江群　凌溪鐵　唐兆成　周珍珍　張保龍

摘要： 創(chuàng)制非轉(zhuǎn)基因抗除草劑水稻種質(zhì)資源對于稻田雜草防控具有重要價值。本研究以甲基磺酸乙酯（EMS）水溶液誘變鎮(zhèn)糯19水稻種子，獲得1株能穩(wěn)定遺傳的可耐受乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）抑制劑類除草劑高效蓋草能的M₃代水稻幼苗（突變體）。分別擴增鎮(zhèn)糯19野生型和突變體的基因組DNA并進(jìn)行測序和序列比對，發(fā)現(xiàn)突變體ACCase基因的開放閱讀框（ORF）的第5 374位堿基發(fā)生了點突變，導(dǎo)致編碼的第1 792位氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼帷ｆ?zhèn)糯19野生型和突變體分蘗盛期大田噴施3種田間推薦劑量的ACCase抑制劑類除草劑后農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果表明突變體對高效蓋草能、精喹禾靈和唑啉草酯抗性明顯高于野生型。本研究獲得了能穩(wěn)定遺傳的非轉(zhuǎn)基因抗ACCase抑制劑類水稻新種質(zhì)，具有一定的應(yīng)用價值，為抗除草劑水稻育種提供了種質(zhì)資源。

關(guān)鍵詞： 水稻；抗除草劑種質(zhì)；甲基磺酸乙酯（EMS）；乙酰輔酶A羧化酶

中圖分類號： S335.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）02-0305-08

EMS mutagenesis to create rice anti-acetyl-CoA carboxylase inhibitor-herbicide germplasm

JIANG Qun¹， LING Xi-tie²， TANG Zhao-cheng²， ZHOU Zhen-zhen²， ZHANG Bao-long^1，2

（1.College of Tropical Crops/Sanya Nanfan Research Institute， Hainan University， Haikou 570228， China;2.Institute of Germplasm Resources and Biotechnology/Provincial Key Laboratory of Agrobiology， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract： Cultivating non-transgenic herbicide-resistant rice germplasm resources is of great value for weed control in rice fields. In this study， Zhennuo 19 rice seeds were mutagenized by ethyl methyl sulfonate （EMS） solution， and a M₃generation of rice seedlings with stable inheritance and tolerance to acetyl-CoA carboxylase （ACCase） inhibitor herbicides were obtained. The genomic DNAs of wild-type and the mutant were amplified and sequenced respectively. It was found that there was a point mutation at the 5 374^thbase of the open reading frame of the resistant rice ACCase gene， resulting in a mutation of the encoded 1 792^thamino acid from isoleucine to leucine. Three kinds of ACCase inhibitor herbicides were sprayed in the field and the agronomic traits were analyzed. The results showed that the resistance of the mutant to haloxyfop-R-methyl， quizalofop-P-ethyl and pinoxaden was significantly higher than that of wild type. In this study， a new non-transgenic rice germplasm with ACCase inhibitor resistance was obtained， which had certain application value and could provide germplasm resources for herbicide-resistant rice breeding.

Key words： rice;herbicide-resistant germplasm;ethyl methyl sulfonate （EMS）;acetyl CoA carboxylase

水稻是中國三大糧食作物之一，培育高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)水稻是解決糧食問題的關(guān)鍵。稻田雜草嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，雜草導(dǎo)致中國稻谷每年虧損率超過15%，部分地區(qū)甚至超過50%^[1]。化學(xué)除草是當(dāng)今世界使用最多的稻田除草方法。然而，過度使用除草劑不僅會導(dǎo)致雜草對除草劑產(chǎn)生抗性，還會對作物產(chǎn)生藥害、降低水稻產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重時甚至造成水稻顆粒無收^[2]。因此，培育抗除草劑的水稻品種可以經(jīng)濟有效地解決稻田的雜草防除問題。

乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）是植物初級代謝中脂肪酸合成的關(guān)鍵酶之一，其主要功能是將乙酰輔酶A羧化為丙二酰輔酶A。該反應(yīng)是脂肪酸合成的第一步，也是限速的關(guān)鍵步驟^[3]。脂肪酸不僅是功能物質(zhì)甘油三脂的組成成分，還能轉(zhuǎn)化為作為細(xì)胞膜組成成分的磷脂^[4]。自1958年發(fā)現(xiàn)乙酰輔酶A羧化酶可作為除草劑的作用靶標(biāo)后，針對該靶標(biāo)已開發(fā)了三大類除草劑并商品化應(yīng)用，分別是芳氧苯氧基丙酸酯類（APP）^[5]、環(huán)己烯酮類（CHD）^[6]和新苯基吡唑啉類（DEN）^[7-8]。其中，APP類除草劑包括高效氟吡甲禾靈（Haloxyfop-R-methyl，又稱高效蓋草能）、精喹禾靈（Quizalofop-P-ethyl）、精惡唑禾草靈（Fenoxaprop-P-ethyl，又稱驃馬）、惡唑酰草胺（Metamifop）和氰氟草酯（Cyhalofop-butyl）等。CHD類除草劑包括烯禾啶（Sethoxydim）、噻草酮（Cycloxydim）和環(huán)苯草酮（Profoxydim）等；DEN類除草劑有唑啉草酯（Pinoxaden）。乙酰輔酶A羧化酶抑制劑類除草劑主要被用于控制禾本科雜草，具有高效、低毒、對后茬作物安全等特點^[9]。目前，水稻生產(chǎn)中登記并許可使用的乙酰輔酶A羧化酶抑制劑類除草劑僅有氰氟草酯、惡唑酰草胺和環(huán)苯草酮，這極大限制了水稻生產(chǎn)中雜草的防治。因此培育抗乙酰輔酶A羧化酶抑制劑類除草劑水稻，不僅可以拓寬稻田除草劑的選擇和使用范圍，還可有效控制稻田雜草的發(fā)生與危害。

化學(xué)誘變是培育和篩選抗性除草劑作物種質(zhì)資源的重要方法。EMS是非常有效且負(fù)面影響小的化學(xué)誘變劑，被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建優(yōu)良性狀的水稻突變體^[10-12]。顧佳清等利用EMS處理粳稻品種中花11，從誘變的水稻群體中篩選出高產(chǎn)的突變體，經(jīng)過后代的純化，得到了一個可以直接推廣應(yīng)用的水稻突變新品系申化一號^[13]。陳忠明等通過EMS處理秈稻9311，篩選出了大粒的突變體M316和長穗突變體9311eR^[14-15]。本課題組用EMS誘變處理包括9311在內(nèi)的多個水稻品種，成功篩選到多個抗咪唑啉酮類除草劑的突變體，進(jìn)一步鑒定結(jié)果表明突變均發(fā)生在編碼乙酰乳酸合成酶（ALS）靶標(biāo)基因上^[16]。

本研究通過EMS誘變糯稻品種鎮(zhèn)糯19構(gòu)建突變?nèi)后w，用APP類除草劑高效蓋草能去篩選誘變處理后的M₂代幼苗，獲得能穩(wěn)定遺傳的抗性植株，并對抗性植株的ACCase基因位點突變、氨基酸序列變異進(jìn)行鑒定，最后就3種不同ACCase抑制劑類除草劑對獲得的抗除草劑材料農(nóng)藝性狀影響進(jìn)行分析，旨在為水稻抗除草劑育種提供依據(jù)和材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試水稻材料鎮(zhèn)糯19由江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。試驗所用除草劑的種類及相關(guān)信息見表1。

生物試劑甲基磺酸乙酯（EMS）購自美國Sigma-Aldrich公司，2×Rapid Taq Master Mix、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase聚合酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司，CTAB購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 鎮(zhèn)糯19水稻種子的EMS誘變及抗ACCase抑制劑類除草劑突變體的篩選

鎮(zhèn)糯19種子（M₁代）清水浸泡2 h后，用質(zhì)量濃度5.0 mg/ml的EMS水溶液浸種處理14 h，硫代硫酸鈉中和30 min后，將種子撈出并用清水沖洗5～6遍。將誘變處理后的種子播種于大田，M₁代植株成熟后，種子混收（M₂代）作為突變?nèi)后w庫。從突變?nèi)后w庫中取M₂代種子播種于大棚苗床，待水稻幼苗長至3～4葉期時噴施64.8 g/hm²，a.i.高效蓋草能，施藥后21 d觀察記錄水稻表型并將正常生長的水稻苗移栽至盆缽內(nèi)，單株收獲種子得到突變體種子（M₃代），M₃代種子播種后得到M₃代幼苗。

1.3 抗除草劑突變體 ACCase基因的PCR鑒定和堿基序列分析

從國家水稻數(shù)據(jù)中心數(shù)據(jù)庫（https：//www.ricedata.cn/）獲得水稻ACCase基因（OsACC， 序列號為LOC_Os05g22940）的堿基序列。根據(jù)OsACC基因的保守序列使用SnapGene 6.0.2軟件進(jìn)行特異性引物設(shè)計，共設(shè)計了8對引物，分別是OsACC-F1～OsACC-F8和OsACC-R1～OsACC-R8 （表2）。

采用CTAB法^[14]提取水稻的基因組DNA，取M₃代三葉一心期的葉片0.5 g放在帶有1顆小鋼珠的2 ml離心管中，放到液氮中冷凍至葉片組織變脆，再將離心管放到頻率為60 Hz的組織研磨機研磨2 min，然后加入400 μl CTAB提取液，離心管65 ℃水浴30 min后，在通風(fēng)櫥中加入400 μl氯仿，充分混勻至提取液呈乳綠色，12 000 r/min離心10 min，在離心期間標(biāo)記好管號，將600 μl無水乙醇加入到已經(jīng)標(biāo)記好的1.5 ml離心管中，移液槍吸取上清液300 μl加到已經(jīng)準(zhǔn)備好的離心管中，上下顛倒混勻再沉淀1 h以上，12 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，開蓋，室溫下風(fēng)干12 h 至離心管底部有明顯的白色DNA沉淀，風(fēng)干后加入滅菌蒸餾水200 μl，于-20 ℃保存。

以M₃代的基因組DNA為模板，采用2×Rapid Taq Master Mix或 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase聚合酶擴增OsACC基因的8個片段。用1% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。將條帶大小正確的PCR產(chǎn)物送南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序；使用SnapGene 6.0.2軟件分析測序結(jié)果，明確野生型和突變體的OsACC基因堿基序列差異性。

1.4 噴施除草劑后水稻農(nóng)藝性狀調(diào)查

2022年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗基地進(jìn)行鎮(zhèn)糯19野生型和突變株系對3種乙酰輔酶A羧化酶抑制劑類除草劑耐受性試驗。5月中旬播種，6月中旬插秧。試驗設(shè)分別噴施高效蓋草能、精喹禾靈、唑啉草酯及清水對照4個處理，每處理2.5 m×4.0 m。移栽行距為0.25 m，株距為0.15 m。按照常規(guī)大田生產(chǎn)進(jìn)行澆水和施肥等田間管理。

鎮(zhèn)糯19野生型和突變體幼苗移栽大田27 d后，進(jìn)行高效蓋草能、精喹禾靈、唑啉草酯及清水（CK）的噴施處理。除草劑的用量見表1。各處理選擇連續(xù)的20株，在水稻噴施除草劑前以及噴施除草劑后30 d、90 d進(jìn)行莖蘗數(shù)、株高、主莖旗葉長度等農(nóng)藝性狀調(diào)查? 。其中，噴藥后90 d，水稻已進(jìn)入成熟期，統(tǒng)計的莖蘗數(shù)為成穗數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用GraphPad Prism 8.0.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗除草劑突變體篩選

高效蓋草能是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑，EMS誘變的鎮(zhèn)糯19 M₂代水稻幼苗在3～4葉期噴施高效蓋草能7 d后，絕大部分水稻幼苗葉片顏色變成淺綠；噴施高效蓋草能21 d后，敏感植株葉片幾乎完全失去綠色、部分已經(jīng)枯死；具有抗性的植株能繼續(xù)正常生長。經(jīng)大量篩選后，最終獲得1株具有高效蓋草能抗性的M₂單株（圖1），成熟后收獲單株種子，得到M₃代抗性突變體。

2.2 OsACC突變位點

已知高效蓋草能的作用靶標(biāo)是ACCase，植物對高效蓋草能的抗性主要源于ACCase基因的突變^[17-19]。為了確定突變體中靶標(biāo)基因是否發(fā)生突變，我們用了8對引物對野生型（鎮(zhèn)糯19-WT）和抗性M₃單株（鎮(zhèn)糯19-1792）的基因進(jìn)行擴增，全部都獲得了與預(yù)期大小相符合的條帶（圖2）。

上述PCR擴增的產(chǎn)物經(jīng)測序和堿基序列比對，發(fā)現(xiàn)相對于野生型OsACC的ORF，突變體OsACC基因中存在一個點突變，其開放閱讀框（ORF）的第5 374位堿基由A突變成T，從而引起編碼的第1 792位氨基酸由異亮氨酸（Ile）突變?yōu)榱涟彼幔↙eu）（圖3A）。OsACC蛋白的全長有2 327個氨基酸，將OsACC蛋白全長氨基酸序列在NCBI的Conserved Domain數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)其包含了4個結(jié)構(gòu)域（Domain）：生物素羧化酶（BC）、生物素羧基載體蛋白（BCCP）、乙酰輔酶A羧化酶中心（ACC central）和羧基轉(zhuǎn)移酶（CT）（圖3B）。進(jìn)一步的氨基酸序列分析結(jié)果表明，突變體中第1 792位氨基酸的突變位于CT結(jié)構(gòu)域，該突變類型與已報道的大穗看麥娘（Alopecurus myosuroides）的抗性位點突變類型是一致的，對應(yīng)于其ACCase氨基酸序列第1 781位點；突變類型也相同，均由Ile突變?yōu)長eu（圖3B 和3C）^[17]。因此，突變體抗除草劑功能的獲得是由OsACC氨基酸序列第1 792位氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼嵋鸬摹?/p>

2.3 突變體的農(nóng)藝性狀

在分別噴施高效蓋草能、精喹禾靈和唑啉草酯14 d后，野生型植株生長均受到了顯著影響，大部分植株葉片出現(xiàn)枯黃癥狀。突變體植株在分別噴施以上3種除草劑后，葉片仍然是綠色且可以正常生長，表明突變體對這3種除草劑均具有抗性（圖4）。

分蘗期分別噴施3種不同除草劑后，野生型和突變體株高、分蘗數(shù)及旗葉長度的變化如圖5所示。結(jié)果顯示，在噴施清水處理的情況下，野生型和突變體植株的株高在處理前（0 d，即幼苗移栽到大田27 d）基本沒有差異，但在處理后30 d和90 d，突變體的株高顯著低于野生型的株高（圖5A）；兩者在處理前、后的單株莖蘗數(shù)均無明顯差異（圖5E）。在分別噴施3種不同除草劑前（0 d），野生型和突變體植株的株高和單株分蘗數(shù)都沒有明顯差異，但是在噴施處理后，兩者受除草劑的影響表現(xiàn)出明顯差異（圖5B～圖5D、圖5F～圖5H）。其中，在噴施高效蓋草能30 d和90 d后，突變體的株高均顯著高于野生型（圖5B），單株莖蘗數(shù)也顯著多于野生型（圖5F）。野生型對精喹禾靈和唑啉草酯都非常敏感，噴施田間推薦劑量后水稻植株均死亡，因此未統(tǒng)計噴藥后的株高和分蘗數(shù)，而突變體對這兩種除草劑表現(xiàn)出較強的抗性，所有植株存活且能正常生長，株高隨時間逐漸增加（圖5C和5D）。突變體的單株莖蘗數(shù)在精喹禾靈處理后隨時間呈先增后減趨勢，但經(jīng)唑啉草酯處理后變化不明顯，未出現(xiàn)明顯增加現(xiàn)象（圖5G和5H）。

噴施清水處理的突變體旗葉長度顯著短于野生型；高效蓋草能處理后，突變體的旗葉長度顯著長于野生型（圖5I）。由于野生型在噴施田間推薦劑量的精喹禾靈和唑啉草酯后植株已經(jīng)枯死，因此未能進(jìn)行旗葉長度統(tǒng)計。

綜合以上結(jié)果，在田間推薦劑量下，突變體對高效蓋草能、精喹禾靈和唑啉草酯的抗性水平均高于野生型。

3 討論

植物對除草劑的抗性機制包括非靶標(biāo)和靶標(biāo)抗性兩大類。其中，非靶標(biāo)抗性是由靶標(biāo)基因以外的突變引起的，使植物對除草劑的吸收或轉(zhuǎn)運率降低、螯合或代謝作用增強；靶標(biāo)抗性是由除草劑的靶標(biāo)基因發(fā)生突變引起的^[20]。現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的大部分植物抗ACCase抑制劑類除草劑的抗性機制是由于ACCase基因堿基突變引起氨基酸位點發(fā)生變異，這也是導(dǎo)致雜草抗藥性產(chǎn)生的主要原因^[21-22]。截止目前，雜草中已報道了十幾種ACCase氨基酸置換與其抗藥性相關(guān)，分別對應(yīng)于大穗看麥娘ACCase的7個氨基酸位點（均位于CT結(jié)構(gòu)域內(nèi)）：第1 781位、第1 999位、第2 027位、第2 041位、第2 078位、第2 088位和第2 096位^[22-25]。在以上這些突變中，以第1 781位氨基酸由Leu突變成Ile最為普遍，對三大類不同的ACCase抑制劑類除草劑都表現(xiàn)出高抗性，卻沒有適合度代價（Fitness cost）^[26-28]。本研究通過篩選EMS誘變的鎮(zhèn)糯19水稻突變體，鑒定到了1個能穩(wěn)定遺傳的抗除草劑突變體。對突變體進(jìn)行了基因鑒定，確定其編碼靶標(biāo)蛋白OsACC的第1 792位氨基酸由Leu突變成Ile。該突變類型與已報道的突變類型一致，對應(yīng)于大穗看麥娘ACCase第1 781位氨基酸突變。這是該突變類型使水稻獲得多種ACCase抑制劑類除草劑抗性的首次報道。

EMS是最常見的化學(xué)誘變劑，在植物的誘變育種中被廣泛應(yīng)用^[29]。本試驗通過EMS誘變鎮(zhèn)糯19種子，篩選到了抗ACCase抑制劑類除草劑的水稻植株，突變體能耐受田間推薦劑量的高效蓋草能、精喹禾靈和唑啉草酯。其中，噴施了田間推薦劑量的唑啉草酯后，鎮(zhèn)糯19野生型植株在處理30 d后幾乎全部死亡；噴施了田間推薦劑量的精喹禾靈后，野生型的植株在噴施30 d后全部死亡；而突變體在分別噴施3種除草劑后，均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，基本可以正常生長。所獲得的抗性突變體對高效蓋草能、精喹禾靈、唑啉草酯的抗性水平均明顯強于野生型。突變體和野生型的最小致死劑量或50%抑制濃度（GR₅₀）、OsACC酶活性的差異尚有待進(jìn)一步明確。

大豆、棉花和玉米等轉(zhuǎn)基因作物已在全球范圍內(nèi)進(jìn)行了商品化生產(chǎn)，產(chǎn)生了巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。目前為止，中國雖然有多種轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)被正式批準(zhǔn)商品化生產(chǎn)，但進(jìn)行大面積種植的僅有番木瓜和棉花。2009年，農(nóng)業(yè)部頒發(fā)了中國擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻生產(chǎn)應(yīng)用安全證書，但目前中國尚未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因水稻的商業(yè)化生產(chǎn)。因此，培育非轉(zhuǎn)基因的抗除草劑水稻品種具有重要價值。上世紀(jì)90年代晚期，美國路易斯安那州州立大學(xué)稻米研究中心通過EMS誘變技術(shù)育成了一系列耐咪唑啉酮類除草劑（ALS抑制劑類除草劑）的非轉(zhuǎn)基因水稻品種。2002年，巴斯夫公司開發(fā)了非轉(zhuǎn)基因抗咪唑啉酮類除草劑的水稻品種Clearfield在美國進(jìn)行了商業(yè)化推廣，解決了水稻種植的雜草稻危害問題^[30]。2018年，巴斯夫又在美國上市了非轉(zhuǎn)基因水稻品種Provisia，可以抗精喹禾靈，擬與抗咪唑啉酮類除草劑水稻品種Clearfield進(jìn)行輪作并交替使用兩種不同作用機理的除草劑，實現(xiàn)對雜草稻和其他一年生雜草的可持續(xù)性防控^[31]。本研究通過EMS誘變篩選到的抗ACCase抑制劑類除草劑突變體，具有與抗除草劑精喹禾靈水稻品種Provisia類似的抗除草劑性狀，可為中國非轉(zhuǎn)基因抗除草劑水稻育種提供重要材料。

4 結(jié)論

本研究通過EMS誘變篩選獲得了可穩(wěn)定遺傳的抗ACCase抑制劑類除草劑的水稻突變體材料，可耐受3種不同田間推薦劑量的除草劑，具有一定的生產(chǎn)應(yīng)用價值。野生型在噴施田間推薦劑量的高效蓋草能、精喹禾靈、唑啉草酯后，株高和分蘗均受到嚴(yán)重抑制甚至死亡，但突變體基本能正常生長。突變體中OsACC突變基因編碼蛋白質(zhì)的第1 792位氨基酸由Ile變成Leu，使其對ACCase抑制劑類除草劑的耐受性顯著提高。在當(dāng)前中國轉(zhuǎn)基因水稻尚未放開、公眾對轉(zhuǎn)基因作物品種存在疑慮的大背景下，本研究獲得的非轉(zhuǎn)基因抗除草劑材料具有良好的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯：石春林）