張 睿 毋云鵬 武文卿 孫天奇 邱業(yè)峰 陳菁青

(軍事科學院軍事醫(yī)學研究院實驗動物中心,北京 100071)

動物生物反應(yīng)器是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源目的基因?qū)氩⒄系交铙w動物基因組中,使得其組織或器官中可高效表達這種外源蛋白,以實現(xiàn)功能蛋白質(zhì)工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)。按照目的蛋白表達部位的不同,動物生物反應(yīng)器有蛋清、血液、乳腺、唾液腺、尿液等不同種類[1]。由于乳腺可以高效表達重組蛋白并且可以進行翻譯后修飾[2],一般認為乳腺生物反應(yīng)器是較優(yōu)的選擇,也是目前國際上惟一可以實現(xiàn)商業(yè)化的生物反應(yīng)器[1]。

近年來,隨著基因編輯技術(shù)的興起和快速發(fā)展,以及人們對高質(zhì)量生物制品需求的日益增大,大型動物生物反應(yīng)器平臺技術(shù)已經(jīng)日趨成熟,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備的人源化重組蛋白開始不斷涌現(xiàn)。轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)、成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/相關(guān)蛋白 9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9, CRISPR/Cas9)等技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于改善乳成分和生產(chǎn)人源化藥用蛋白等方面[3-5],為動物乳汁“人源化”提供了堅實的基礎(chǔ)。與蛋清、血液等其他表達系統(tǒng)相比[6],轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器具有非常多的優(yōu)勢,如:人源化蛋白表達效率高、生物學活性高、翻譯后可修飾、不產(chǎn)生內(nèi)毒素、生產(chǎn)成本低等。因此,動物乳腺生物反應(yīng)器是極具發(fā)展前景的制藥新途徑之一。

本文主要對動物乳汁“人源化”在生物制藥領(lǐng)域和改善乳成分方面的應(yīng)用研究、以及其未來的應(yīng)用前景進行綜述和展望。

1 乳腺生物反應(yīng)器

生物反應(yīng)器最初是指細胞、細胞提取物或酶進行生物反應(yīng)的地方,現(xiàn)在一般指的是用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的細胞或微生物的生長室。用于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器已存在數(shù)十年,在這些系統(tǒng)中生產(chǎn)的幾種蛋白質(zhì)現(xiàn)在正在臨床試驗中,其中有的已被批準用于市場銷售。與其他表達系統(tǒng)相比,乳腺是轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器的優(yōu)先選擇,產(chǎn)生的乳汁易于大量收集有價值的人源化重組蛋白。

我國的施履吉院士在20世紀80年代初就提出了乳腺生物反應(yīng)器的構(gòu)想,并組織6個單位的科技人員開始實施“哺乳動物個體表達系統(tǒng)的研究”。1987年,Gordon 等[5]首次報道了在小鼠乳汁表達人組織纖溶酶原激活素 (human tissue plasminogen activator,htPA)。此后,乳腺動物反應(yīng)器逐漸成為轉(zhuǎn)基因動物研究領(lǐng)域的熱點之一,各種人源化的藥用蛋白不斷在兔、山羊、綿羊、豬和牛等乳腺和其他器官表達和分泌,目前利用轉(zhuǎn)基因牛、山羊、綿羊乳腺反應(yīng)器生產(chǎn)的人源化重組蛋白有細胞因子、基因工程疫苗、抗體、酶制劑等,如:人凝血酶Ⅲ、人凝血因子Ⅷ、人凝血因子Ⅸ、人乳鐵蛋白、人血清白蛋白等[4,7-9]。20 世紀末,國家“863”計劃將乳腺動物反應(yīng)器歸為資助的重大項目,促進了中國動物乳腺生物反應(yīng)器研究的蓬勃發(fā)展。

在生產(chǎn)人源化的藥用蛋白方面,研究人員[5]利用TALEN 技術(shù)和體細胞核移植技術(shù),在荷斯坦奶牛的β-乳球蛋白位點定點插入了重組人血清白蛋白(recombinant human serum albumin,rHSA)基因,成功獲得可以在乳腺特異表達rHSA的轉(zhuǎn)基因牛。有研究[10]利用轉(zhuǎn)基因兔乳腺反應(yīng)器成功生產(chǎn)出了重組人生長激素(recombinant human growth hormone,rhGH),得到的轉(zhuǎn)基因兔乳汁中rhGH的表達量可以達到10 μg/mL。

在生產(chǎn)基因工程疫苗、抗體方面,有研究[11]利用TALEN基因打靶技術(shù)和體細胞克隆技術(shù)將豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)這3種病毒具有免疫原性的結(jié)構(gòu)蛋白基因定點整合到山羊β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, BLG)基因座,并獲得了在乳汁中表達重組蛋白的轉(zhuǎn)基因山羊,該重組蛋白可以誘發(fā)機體產(chǎn)生特異性體液免疫反應(yīng),為利用乳腺生物反應(yīng)器研制人源化的亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。有研究[12]利用Cre/loxp重組酶系統(tǒng)將人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,Her2/ErbB2)抗體基因成功定點整合到人溶菌酶轉(zhuǎn)基因山羊細胞內(nèi),成功制備了乳腺特異表達Her2抗體蛋白的人溶菌酶轉(zhuǎn)基因山羊。有研究[13]選擇兔 β-酪蛋白(casein beta,CSN2)基因座作為整合VP6 基因的靶位點設(shè)計了一種適用于基于乳腺生產(chǎn)輪狀病毒疫苗的方案,為生產(chǎn)輪狀病毒亞單位疫苗提供了一種新策略,并為建立更廣泛的基于乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的疫苗奠定了基礎(chǔ)。

在細胞因子方面,有研究[9]利用體細胞核移植技術(shù)生產(chǎn)了可以在乳汁中表達人凝血因子Ⅸ(human coagulation factor IX,hFIX)的轉(zhuǎn)基因山羊。有研究[14]構(gòu)建了三代可以表達重組人凝血因子VIII (rhFVIII)的轉(zhuǎn)基因兔,rhFVIII在幾代轉(zhuǎn)基因兔乳汁中均可表達,且乳汁中分泌rhFVIII蛋白的生物活性范圍在0.012～0.599 IU/mL,相當于正常人血漿中hFVIII水平的1.2%～59.9% 。

在生產(chǎn)酶制劑方面,美國 GTC Biotherapeutics公司成功在轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中獲得重組人凝血酶Ⅲ(Atryn),并且通過了 III 期臨床試驗,于 2006 年獲得歐洲藥品管理局批準上市,于 2009 年獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的批準認證,證明了利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺生產(chǎn)重組蛋白的實用性,極大的促進了這一領(lǐng)域的科學研究和商業(yè)應(yīng)用[11]。有研究[15]利用克隆技術(shù)成功制備出可以在乳汁中特異性表達重組人溶菌酶(recombinant human lysozyme,rhLZ)的轉(zhuǎn)基因豬,在F0代母豬乳汁中具有體外生物活性的rhLZ最高濃度達(2 759.6±265.0)mg/L。有研究[16]通過體細胞核移植技術(shù)成功制備可以在乳汁中特異性表達人超氧化物歧化酶1(human superoxide dismutase 1,hSOD1)和人超氧化物歧化酶3(human superoxide dismutase 3,hSOD3)的轉(zhuǎn)基因山羊,在轉(zhuǎn)基因羊乳汁中檢測到 rhSOD1和rhSOD3的濃度分別為:(88.81±8.36 )mg/L 和(267.82±12.67)mg/L 。2007年,美國一家專門從事生化防御藥物開發(fā)的公司(Nexia/PharmAthene)研制出一批表達重組人丁酰膽堿酯酶(recombinant human butyrylcholine esterase, rhBChE)的轉(zhuǎn)基因山羊,其乳汁中產(chǎn)生的rhBChE是人血漿中丁酰膽堿酯酶含量的1 000多倍[17],該rhBChE于2009年完成FDA IND申報和臨床I期試驗,用于神經(jīng)毒劑的解毒。

2 乳汁“人源化”的技術(shù)方法

基因編輯技術(shù)是實現(xiàn)乳汁“人源化”的關(guān)鍵。基因編輯技術(shù)是對基因組中目標位點進行改造的一種生物技術(shù),通過精確地插入、刪除或替換目標DNA序列,實現(xiàn)基因干擾、敲入、修復(fù)等目的。在真核生物細胞特別是哺乳動物細胞中,基因編輯技術(shù)由于其高簡便性,在基礎(chǔ)科學、生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域方面應(yīng)用具有巨大潛力[18]。

目前在乳汁“人源化”中應(yīng)用最多的兩個主要平臺分別是:TALENs和CRISPR/Cas系統(tǒng)。

TALEN 是人工改造的核酸內(nèi)切酶,來自植物病原體黃單胞菌的 TALE 蛋白具有DNA 結(jié)合特異性,高度保守的 33～35 個氨基酸 TALE 重復(fù)序列各自結(jié)合單個堿基對DNA[19],這些模塊化 TALE 重復(fù)序列可以鏈接在一起,構(gòu)建具有自定義 DNA 結(jié)合特異性的長陣列[20]。目前,該技術(shù)已經(jīng)成功運用在了利用乳腺反應(yīng)器生產(chǎn)人源化重組蛋白[5,21]、基因工程疫苗[11]等方面。

自2013 年CRISPR/Cas9 技術(shù)成功應(yīng)用于哺乳動物的基因組編輯之后,利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)乳汁“人源化”的研究便成為乳腺生物反應(yīng)器研究領(lǐng)域的一大熱門。2017 年,有研究使用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)靶向山羊成纖維細胞中的β-乳球蛋白(BLG )基因座進行BLG基因的敲除,改造羊乳成分,從而獲得無BLG表達的山羊,為山羊乳汁“人源化”提供了科學依據(jù)[3]。

3 乳汁“人源化”的應(yīng)用前景

多年來,已有數(shù)種高價值的產(chǎn)品在大動物乳汁中生產(chǎn)出來,從國際大公司開發(fā)的情況可以看出,高經(jīng)濟價值的醫(yī)用蛋白和營養(yǎng)蛋白是乳腺生物反應(yīng)器重要的研發(fā)對象,乳腺生物反應(yīng)器制藥無疑是具有前瞻性和革命性的新一代的制藥模式。除此之外,在使得乳汁或乳制品更有利于人類健康方面,敲除乳汁中的過敏原基因從而改變?nèi)橹械脑谐煞?或者表達一些外源營養(yǎng)蛋白來提高乳汁本身的營養(yǎng)價值,都是極具潛力的發(fā)展方向。

在生產(chǎn)醫(yī)用蛋白和營養(yǎng)蛋白等制藥方面,全球眾多開展動物乳腺生物反應(yīng)器的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的公司中,美國最大的生物技術(shù)公司Genzyme Transgenics Corporation(GTC)、英國PPL Therapeutics(PPL)公司和荷蘭Pharming是3個出色的以乳腺生物反應(yīng)器為核心技術(shù)的公司。其中,GTC公司率先在羊奶中生產(chǎn)抗凝血藥ATryn是世界第一個上市的由乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的孤兒藥。2009年Nexia/PharmAthene公司研制的羊奶產(chǎn)rhBChE已完成FDA IND申報和臨床I期試驗,用于神經(jīng)毒劑的解毒[17]。2010年荷蘭Pharming公司兔奶產(chǎn)遺傳性血管水腫治療孤兒藥Ruconest獲歐盟批準上市,2014年獲FDA批準在美國上市,目前正與上海醫(yī)工院合作將該藥的生產(chǎn)報批引入中國。因此,利用動物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)醫(yī)用和營養(yǎng)藥品具有巨大的市場潛力。

在改良乳品質(zhì)方面,隨著近年來生活水平的不斷提高,人們對乳品質(zhì)的食用要求也越來越高。不論是牛乳,還是在國際營養(yǎng)界被稱為“奶中之王”牛乳過敏癥患者較理想的替代乳品的羊乳[22],都存在BLG等過敏原,會引起人體過敏反應(yīng),且其致敏性無法通過加熱、酶水解和糖基化等處理消除,反而會加重過敏反應(yīng)[23]。因此,消除乳中致敏成分的同時增加功能營養(yǎng)蛋白成分,使其更適合于人類飲用,無疑是提高乳品質(zhì)的一個重要研究方向。2015年,西北農(nóng)林科技大學張涌院士團隊通過TALEN誘導(dǎo)山羊同源重組生產(chǎn)了不含BLG的高人乳鐵蛋白奶[4];2016年,該團隊又利用TALEN技術(shù)生產(chǎn)了可以在乳腺中表達人血清白蛋白的基因編輯牛[5]。2018年,中國農(nóng)業(yè)大學生物學院戴蘊平團隊利用ZFN技術(shù)敲除BLG基因產(chǎn)生無BLG牛奶,從而改善人對BLG產(chǎn)生過敏反應(yīng)的乳糖不耐癥,具有極大的應(yīng)用價值[24]。因此,利用新技術(shù)實現(xiàn)對大型動物基因組的精準編輯,按需改造和提高乳品質(zhì),也是未來乳腺生物反應(yīng)器的發(fā)展方向。

4 面臨的挑戰(zhàn)

轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器自出現(xiàn)后經(jīng)歷了輝煌的發(fā)展階段,如今更是創(chuàng)造了一個新的現(xiàn)代生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)。雖然其擁有廣闊的發(fā)展?jié)摿颓熬?但在理論和技術(shù)方面還存在問題需要不斷的解決和改進。

一是轉(zhuǎn)基因動物構(gòu)建的成功率。由于細胞中同源重組 (homologous recombination, HR) 的效率很低,DNA大片段的敲入受到技術(shù)方面的限制,細胞中DNA片段的敲入效率在很大程度上取決于多種因素,例如HR臂的大小、轉(zhuǎn)染方法、標記選擇和靶基因位點等。有人建議通過調(diào)節(jié)細胞周期[25]或非同源末端鏈接(non-homologous end joining,NHEJ)和HR途徑[26-27]來提高敲入效率。此外,添加各種細胞因子也可以提高敲入效率,如:SCR7 吡嗪(NHEJ 抑制劑)處理細胞會降低 NHEJ 并增強 HR[27],RAD51 重組酶 (RAD51) 過表達提高細胞中的敲入效率[26,28-29],RS-1(RAD51-stimulatory compound 1)也可以提高TALEN和CRISPR/Cas9介導(dǎo)的敲入效率[26,30]。2020年,有研究發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor,HDAC)和RAD51重組酶可以對染色質(zhì)進行修飾,從而增加TALEN介導(dǎo)的牛β-酪蛋白基因位點的同源重組效率[28]。2022年,研究人員[31]嘗試抑制DNA錯配修復(fù)相關(guān)基因(MSH2、MSH3、MSH6、MLH1和PMS2)和過表達 DNA 雙鏈斷裂(DSB)修復(fù)相關(guān)基因(RAD51、CHK1、CHK2)來增加CRISPR/Cas9介導(dǎo)的在牛β-酪蛋白基因位點中人乳鐵蛋白(human lactoferrin,hLF)的敲入效率。

二是外源基因在乳腺的高效表達。有研究表明,雙基因共整合到生物體和細胞中可以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),從而提高目的基因的表達水平[32]。研究人員[33]建立了tPA/GH雙基因整合的單克隆山羊乳腺上皮細胞系,并分析了tPA在單基因和雙基因整合細胞中的表達水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙基因整合細胞系中tPA的表達水平顯著提高,為今后在轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器中高效生產(chǎn)藥用蛋白奠定了基礎(chǔ)。也有研究表明,可精確切割的高分泌乳蛋白的信號肽也可以提高重組蛋白分泌到乳汁中的濃度,有研究[34]構(gòu)建了含有山羊BLG信號肽和重組人組織型纖溶酶原激活劑(human tissue plasminogen activator,rhPA)編碼序列的融合載體,結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因兔中,山羊BLG信號肽可以有效地介導(dǎo)rhPA分泌到乳汁中,并被內(nèi)源性兔信號肽酶準確地從rhPA上切割下來,從乳中純化出rhPA的回收純度為98%,生物活性沒有損失,這一發(fā)現(xiàn)證實了rhPA編碼區(qū)與來自高分泌山羊BLG的可切割異源信號肽融合對提高重組蛋白表達的重要性,可廣泛應(yīng)用于醫(yī)學上重要的重組蛋白的高產(chǎn)率生產(chǎn)。此外,使用純合子轉(zhuǎn)基因動物可以有效增加重組人纖溶酶原激活物的表達水平和穩(wěn)定性[35]。

三是乳腺分泌外源藥物蛋白的翻譯修飾。研究人員[36]對轉(zhuǎn)基因兔乳腺表達的圓葉山豆根唾液纖溶酶原激活劑α1(desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1, rDSPAα1)進行了鑒定、純化及藥理活性分析,結(jié)果表明rDSPAα1具有較強的溶栓活性,證明了可以在轉(zhuǎn)基因兔乳腺中表達具有高溶栓活性的重組DSPAα1。

此外,目前可獲得的乳腺上皮細胞存在低細胞活力、低跨代效率和低泌乳功能等問題,不適合用于泌乳機制的后續(xù)研究以及將它們用作生物反應(yīng)器,針對這一情況,研究人員[37]發(fā)現(xiàn)小分子化合物可以誘導(dǎo)山羊耳成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為泌乳乳腺上皮細胞,為在體外獲得大量有功能的乳腺上皮細胞尋找了一條新的途徑。

綜上所述,盡管乳腺生物反應(yīng)器還存在一些問題尚未完全解決,但近年來一直在不斷改進和完善,與其他技術(shù)相比仍然有著不可比擬的優(yōu)勢,是一種理想的藥用蛋白的生產(chǎn)工具,有著巨大的經(jīng)濟價值和廣闊的應(yīng)用前景,因此該技術(shù)仍然是現(xiàn)代生物醫(yī)藥領(lǐng)域改革的方向。