劉亞楠　孫楓　涂麗琴　高丹娜　李碩　吳淑華　季英華　郭青云

摘要： 以番茄斑駁花葉病毒（Tomato mottle mosaic virus，ToMMV）外殼蛋白（Coat protein， CP）為研究對(duì)象，通過(guò)熒光素酶互補(bǔ)技術(shù)（Luciferase complementation imaging assay，LCI）研究ToMMV CP與本氏煙組蛋白H4在植物體內(nèi)的互作情況。亞細(xì)胞共定位結(jié)果顯示，ToMMV CP定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，組蛋白H4定位于細(xì)胞核中，兩者共定位于細(xì)胞核中。雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）試驗(yàn)結(jié)果表明，ToMMV CP與組蛋白H4的互作位置主要在細(xì)胞核中。上述2種試驗(yàn)結(jié)果證明，煙草花葉病毒CP與本氏煙組蛋白H4在植物體內(nèi)存在互作。采用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)沉默本氏煙煙草中的H4基因，對(duì)沉默H4基因的植株接種ToMMV，接種后第4 d，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法檢測(cè)系統(tǒng)葉的病毒含量，發(fā)現(xiàn)病毒含量顯著低于對(duì)照組，結(jié)果表明H4基因的沉默會(huì)影響ToMMV在植株中的復(fù)制，組蛋白H4可能是ToMMV侵染植株的本氏煙感病因子。病毒編碼的CP可能與寄主組蛋白H4在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，進(jìn)而使病毒完成系統(tǒng)侵染。

關(guān)鍵詞： 番茄斑駁花葉病毒；外殼蛋白；組蛋白；蛋白質(zhì)互作

中圖分類(lèi)號(hào)： S436.412.1⁺¹文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2023）02-0344-08

Virus infection regulated by interaction between histone H4 of Nicotiana benthamiana and coat protein of tomato mottle mosaic virus

LIU Ya-nan¹， SUN Feng²， TU Li-qin²， GAO Dan-na²， LI Shuo²， WU Shu-hua²， JI Ying-hua^1，2， GUO Qing-yun¹

（1.Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Qinghai University/Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management of Qinghai Province/Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pest in Xining， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Xining 810000， China;2.Institute of Plant Protection， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract： The coat protein （CP） of tomato mottle mosaic virus （ToMMV） was used as the research object， and the interaction between CP of ToMMV and histone H4 of Nicotiana benthamiana was confirmed by luciferase complementation imaging assay （LCI）. Subcellular localization results showed that CP of ToMMV was localized in the nucleus and cytoplasm， histone H4 was localized in the nucleus， and both were co-localized in the nucleus. In the bimolecular fluorescence complementation（BiFC） assay， the interaction sites between CP of ToMMV and histone H4 were mainly in the nucleus. The results of the above two experiments showed that there was an interaction between coat protein and histone H4 of N. benthamiana in plants. H4 was silenced in N. benthamiana by virus-induced gene silencing （VIGS）. Plants with silenced H4 were inoculated with ToMMV， and the virus content in systemic leaves was detected by real-time fluorescence quantitative PCR on the fourth day after inoculation. It was found that the virus content was significantly lower than that of the control group， indicating that the silencing of H4 gene would affect the replication of ToMMV in plants， and histone H4 may be the cause of ToMMV-infected plants. The CP encoded by the virus may play a role in the nucleus with the host histone H4， thereby assisting the virus to complete the systemic infection.

Key words： tomato mottle mosaic virus；coat protein；histone；protein-protein interaction

番茄斑駁花葉病毒（Tomato mottle mosaic virus，ToMMV）主要侵染茄科和十字花科植物及部分豆科、葫蘆科植物^[1]。被ToMMV侵染后，番茄植株病葉上往往出現(xiàn)斑駁皺縮等癥狀，嚴(yán)重者導(dǎo)致番茄葉片壞死，進(jìn)而影響植株發(fā)育，最終影響番茄的品質(zhì)和產(chǎn)量^[2]。

ToMMV屬帚狀病毒科（Virgaviridae）、煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）^[3-5]，為正義單鏈RNA（+ssRNA）病毒^[6]。番茄斑駁花葉病毒基因組由4個(gè)開(kāi)放閱讀框（Open reading frame， ORF）構(gòu)成，編碼4個(gè)大小不同的蛋白質(zhì)^[7]，分別為相對(duì)分子質(zhì)量為29 800的運(yùn)動(dòng)蛋白（Movement protein，MP）、相對(duì)分子質(zhì)量為17 700的外殼蛋白（Coat protein， CP）^[6]、相對(duì)分子質(zhì)量為183 000的RNA依賴(lài)型RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase， RdRP）蛋白、相對(duì)分子質(zhì)量為126 000的甲基轉(zhuǎn)移酶/解旋酶蛋白（Methyltransferase/helicase）^[8]。對(duì)與番茄斑駁花葉病毒同屬的煙草花葉病毒屬其他成員的研究發(fā)現(xiàn)，很多外殼蛋白作為病毒結(jié)構(gòu)蛋白存在^[9]，在組裝病毒粒子的過(guò)程中扮演著非常重要的角色^[10]。同時(shí)，CP也參與多項(xiàng)生物功能的行使，如病毒運(yùn)動(dòng)^[11]、病毒致病過(guò)程中癥狀的形成^[12]、病毒復(fù)制酶在合成負(fù)鏈RNA過(guò)程中的位點(diǎn)識(shí)別^[13]、病毒復(fù)制復(fù)合物（Virus replication complexes， VRC）的調(diào)控^[14]等。上述研究結(jié)果顯示，CP在病毒的侵染循環(huán)中扮演著重要角色^[15]。但是，目前關(guān)于ToMMV CP與寄主植物本氏煙間分子互作的研究還比較少。

組蛋白參與DNA的包裝和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，是染色質(zhì)的主要成分^[16]。組蛋白家族包括32個(gè)成員，分別是6個(gè)H1、11個(gè)H2A、8個(gè)H2B、5個(gè)H3和2個(gè)H4 ^[17]。H3、H4組蛋白在調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能方面起著重要的作用^[18-19]。在相應(yīng)酶的作用下，組蛋白會(huì)發(fā)生甲基化^[20]、乙酰化、磷酸化^[21]、腺苷酸化、泛素化和腺苷5′-二磷酸（ADP）核糖化等進(jìn)而達(dá)到組蛋白修飾^[19，22]。修飾組蛋白會(huì)通過(guò)適配器分子、染色質(zhì)修飾酶、轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄抑制因子讀取等影響染色質(zhì)的組裝，從而對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程起到調(diào)控作用^[23]。

本研究利用熒光素酶互補(bǔ)技術(shù)（Luciferase complementation imaging assay，LCI）、亞細(xì)胞共定位和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)（Bimolecular fluorescence complementation，BiFC）驗(yàn)證ToMMV CP與本氏煙H4蛋白的分子互作，并利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)明確本氏煙H4蛋白在ToMMV侵染過(guò)程中的作用，使人們進(jìn)一步了解ToMMV侵染植物的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本氏煙植株種植于25 ℃光照培養(yǎng)箱中，16 h/8 h光照/黑暗交替培養(yǎng)。Gateway入門(mén)載體pDONR、熒光素酶載體（cLUC、nLUC）、亞細(xì)胞共定位載體（pHYG-YFP、pHYG-CFP）、BiFC載體（YN、YC）、農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)菌株和ABI感受態(tài)菌株均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌Trelief^TM5α購(gòu)自北京Tsingke公司。VIGS載體TRV₁、TRV₂由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存，TRV₁、TRV₂-GUS、TRV₂-PDS、mCherry-H2B、農(nóng)桿菌菌液由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

MicroEluteGel Extraction Kit D6294微量膠回收試劑盒、常規(guī)質(zhì)粒提取試劑盒（Plasmid Mini Kit I D6943-2），購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek公司；克隆載體pMD18-T、T4 DNA連接酶、限制性快切酶，購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 基因克隆與載體的構(gòu)建

以實(shí)驗(yàn)室保存的ToMMV CP和本氏煙cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物（表1）進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，經(jīng)BP反應(yīng)連接到pDONR上后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trelief^TM5α，測(cè)序正確后，提取質(zhì)粒，經(jīng)LR反應(yīng)連接至終載體cLUC、nLUC、pHYG-YFP、pHYG-CFP、YN、YC^[24]上，分別獲得質(zhì)粒cLUC-H4、nLUC-CP、pHYG-YFP-H4、pHYG-CFP-CP、YN-CP、YC-H4。用構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)后進(jìn)行PCR檢測(cè)。設(shè)計(jì)含有合適酶切位點(diǎn)的引物（表1）對(duì)H4基因進(jìn)行擴(kuò)增，與同樣經(jīng)過(guò)酶切處理的TRV₂連接，得到TRV₂-H4載體，將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。

1.3 農(nóng)桿菌接種本氏煙

分別將攜帶nLUC-CP、cLUC-H4、YFP-H4、CFP-CP、YN-CP、YC-H4、TRV₂-H4、TRV₂-GUS、TRV₂-PDS、TRV₁的農(nóng)桿菌于28 ℃恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)至OD₆₀₀≈0.6，離心去上清后將菌體分別重懸于懸浮液（10 mmol/L MgCl₂、50 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸pH 5.6、100 μmol/L乙酰丁香酮）中，使其OD₆₀₀為1.0，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中懸浮1～2 h。在熒光素酶互補(bǔ)試驗(yàn)中以nLUC-CP：cLUC-H4、nLUC-CP：cLUC、nLUC：H4-cLUC、nLUC：cLUC分別共浸潤(rùn)本氏煙葉片。雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)中以YN-CP：YC-H4共浸潤(rùn)本氏煙葉片。在注射2 d后使用化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察，進(jìn)行熒光素酶互補(bǔ)分析。在亞細(xì)胞共定位和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)中，使用激光共聚焦顯微鏡（ZEISS公司產(chǎn)品，德國(guó)）觀察注射菌液48 h后的本氏煙葉片。在VIGS試驗(yàn)中，分別以TRV₁：TRV₂-H4、TRV₁：TRV₂-GUS（陰性對(duì)照）、TRV₁：TRV₂-PDS（陽(yáng)性對(duì)照）3種組合共浸潤(rùn)接種本氏煙，接種后的本氏煙以TRV-H4本氏煙、TRV-GUS本氏煙（陰性對(duì)照）、TRV-PDS本氏煙（陽(yáng)性對(duì)照）命名。每個(gè)組合接種7株，以待進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。

1.4 實(shí)時(shí)定量RT-PCR（qRT-PCR）

首先使用TransZol Up Plus RNA試劑盒提取樣品RNA，然后將RNA 稀釋至相同含量進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（參照說(shuō)明書(shū)），按照比例制備反應(yīng)液，之后進(jìn)行定量分析，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

qPCR反應(yīng)體系（總體積20.0 μl）：10.0 μl 2×SuperFast Universal SYBR Master Mix，0.5 μl正向引物，0.5 μl反向引物，1.0 μl 模板DNA，8.0 μl ddH₂O。

qPCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，45個(gè)循環(huán)。熔解曲線：95 ℃ 15 s，95 ℃ 1 min，60 ℃ 15 s。

1.5 Western Blot

取0.1 g本氏煙葉片，用200 μl蛋白質(zhì)提取緩沖液[0.125 mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl），4.00%十二烷基硫酸鈉（SDS），20.00%甘油（Glycerol），2.00%巰基乙醇（Mercaptoethanol），0.05% 溴酚藍(lán)（Bromophenol blue）]研磨，于95 ℃、10 min煮沸后置于預(yù)冷的4 ℃離心機(jī)中，12 000 r/min離心5 min，取上清液，獲得蛋白質(zhì)提取液，取適量蛋白質(zhì)提取液，進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）（130 V，80 min），電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)至聚氯乙烯膜，在室溫下置于自動(dòng)搖床上，于70 r/min孵育1 h，用磷酸鹽吐溫緩沖液（1×PBST）洗脫3次，每次5 min。以α-ToMMV蛋白質(zhì)抗體（由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存）作為一抗孵化1.5 h后，用1×PBST溶液洗脫3次，每次5 min，用HRP標(biāo)記二抗（碧云天公司產(chǎn)品，中國(guó)）于脫色搖床常溫孵育1 h后，再用1×PBST溶液洗脫3次，每次5 min。使用高敏型ECL（化學(xué)發(fā)光底物）化學(xué)發(fā)光試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品）檢測(cè)電轉(zhuǎn)化后的聚氯乙烯膜，取1 ml 化學(xué)發(fā)光底物（ECL）Buffer A、1 ml ECL Buffer B液體等體積混勻后均勻滴加到電轉(zhuǎn)后的聚氯乙烯膜上，在室溫下孵育1～2 min后放在化學(xué)發(fā)光成像儀器（Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)）下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 本氏煙組蛋白基因H4的克隆及組蛋白H4特征分析

H4基因全長(zhǎng)312 bp（圖1A），編碼1個(gè)由102個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)（相對(duì)分子質(zhì)量為11 400），該蛋白質(zhì)具有1個(gè)保守的組蛋白折疊域（HFD）^[25]，其中包含3個(gè)串聯(lián)的α-螺旋，兩端是N末端、C末端，這2個(gè)區(qū)段易發(fā)生轉(zhuǎn)錄后修飾，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用明顯^[26]，組蛋白H4的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1B。

2.2 ToMMV外殼蛋白（CP）與組蛋白H4的互作驗(yàn)證

近年來(lái)，熒光素酶互補(bǔ)成像（Luciferase complementation imaging，LCI）技術(shù)因具有可量化、高靈敏度的特征而在蛋白質(zhì)互作試驗(yàn)中被廣泛使用^[26]，本試驗(yàn)擬通過(guò)此方法分析CP與組蛋白H4之間的互作關(guān)系。nLUC-CP與cLUC-H4共浸潤(rùn)本氏煙，2 d后對(duì)煙草葉片噴施熒光素酶，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察熒光素酶的活性。如圖2A所示，與含有空載體的農(nóng)桿菌一起被浸潤(rùn)的所有陰性對(duì)照中，熒光信號(hào)都沒(méi)有被檢測(cè)出來(lái)，只有共表達(dá)的nLUC-CP+cLUC-H4試驗(yàn)組能檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)。上述結(jié)果表明，ToMMV CP與組蛋白H4能在煙草細(xì)胞中發(fā)生相互作用。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證CP與組蛋白H4在植物體內(nèi)的互作情況，筆者將CP基因、H4基因分別連入雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）載體YN、YC中，用農(nóng)桿菌浸潤(rùn)煙草葉片2 d后，通過(guò)激光共聚焦觀察本氏煙細(xì)胞內(nèi)的黃色熒光。BiFC結(jié)果表明，YN-CP和YC-H4共浸潤(rùn)煙草葉片后可以在細(xì)胞核位置觀察到點(diǎn)狀YFP熒光，表明ToMMV CP和組蛋白H4能夠在煙草葉片細(xì)胞中互作，其他組合均未觀察到熒光（圖2B）。

2.3 ToMMV CP和本氏煙組蛋白H4的亞細(xì)胞定位

為了明確ToMMV CP及本氏煙組蛋白H4的亞細(xì)胞定位，本研究分別構(gòu)建pHYG-CFP-CP、pHYG-YFP-H4重組表達(dá)載體。用含有pHYG-CFP-CP、pHYG-YFP-H4質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液和含有mCherry-H2B質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液共浸潤(rùn)本氏煙葉片，其中mCherry-H2B的主要作用為細(xì)胞核紅色熒光標(biāo)記，接種后2 d，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察熒光。結(jié)果顯示，ToMMV CP定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中，組蛋白H4定位于細(xì)胞核中（圖3A），兩者共定位于細(xì)胞核中（圖3B）。

2.4 本氏煙沉默H4基因抑制ToMMV的侵染

為了進(jìn)一步明確組蛋白H4對(duì)ToMMV侵染植株的影響，利用TRV誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)沉默H4基因，以TRV-GUS、TRV-PDS為對(duì)照，TRV-H4通過(guò)農(nóng)桿菌浸潤(rùn)對(duì)六葉期的本氏煙進(jìn)行H4基因沉默，相關(guān)結(jié)果見(jiàn)圖4。當(dāng)陰性對(duì)照TRV-PDS出現(xiàn)白化癥狀時(shí)，取試驗(yàn)組的系統(tǒng)葉進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)H4基因的沉默效率。結(jié)果顯示，H4基因的相對(duì)表達(dá)量顯著下降（圖4B）。

對(duì)沉默后的植株浸潤(rùn)接種ToMMV，并于接種后第4 d取其系統(tǒng)葉進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR以檢測(cè)病毒含量。結(jié)果表明，H4基因沉默后，ToMMV CP基因在本氏煙中的積累量降低（圖4A），病毒在系統(tǒng)葉中的復(fù)制水平顯著低于對(duì)照（圖4B），表明H4基因的沉默會(huì)影響ToMMV的侵染，組蛋白H4可能是ToMMV侵染植物的感病因子。

3 討論

病毒外殼蛋白的主要功能是形成衣殼，保護(hù)病毒基因組，以防降解^［27］。然而，除了結(jié)構(gòu)功能外，外殼蛋白在病毒的感染周期和寄主植物對(duì)病毒感染的防御反應(yīng)中還有許多其他重要功能^[28]，包括參與病毒的蚜傳^[29]、病毒的長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)^[30]和胞間運(yùn)動(dòng)^[31]、病毒癥狀的形成等^[32-33]。以此可見(jiàn)，CP在病毒侵染植株的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，因此研究CP的互作因子對(duì)了解病毒侵染過(guò)程及其致病機(jī)制有著十分重要的意義^[34]。已有的研究結(jié)果表明，水稻矮縮病病毒外殼蛋白P2可以與植物體內(nèi)恩特-貝殼杉烯氧化酶（Ent-kaurene oxidases）互作，導(dǎo)致水稻產(chǎn)生矮縮癥狀^[35]。Li等^[36]研究發(fā)現(xiàn)，煙草IP-L與煙草花葉病毒（ToMV）CP間存在相互作用，ToMV CP同IP-L的互作會(huì)影響植物的光合作用，從而引起植株黃化癥狀。黃瓜綠斑駁花葉病毒外殼蛋白與煙草RPL14存在互作，這種互作可能會(huì)影響病毒的增殖機(jī)制^[37]。本研究選擇番茄斑駁花葉病毒CP作為誘餌篩，在煙草中篩選到與其互作的組蛋白H4，這是關(guān)于ToMMV CP與植物組蛋白互作的首次報(bào)道，為T(mén)oMMV CP功能的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

組蛋白是構(gòu)成真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)蛋白^[38-39]，在某些情況下組蛋白中的特定氨基酸位點(diǎn)可發(fā)生甲基化、乙?；缺碛^遺傳學(xué)修飾^[40]。在表觀遺傳調(diào)控中，這些不同位點(diǎn)的不同修飾作用是不一樣的^[41]。研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母組蛋白H4 K16位點(diǎn)與酵母乙酸耐受性相關(guān)^[42]。對(duì)擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)減少開(kāi)花抑制因子FLC的組蛋白H4賴(lài)氨酸5（H4K5ace）的乙?；?，會(huì)使植物提前開(kāi)花^[43-44]。此外，組蛋白H4的乙?；腔虮磉_(dá)激活的標(biāo)志，這些標(biāo)志在動(dòng)物病毒基因組特別是動(dòng)物病毒基因激活和再激活的調(diào)控區(qū)域的富集，是病毒從感染潛伏狀態(tài)到烈性感染狀態(tài)轉(zhuǎn)變的重要因素^[45]。本研究在沉默本氏煙H4后發(fā)現(xiàn)，ToMMV的侵染能力下降，表明H4在ToMMV與寄主互作的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，由此筆者推測(cè)，病毒編碼的CP在細(xì)胞核內(nèi)通過(guò)影響組蛋白的修飾等，進(jìn)而使病毒完成系統(tǒng)侵染。

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（責(zé)任編輯：徐 艷）