陳菁青 鄭建華 董巧燕 武文卿 孫天奇 邱業(yè)峰 張 睿

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,北京 100071)

哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)棲息著密集而多樣的微生物群落,它們與宿主共同進(jìn)化,互惠共生。隨著測(cè)序分析手段的進(jìn)步,特別是高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用,極大地促進(jìn)了人類(lèi)對(duì)腸道菌群新物種的發(fā)現(xiàn)及功能的了解。腸道微生物群生態(tài)系統(tǒng)平衡的紊亂,即腸道菌群失調(diào),與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[1],因此,通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群改善宿主健康具有重大意義。

嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila,A.muciniphila)是一種黏蛋白降解革蘭陰性嚴(yán)格厭氧菌,最初從健康人體糞便中分離獲得[2],是腸道微生物群的重要成員之一,占菌群總量的1%～5%[3],因具備介導(dǎo)宿主機(jī)體能量代謝和營(yíng)養(yǎng)穩(wěn)態(tài)、免疫應(yīng)答、大腦活動(dòng)等關(guān)鍵生理活動(dòng)的功能,成為一大研究熱點(diǎn)。A.muciniphila豐度與肥胖、糖尿病、心血管疾病等代謝綜合征以及慢性低度炎性反應(yīng)、腸炎病密切相關(guān),且具備一定改善疾病和提高機(jī)體健康的作用,但因果關(guān)系及與宿主相互作用的機(jī)制尚不清楚[4-5]。A.muciniphila代謝特性的研究、安全和有效性評(píng)價(jià)以及與宿主調(diào)控機(jī)制的揭示為其成為一種有前景的候選益生菌奠定了基礎(chǔ)。本文將結(jié)合現(xiàn)有研究成果,闡述A.muciniphila與疾病的相互關(guān)系,重點(diǎn)探討其在改善宿主代謝紊亂及腸道炎性反應(yīng)中的功能及可能作用機(jī)制。

1 A. muciniphila與腸道黏膜屏障

黏液是維持腸道健康及功能完整的必要組成部分,不僅是阻止外來(lái)有害物質(zhì)滲透和保護(hù)腸道上皮表層的有效屏障,也是物質(zhì)代謝的良好潤(rùn)滑劑[6]。一方面腸道黏液為腸道微生物的生長(zhǎng)、黏附和保護(hù)提供底物,另一方面腸道共生菌與病原微生物在管腔競(jìng)爭(zhēng)生存空間,為黏液的生成和屏障的完整提供營(yíng)養(yǎng)和必需分子,維持腸道黏膜屏障功能正常。此外,腸道微生物群組已被證明能夠影響腸道黏液屏障特性。炎性條件下,某些特定細(xì)菌物種豐度的升高能夠增加黏液層的通透性,從而降低屏障功能[7]。A.muciniphila廣泛定殖于人類(lèi)和動(dòng)物的腸道黏膜層,可代謝產(chǎn)生對(duì)宿主和微生物群均有益的短鏈脂肪酸,且具備增強(qiáng)屏障和增加黏液厚度的活性,成為黏液層中連接的關(guān)鍵菌種[8]。研究證明A.muciniphila在嬰兒早期就定殖于腸道,并在一年內(nèi)菌群豐度接近健康成人水平[9]。不同年齡階段、生理狀態(tài)及腸道不同部位A.muciniphila的定殖量也不盡相同。健康人結(jié)腸中,A.muciniphila定殖數(shù)量可高達(dá)腸道菌群總量的3%,降解腸黏蛋白產(chǎn)生的乙酸和丙酸等主要代謝產(chǎn)物可進(jìn)一步被Faecalibacterium.prausnitzii利用產(chǎn)生丁酸鹽,抑制腸道免疫和腸道通透性[10]。

A.muciniphila具備有效的調(diào)節(jié)宿主免疫、提高腸道屏障的功能,且可能在黏膜中抑制病原微生物定殖、提高宿主共生菌競(jìng)爭(zhēng)力等方面也發(fā)揮積極作用[11]。A.muciniphila的豐度與纖瘦程度正相關(guān),可減輕體質(zhì)量、提高代謝活性,并調(diào)節(jié)黏液厚度,恢復(fù)腸道屏障的功能[12-13]。值得注意的是,在炎癥性腸病(主要是潰瘍性結(jié)腸炎)和代謝紊亂的患者中,觀察到低豐度的A.muciniphila,表明它可能具有潛在的抗炎特性[14]。最新實(shí)驗(yàn)表明,A.muciniphila增加了內(nèi)源生物活性物質(zhì)尤其是胰高血糖素樣肽2的產(chǎn)生,參與腸道屏障調(diào)節(jié)。A.muciniphila在代謝和免疫反應(yīng)中分子特性的發(fā)現(xiàn)及作用機(jī)制的揭示有助于挖掘其潛在的治療應(yīng)用價(jià)值。

2 A. muciniphila與炎性腸炎病

宿主腸道黏蛋白與細(xì)菌之間的相互關(guān)系受菌群結(jié)構(gòu)變化的影響,黏蛋白降解菌可能參與腸道疾病的發(fā)生。研究證明A.muciniphila的豐度與炎癥腸病、肥胖癥、糖尿病和闌尾炎等疾病的發(fā)生負(fù)相關(guān),但免疫學(xué)作用機(jī)制尚不清楚。腸炎患者糞便微生物群中存在A.muciniphila的缺失[15];活檢結(jié)果也顯示,與健康人群相比,炎性腸炎病患者腸黏膜A.muciniphila豐度較低[16]。此外,急性闌尾炎患者體內(nèi)A.muciniphila數(shù)量也減少,且豐度與闌尾炎的嚴(yán)重程度成反比[17]。與健康人相比,潰瘍性結(jié)腸炎患者和克羅恩患者腸道中A.muciniphila的豐度也顯著降低[18-19],而經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化-糞便微生物群移植后,A.muciniphila的定殖率和豐度顯著增加[20]。然而,也有少量研究報(bào)道指出克羅恩患者腸道A.muciniphila的豐度與健康人相比有所增加[16]?？傮w來(lái)看,人體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明炎癥性腸炎病的發(fā)病和A.muciniphila的豐度通常呈負(fù)相關(guān),提示其在炎癥性腸炎病治療中的潛力。

利用動(dòng)物進(jìn)行炎癥性腸炎病造模,對(duì)于研究其病因、發(fā)病機(jī)制、臨床治療等方面具有十分重要的意義。炎癥性腸病動(dòng)物模型的構(gòu)建方法有多種,常用葡聚糖硫酸鈉、三硝基苯磺酸等化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)[21],或利用基因編輯方法敲入或敲除某些基因構(gòu)建等途徑[22]。利用這些方法在成功構(gòu)建的腸炎小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)了A.muciniphila豐度的降低,與人體實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致[23-24]。然而,也有少量文章報(bào)道了與上述相反的結(jié)論,即在結(jié)腸炎小鼠模型中存在A.muciniphila含量升高的現(xiàn)象。結(jié)論的不一致可能受各種不同實(shí)驗(yàn)因素的影響,例如使用的模型不同,如對(duì)Cyp27b1、Hes1和IL-10等不同基因敲除,或用DSS、TNBS等不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)等方法構(gòu)建結(jié)腸炎模型等。因此,不同模型下A.muciniphila對(duì)腸黏膜炎癥的發(fā)病作用仍需要進(jìn)一步的探索。

炎性反應(yīng)是一種先天免疫反應(yīng)模式,多項(xiàng)研究表明A.muciniphila參與了腸道免疫-炎性反應(yīng)的調(diào)控過(guò)程,而揭示因果關(guān)系最直接的方法是利用A.muciniphila進(jìn)行干預(yù)。研究顯示灌喂A.muciniphila或Amuc_1100膜蛋白可有效減少DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸中巨噬細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn),同時(shí)減少結(jié)腸炎小鼠脾和腸系膜淋巴結(jié)中的CD16/32+巨噬細(xì)胞,緩解結(jié)腸炎。此外,A.muciniphila可以通過(guò)宿主-微生物互作,改善DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的腸道屏障功能,降低炎性細(xì)胞因子水平,提高腸道微生物群多樣性,緩解腸道炎性反應(yīng)[25]。A.muciniphila還可增加腸道內(nèi)短鏈脂肪酸的產(chǎn)生,促進(jìn)調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞的分化,改變腸道微生物群的組成[26]。腸道中產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可以激活G蛋白偶聯(lián)受體43 (GPR43),從而增加結(jié)腸中Foxp3+Treg的數(shù)量,調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并緩解結(jié)腸炎[27]。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了人源型A.muciniphilaMucT(ATCC BAA-835T) 菌株與鼠源性A.muciniphila139菌株均具有抗炎作用效果[26,28]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ATCC BAA-835T菌株可以顯著改善DSS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎小鼠的腸道炎性反應(yīng),而小鼠來(lái)源的A. muciniphila 139未發(fā)現(xiàn)有相同的改善效果,提示A.muciniphila的益生效果存在菌株特異性。上述研究表明,A.muciniphilaMucT可能是改善和治療炎性腸炎病的一種極具前景的益生菌,但作用機(jī)制及不同菌株的改善效果還需要進(jìn)行深入探究。

宿主的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRR)能夠識(shí)別細(xì)菌相關(guān)分子模式,誘導(dǎo)免疫-炎性反應(yīng)[29]。核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide oligomerization domain like receptors,NLRs)和Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)是膜上重要的模式識(shí)別受體,直接參與細(xì)菌的識(shí)別,在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。TLR是腸道最有代表性的模式識(shí)別受體,其中TLR2/4/5等與細(xì)菌識(shí)別有關(guān)。NLRs和TLRs激活報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A.muciniphila能特異性激活TLR2受體[30],而TLR2已被廣泛證明可調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)和代謝[29,31],參與腸道微生物與宿主的相互作用。在對(duì)HEK-Blue細(xì)胞的研究中有研究[12]也觀察到了相同的結(jié)果。通過(guò)對(duì)A.muciniphila外膜進(jìn)行基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)分析,揭示A.muciniphila與TLR2受體之間的作用機(jī)制[32]。結(jié)果顯示,Amuc_1100蛋白是A.muciniphila外膜中最豐富的蛋白之一,且與菌毛的形成有關(guān),推測(cè)其可能參與A. muciniphila與宿主之間的相互作用。為了驗(yàn)證這一推測(cè),研究者利用大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)外源表達(dá)Amuc_1100蛋白,發(fā)現(xiàn)其具備與A.muciniphila一樣可激活TLR2表達(dá)細(xì)胞的能力,進(jìn)一步證實(shí)了Amuc_1100蛋白直接參與A.muciniphila與宿主之間的相互作用[13]。此外,體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Amuc_1100在巴氏滅活處理溫度下仍保持穩(wěn)定,相對(duì)耐熱。差分光散射分析顯示Amuc_1100的融解溫度為70° C,恰為巴氏滅菌的使用溫度。因此,在巴氏殺滅活處理后,Amuc_1100仍然可能具有活性,并有助于對(duì)宿主信號(hào)的傳導(dǎo),其功能的穩(wěn)定可能與巴氏滅活A(yù).muciniphila的益生作用密切相關(guān)。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn),Amuc_1100能有效重復(fù)出A.muciniphila的益生作用,且無(wú)論活菌、巴氏滅活A(yù).muciniphila以及Amuc_1100均能降低高脂誘導(dǎo)小鼠高膽固醇含量[30]。此外,與活菌相比,巴氏滅活的A.muciniphila及Amuc_1100還能夠特異性降低高脂誘導(dǎo)小鼠甘油三酯含量,進(jìn)一步證實(shí)了巴氏滅菌處理能夠有效加強(qiáng)A.muciniphila對(duì)宿主的保護(hù)作用,這一現(xiàn)象的潛在機(jī)制可能是熱處理暴露了A.muciniphila的活性物質(zhì)或分子(包括Amuc_1100蛋白等)或抑制性化合物及其組合的失活。

3 A. muciniphila改善代謝性疾病

“代謝紊亂”存在肥胖和胰島素抵抗等多種臨床表現(xiàn),大大增加了患2型糖尿病或心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。肥胖模型腸道通透性增加,引起革蘭陰性菌的脂多糖穿透屏障進(jìn)入血液循環(huán),引起代謝性?xún)?nèi)毒素血癥[33]。已有一系列關(guān)于腸道微生物群與代謝綜合征相互關(guān)系的報(bào)道。此外,在一項(xiàng)開(kāi)創(chuàng)性的人類(lèi)糞便微生物群移植研究中,代謝綜合征患者分別接受來(lái)自正常個(gè)體或代謝紊亂個(gè)體的糞便移植。6周后,僅在接受正常供體糞便微生物移植的治療組中觀察到胰島素敏感性的提高[34]。腸道微生物群改變?nèi)祟?lèi)代謝健康的論據(jù)已被廣泛接受[35],人體研究結(jié)果有效的支持了調(diào)控腸道菌群改善代謝綜合征。然而,目前還沒(méi)有被證明能夠可靠有效的影響和反應(yīng)人類(lèi)代謝疾病標(biāo)志物變化的菌株,因此,針對(duì)代謝疾病的微生物治療方法還需進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

A.muciniphila豐度與個(gè)體的纖瘦程度呈正相關(guān),作為一種有前途的“下一代”益生菌脫穎而出。此外,通過(guò)藥物或手術(shù)途徑改善代謝綜合征患者的方法均已證實(shí)與他們腸道中A.muciniphila相對(duì)豐度的增加有關(guān)[36]。高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠灌喂A.muciniphila活菌可提高胰島素敏感性,并降低血液循環(huán)中的促炎細(xì)菌脂多糖的含量[30]。腸源性全身脂多糖濃度的升高能夠加劇胰島素抵抗和代謝綜合征的發(fā)生和發(fā)展。有研究進(jìn)行了一項(xiàng)為期3個(gè)月的隨機(jī)雙盲人體實(shí)驗(yàn)研究,使超重/肥胖或胰島素抵抗受試者每日接受等劑量的A.muciniphila活菌或巴氏溫和熱滅活的A.muciniphila,探究其對(duì)代謝紊亂的改善作用[37]。益生菌菌株通過(guò)巴氏溫和熱滅活可以提高其治療用途的安全性,并且已被證明巴氏熱滅活可以保留相關(guān)益生作用的衍生物[38]。此前,小鼠研究結(jié)果顯示巴氏滅活處理的A.muciniphila增強(qiáng)了降低小鼠脂肪沉積、胰島素抵抗和血脂異常的能力。臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果[37]顯示,每日接受不同處理的A.muciniphila,實(shí)驗(yàn)周期為3個(gè)月,具有良好的安全性和耐受性,且與對(duì)照組相比,接受巴氏熱滅活A(yù).muciniphila的治療個(gè)體循環(huán)胰島素水平較低,胰島素抵抗指數(shù)和血液總膽固醇也較低,這表明A.muciniphila的膜成分或其他組分具備改善胰島素敏感性和血脂含量的功能。此外,巴氏滅活A(yù).muciniphila菌治療的個(gè)體,體循環(huán)中二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV,DPPIV)含量更低,而DPPIV酶能夠降解胰高血糖素樣肽1(glucagonlike peptide 1,GLP-1),一種能夠增強(qiáng)胰島素分泌并具有免疫調(diào)節(jié)特性的腸道激素。

城鄉(xiāng)學(xué)生形態(tài)指標(biāo)比較（表1）調(diào)查顯示，城市男生身高、體重、胸圍等3項(xiàng)指標(biāo)高于農(nóng)村男生，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），城市女生身高、坐高高于農(nóng)村女生，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

肥胖和2型糖尿病患者通常伴隨血液白細(xì)胞數(shù)量的升高[39],且受腸道菌群改變的影響,肥胖患者呈現(xiàn)慢性低度炎性反應(yīng)[40]。巴氏滅活A(yù).muciniphila菌能夠有效降低肥胖患者血液白細(xì)胞的數(shù)量,緩解代謝性?xún)?nèi)毒素血癥,與前期報(bào)道的A.muciniphila菌具有抗炎作用的臨床前研究結(jié)果相一致。此外,巴氏滅活A(yù).muciniphila菌能夠顯著降低小鼠血清中肝功能標(biāo)志物谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶,以及組織損傷標(biāo)志物-血清乳酸脫氫酶和肌酸激酶的含量[5,30]。與肥胖小鼠的研究結(jié)果相一致,人體實(shí)驗(yàn)結(jié)果也指出,與活菌相比,巴氏滅活處理的A.muciniphila對(duì)機(jī)體代謝炎性反應(yīng)和脂肪肝、心血管疾病等代謝綜合征具有更好的改善效果。然而,目前尚不清楚巴氏殺滅活A(yù).muciniphila菌更有效緩解代謝綜合征的原因。推測(cè)可能是由于巴氏滅活處理后細(xì)菌雖無(wú)法繁殖,但保持了完整活性成分并防止產(chǎn)生抑制作用的分子,有助于觸發(fā)有益的宿主反應(yīng)。細(xì)菌代謝物、細(xì)胞壁成分和細(xì)菌肽為治療與超重和肥胖相關(guān)的代謝并發(fā)癥提供了一個(gè)新治療策略。事實(shí)上,此前同一研究團(tuán)隊(duì)已從A.muciniphila的細(xì)胞壁中表達(dá)純化了Amuc_1100蛋白,并證明了該蛋白在高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠中具有與巴氏滅活A(yù).muciniphila菌同樣的治療效果。腸道微生物中常見(jiàn)革蘭陽(yáng)性菌豐富的細(xì)胞壁成分-胞壁酰二肽,也可以緩解肥胖小鼠胰島素抵抗和提高葡萄糖耐受性[41],進(jìn)一步證明了細(xì)菌來(lái)源的分泌因子、細(xì)胞成分和代謝物等后生元物質(zhì),可以改善代謝疾病。益生菌衍生物或其組分的應(yīng)用可以克服活菌使用過(guò)程中的一些局限性,不僅可以提高治療的安全性,還可以提高基于微生物的療法在代謝疾病中的功效。雖然已有小規(guī)模人體實(shí)驗(yàn)研究證明了巴氏殺菌A.muciniphila應(yīng)用的安全性和有效性,但仍需要更大規(guī)模的人體臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證巴氏殺菌A.muciniphila在超重或肥胖等代謝異常個(gè)體中的治療效果。

4 結(jié)語(yǔ)

A.muciniphila自2004年被發(fā)現(xiàn)以來(lái),大多研究都將其的豐度與其益生作用聯(lián)系起來(lái)[42]。如今,A.muciniphila被廣泛認(rèn)為是改善肥胖、糖尿病、肝疾病和心臟疾病等相關(guān)代謝紊亂疾病的一種益生菌,而事實(shí)也證明,通過(guò)A.muciniphila的治療可以大大緩解這類(lèi)疾病的發(fā)生。通過(guò)比較分析,發(fā)現(xiàn)已鑒定的下一代有益微生物中,人類(lèi)腸道菌群中的A.muciniphila是一種非常有前景的候選細(xì)菌,且目前的研究結(jié)果和功能的發(fā)現(xiàn)已為A.muciniphila作為后續(xù)益生菌微生態(tài)制劑的應(yīng)用邁出了一大步。首先,通過(guò)對(duì)A.muciniphila培養(yǎng)條件的優(yōu)化,已能在人工合成培養(yǎng)基中成功培養(yǎng)出能夠快速繁殖和具有活性的A.muciniphila[43]。其次,研究發(fā)現(xiàn)巴氏滅活A(yù).muciniphila具有更好的益生效果,解決了活菌應(yīng)用過(guò)程中需考慮的運(yùn)輸、儲(chǔ)存條件、保質(zhì)期和穩(wěn)定性等問(wèn)題。第三,Amuc_1100蛋白的鑒別和功能鑒定,揭示了A.muciniphila菌與宿主之間相互作用的關(guān)鍵機(jī)制。第四,小規(guī)模人體試驗(yàn)證明了A.muciniphila菌的安全有效性。最重要的是,巴氏滅活A(yù).muciniphila菌以及細(xì)菌成分,例如相對(duì)分子質(zhì)量較小的30 kU Amuc_1100蛋白的分離和鑒定,為基于A.muciniphila及其產(chǎn)物和衍生物,開(kāi)發(fā)針對(duì)糖尿病、炎癥性腸病或腸屏障功能受損疾病等的藥物研究打開(kāi)了大門(mén)。