的意義。

TME在腫瘤發(fā)生的開始和發(fā)展中發(fā)揮不可忽視的作用。腫瘤的免疫療法通過(guò)調(diào)節(jié)抗原釋放、抗原呈遞、抗原識(shí)別和免疫細(xì)胞運(yùn)輸來(lái)增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)改善癌癥患者的預(yù)后。然而,TME中的多種成分可能通過(guò)缺氧、代謝功能障礙、免疫細(xì)胞表型轉(zhuǎn)移和腫瘤來(lái)源的外泌體等途徑形成免疫抑制微環(huán)境[11-14],導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸,從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

CLDN9是屬于Claudin蛋白家族的一種細(xì)胞黏附因子,Claudins蛋白是膜蛋白和細(xì)胞間緊密連接鏈的組成部分。緊密連接鏈可作為物理屏障,防止溶質(zhì)和水自由通過(guò)上皮或內(nèi)皮細(xì)胞片之間的細(xì)胞旁空間,并且在維持細(xì)胞極性和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面也起著關(guān)鍵作用。CLDN9蛋白是丙型肝炎病毒侵入肝細(xì)胞的輔助因子之一[15-16]。Zhu等[17]研究發(fā)現(xiàn)CLDN9在宮頸癌組織及癌旁組織的表達(dá)水平發(fā)生改變,與宮頸癌的淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。Hong等[18]發(fā)現(xiàn)CLDN9的過(guò)表達(dá)與垂體瘤癌細(xì)胞的侵襲性有關(guān)。Zavala-Zendejas等[19]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CLDN9可以增強(qiáng)AGS細(xì)胞(胃腺癌細(xì)胞系)的侵襲性、遷移性和增殖率。我們的富集分析結(jié)果顯示,CLDN9高表達(dá)組的DEGs被富集在KRAS基因激活的相關(guān)通路、骨骼肌發(fā)育等相關(guān)通路上,低表達(dá)組DEGs富集在異生代謝、脂肪酸代謝、雄激素反應(yīng)代謝通路中,尤其是在免疫學(xué)相關(guān)通路中,CLDN9高表達(dá)組的DEGs富集在外周血中抑制CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)的生物學(xué)通路上。

在本研究中,我們通過(guò)生物信息學(xué)分析的方法發(fā)現(xiàn)CLDN9與UCEC病理特征、生存預(yù)后、免疫浸潤(rùn)密切相關(guān)。我們的結(jié)果顯示,隨著UCEC的進(jìn)展,CLDN9的表達(dá)水平呈增高趨勢(shì),在3種組織學(xué)分型的UCEC中,漿液性子宮內(nèi)膜腺癌中CLDN9表達(dá)水平相對(duì)更高。CLDN9的高表達(dá)水平對(duì)UCEC患者的生存及預(yù)后是一種不利因素。CLDN9在UCEC中的表達(dá)與免疫細(xì)胞CD4+、CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān),CD4+、CD8+T細(xì)胞在TME中的抗腫瘤作用是眾所周知的,因此我們推測(cè)CLDN9在UCEC的TME中會(huì)減弱免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤殺傷作用。

我們對(duì)UCSC Xena數(shù)據(jù)庫(kù)中整合的TCGA UCEC樣本進(jìn)行分析鑒定,得到與UCEC的分期、分級(jí)、患者生存相關(guān)聯(lián)的基因CLDN9。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),CLDN9的表達(dá)與UCEC的TME相關(guān)聯(lián)。我們的分析結(jié)果顯示,CLDN9的表達(dá)與UCEC的發(fā)生、發(fā)展呈正相關(guān),與腫瘤中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)。因此,CLDN9可能成為一種新的UCEC生物學(xué)標(biāo)志物及腫瘤免疫治療新靶點(diǎn)。