楊麗媛，王朝陽，陳俊磊，邱玨琳，杜彩霞，魏英煥，郝小江,4*，顧 瑋*

1. 貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550014

2. 貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽 550014

3. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025

4. 中國科學(xué)院昆明植物研究所，云南 昆明 650201

牛耳朵Primulinaeburnea(Hance) Y. Z. Wang是苦苣苔科（Gesneriaceae）報春苣苔屬PrimulinaHance 植物牛耳朵的全草。別名為巖白菜、石三七、石虎耳等，主產(chǎn)于貴州、廣西、廣東、湖南、湖北、四川等地。在《貴州民族常用天然藥物》記載，牛耳朵根莖或全草入藥，具有清肺止咳、涼血止血、解毒等功效，主要用于治療陰虛肺熱、咳嗽咯血、崩漏、帶下、癰腫瘡毒、外傷出血等癥[1]。對牛耳朵的化學(xué)成分研究報道較少，目前僅有對于廣西產(chǎn)牛耳朵的化學(xué)成分的研究報道，共從中鑒定27 個化合物，主要涉及苯乙醇苷類、醌類、黃酮類以及萜類等類型[2-8]。初步藥理學(xué)研究表明其有抗腫瘤、抗菌、降壓和抗氧化等作用[9-10]，藥理活性篩選主要針對牛耳朵乙醇提取物，且對單體化合物的藥理活性研究較少。研究證明牛耳朵中的部分化合物尤其是蒽醌類化合物對人肺癌細胞株SPC-A1 有一定的細胞毒活性和顯著的DPPH 自由基清除活性[4-5]。目前尚未見到對黔產(chǎn)牛耳朵進行化學(xué)成分研究。因此本研究擬對黔產(chǎn)牛耳朵的化學(xué)成分進行系統(tǒng)的分離鑒定，并重點對其體外細胞毒活性和抗氧化活性進行研究。

從牛耳朵醋酸乙酯萃取部位中共分離23 個化合物，分別鑒定為 1,6-dihydroxy-7-methoxy-2-methylanthr-quinone （ 1 ）、 soranjidiol （ 2 ）、1,4,7-trihydroxy-2-methyl-9,10-anthraquinone（3）、digiferruginol（4）、1,4-dihydroxy-2-hydroxymethyl-9,10-anthraquinone（5）、1,6,7-trihydroxy-2-methyl-9,10-anthracenedione （ 6 ）、 (R)-7,8-dihydroxy-αdunnione （ 7 ）、 3-amino-2-methoxycarbonyl-1,4-naphthoquinone（8）、木犀草素（luteoline，9）、異落葉松脂素 [(+)-isolariciresinol，10]、七葉內(nèi)酯（esculetin，11）、酪醇（tyrosol，12）、對香豆酸（p-coumaric acid，13）、咖啡酸甲酯（caffeic acid methy ester，14）、benzylO-β-D-glucopyranoside（ 15 ）、 4-O-benzyl-D-glucopyranoside （ 16 ）、3,4-dihydroxyphenylethyl alcohol 8-O-β-glucopyrnoside（17）、cuneataside A（18）、對羥基苯甲醛（4-hydroxybenzaldehyde，19）、尼泊金甲酯（methyl-4-hydroxybenzoate，20）、對羥基苯乙酮[1-(4-hydroxyphenyl)-ethanone ， 21] 、 香 草 醛（vanillin，22）、香草酸（vanillic acid，23）。其中，化合物16 為新天然產(chǎn)物。化合物1～3、6 和8～22為首次從報春苣苔屬植物中分離得到。進一步對分離得到化合物采用MTT 法篩選對人非小細胞肺癌A549 細胞的細胞毒活性；采用DPPH 法和ABTS法篩選其體外抗氧化活性。

1 材料與儀器

柱色譜硅膠（40～80、200～300、300～400 目）和薄層柱色譜硅膠GF254（青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20 凝膠（Pharmacia 公司，美國）；HITACHI 高效液相色譜儀（Primaide，日立高新技術(shù)集團，日本）；反相填充材料RP-18（Merck 公司，德國）；HPLC 色譜柱為Zorbax SB-C18（半制備柱，250 mm×9.4 mm，5 μm，安捷倫公司，美國）；EYELA OSB-2200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會社，日本）；INOVA-600MHz 核磁共振波譜儀（Bruker 公司，德國）；HP 1100 型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（惠普公司，美國）；API Qstar Pulsar 質(zhì)譜儀BioTek Epoch 全波長酶標儀（BioTek 公司，美國）。本實驗所用石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、丙酮、甲醇等有機溶劑均為工業(yè)級，重蒸后使用；色譜級的甲醇（云南新藍景化學(xué)工業(yè)有限公司）；氘代試劑（美國Cambridge Isotope Laboratories 公司）。人肺癌細胞A549 來源于ATCC。L-抗壞血酸（VC）購于上海麥克林生化科技有限公司；水溶性維生素E（VE）購于上海源葉生物科技有限公司。

牛耳朵全草于2021年3月采自貴州省安順市紫云苗族布依族自治縣巖上村，經(jīng)貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室顧瑋副研究員鑒定為牛耳朵P.eburnea(Hance) Y. Z. Wang，憑證標本（GZCNP-G-2021-003）保存在貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室。

2 方法

2.1 提取與分離

牛耳朵干燥全草30 kg 粉碎后過40 目篩，之后用80%甲醇水溶液加熱回流提取6 次（每次3 h）過濾，合并濾液，減壓濃縮得提取物浸膏（2.9 kg），用適量的水溶解浸膏成懸濁液，依次用石油醚，醋酸乙酯和正丁醇萃取至無色，減壓濃縮各部分萃取液得到石油醚部位（505.0 g）、醋酸乙酯部位（210.0 g）和正丁醇部位（1.1 kg）。將醋酸乙酯部位（210.0 g）用硅膠柱色譜（40～80 目）進行分離，洗脫溶劑為石油醚-醋酸乙酯（50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1）及三氯甲烷-甲醇（20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1），結(jié)合TLC 檢測，將牛耳朵醋酸乙酯層分離得到9 個組分（Fr. A～I）。Fr. D（16.0 g）用硅膠柱色譜（200～300 目）進行分離，石油醚-醋酸乙酯（20∶1～2∶1）梯度洗脫得到Fr. D.1～D.6。Fr. D.4（1.7 g）經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜得到化合物2（10.8 mg）和3（3.4 mg）。Fr. D.4.4（215.7 mg）經(jīng)半制備RP-HPLC（甲醇-水-甲酸40∶60∶0.04，2.0 mL/min）得到化合物19（15.2 mg，tR＝13.6 min）、20（2.4 mg，tR＝26.7 min）和22（16 mg，tR＝28.5 min）。Fr. D.5（1.8 g）在濾出不溶性粉末（Fr. D.5a）后經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜得到化合物1（8.1 mg）、4（4.1 mg）和21（15.9 mg）。Fr. D.5a（272.0 mg）先用硅膠柱色譜（200～300 目）進行分離，石油醚-醋酸乙酯（30∶1～20∶1）梯度洗脫，后經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜得到化合物5（22.3 mg）。Fr. E（5.4 g）用硅膠柱色譜（200-300目）進行分離，石油醚-醋酸乙酯（10∶1～1∶1）梯度洗脫得到Fr. E.1～E.4。Fr. E.3（2.5 g）用硅膠柱色譜（200～300 目）進行分離，三氯甲烷-醋酸乙酯（200∶1～10∶1）梯度洗脫得到化合物8（4.8 mg）、12（24.7 mg）、13（42 mg）和23（31 mg）。Fr. F（22.3 g）先經(jīng)RP-C18柱色譜，甲醇-水（20∶80～100∶0）洗脫得到Fr. F.1～F.14。Fr. F.8 經(jīng)重結(jié)晶得到化合物9（15.4 mg）。Fr. G（15.9 g）用RP-C18反相柱色譜，甲醇-水（10∶90～100∶0）洗脫得到Fr. G.1～G.9。Fr. G.2（590.0 mg）先用Sephadex LH-20 凝膠柱色譜分離，后經(jīng)硅膠柱色譜（200～300目）分離，三氯甲烷-甲醇（60∶1～20∶1）洗脫得到化合物11（7 mg）。Fr. G.3（2.5 g）用硅膠柱色譜（200～300 目）進行分離，三氯甲烷-甲醇（100∶1～2∶1）洗脫得到Fr. G.3. 1～G.3. 7。Fr. G.3. 4（93.0 mg）經(jīng)半制備RP-HPLC（甲醇-水-甲酸30∶70∶0.04，2.0 mL/min）純化得到化合物10（59 mg，tR＝51.6 min）。Fr. G.3. 6（817 mg）用硅膠柱色譜（200～300目）進行分離，三氯甲烷-丙酮（20∶1～1∶1）得到化合物14（4 mg）。Fr. G.3. 7（547.0 mg）經(jīng)半制備RP-HPLC（甲醇-水-甲酸35∶65∶0.04，2.0 mL/min）得到化合物15（6.7 mg，tR＝41.4 min）和16（8.3 mg，tR＝89 min）。Fr. G.6（967 mg）用硅膠柱色譜（200～300 目）進行分離，三氯甲烷-甲醇（100∶1～5∶1）洗脫得到化合物6（20 mg）。Fr. H（72.7 g）用RP-C18柱色譜，甲醇-水（10∶90～100∶0）洗脫得到Fr. H.1～H.9。Fr. H.3（11.9 g）用硅膠柱色譜（200～300 目）進行分離，三氯甲烷-甲醇（15∶1～1∶1）洗脫得到Fr. H.3. 1～H.3. 5。Fr. H.3. 5（8.4 g）用Sephadex LH-20 凝膠柱色譜分離得到化合物17（2.3 mg）和18（7.3 mg）。Fr. H.7（670 mg）用硅膠柱色譜（200～300 目）進行分離，石油醚-醋酸乙酯（8∶1～1∶1）洗脫得到化合物7（15 mg）。

2.2 細胞毒活性篩選

2.2.1 A549 細胞培養(yǎng) 將A549 細胞復(fù)蘇后，用含有10% FBS 血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)生長，于5%CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.2 MTT 法檢測牛耳朵化學(xué)成分對A549 的細胞毒活性 該實驗參考文獻報道的方法[11]稍加修改，取對數(shù)生長期的非小細胞肺癌A549 細胞，以5×103/孔的密度接種到無菌的96 孔培養(yǎng)板。待細胞貼壁后，設(shè)置空白組、對照組和實驗組。實驗組分別加入不同濃度化合物溶液。培養(yǎng)48 h 后，每孔分別加入MTT（5 mg/mL）溶液10 μL，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL，充分震蕩后溶解結(jié)晶，之后用酶標儀在490 nm 波長下檢測各孔吸光度（A）值，按照下面公式計算細胞生長抑制率。每組設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。對于在質(zhì)量濃度100 μg/mL下抑制率大于50%的化合物繼續(xù)進行濃度梯度實驗，并計算半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值。

2.3 抗氧化活性篩選

本研究分別用DPPH 方法和ABTS 方法對化合物的抗氧化活性進行篩選。DPPH 自由基清除活性研究參考本課題組前期報道的方法[12]。ABTS+自由基清除活性實驗參考文獻報道的方法[13]。取7 mmol/L 的 ABTS+與 2.6 mmol/L 的過硫酸鉀（K2S2O8）溶液等體積混合均勻后室溫避光靜置過夜，臨用前用甲醇溶液將ABTS+儲備液進行稀釋，使其A值在734 nm 下為0.70±0.02，制成ABTS工作液。將不同質(zhì)量濃度（30、10、3.333 3、1.111 1、0.370 3、0.123 4 μg/mL）的樣品溶液添加到稀釋的ABTS+溶液中，混勻，避光反應(yīng)6 min 后，用酶標儀在734 nm 下測定A值。以ABTS+工作液與無水甲醇溶液混合作為背景組（A0）。以VE 為陽性藥，所有測定均平行重復(fù)3 次，計算IC50值?；衔飳BTS+自由基的清除率可按照公式計算得出。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末，分子式C16H12O5，ESI-MSm/z: 285 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ:7.51 (1H, d,J= 7.5 Hz, H-3), 7.58 (1H, d,J= 7.5 Hz,H-4), 7.50 (1H, s, H-5), 7.48 (1H, s, H-8), 2.25 (3H, s,-CH3), 3.95 (3H, s, -OCH3), 12.87 (1H, s, 1-OH)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 159.8 (C-1), 133.5(C-2), 136.9 (C-3), 114.7 (C-4), 131.2 (C-4a), 118.4(C-5), 152.9 (C-6), 153.4 (C-7), 108.9 (C-8), 126.6(C-8a), 188.1 (C-9), 112.1 (C-9a), 180.6 (C-10), 127.4(C-10a), 15.7 (-CH3), 56.0 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[14]，鑒定化合物1 為1,6-dihydroxy-7-methoxy-2-methylanthr-quinone。

化合物2：橙黃色粉末，分子式C16H12O5，ESI-MSm/z: 253 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 7.54 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-3), 7.62 (1H,d,J= 7.6 Hz, H-4), 7.48 (1H, d,J= 2.5 Hz, H-5), 7.22(1H, dd,J= 2.5, 8.5 Hz, H-7), 8.02 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-8), 2.26 (3H, s, -CH3), 12.74 (1H, s, 1-OH)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 159.7 (C-1), 133.1(C-2), 137.2 (C-3), 118.2 (C-4), 130.9 (C-4a), 111.8(C-5), 162.9 (C-6), 125.0 (C-7), 129.6 (C-8), 121.8(C-8a), 188.4 (C-9), 114.8 (C-9a), 180.1 (C-10), 134.6(C-10a), 15.4 (-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[15]，故鑒定化合物2 為soranjidiol。

化合物3：紅色粉末，分子式C15H10O5，ESI-MSm/z: 269 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ:7.24 (1H, s, H-3), 8.04 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-5), 7.22(1H, dd,J= 2.5, 8.5 Hz, H-6), 7.47 (1H, d,J= 2.5 Hz,H-8), 2.22 (3H, s, -CH3), 13.06 (1H, s, 1-OH), 12.94(1H, s, 4-OH)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ:156.9 (C-1), 112.2 (C-2), 129.3 (C-3), 156.5 (C-4),110.8 (C-4a), 130.0 (C-5), 122.5 (C-6), 164.0 (C-7),112.6 (C-8), 135.5 (C-8a), 187.3 (C-9), 139.9 (C-9a),185.6 (C-10), 125.2 (C-10a), 16.3 (-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[16]，故鑒定化合物 3 為1,4,7-trihydroxy-2-methyl-9,10-anthraquinone。

化合物4：黃色粉末，分子式C15H10O4，ESI-MSm/z: 253 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ:7.91 (1H, d,J= 7.7 Hz, H-3), 7.77 (1H, d,J= 7.7 Hz,H-4), 8.19～8.21 (1H, m, H-5), 7.94～7.97 (2H, m,H-6, 7), 8.24～8.25 (1H, m, H-8), 4.66 (2H, s, H-1′),12.77 (1H, s, 1-OH), 5.48 (1H, s, 1′-OH)；13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 158.4 (C-1), 138.3 (C-2),133.6 (C-3), 118.9 (C-4), 131.3 (C-4a), 126.6 (C-5),135.2 (C-6), 134.6 (C-7), 126.9 (C-8), 132.8 (C-8a),188.7 (C-9), 114.9 (C-9a), 181.8 (C-10), 133.3(C-10a), 57.5 (C-1′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[16]，故鑒定化合物4 為digiferruginol。

化合物5：紅色粉末，分子式C15H10O5，ESI-MSm/z: 269 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ:7.27 (1H, s, H-3), 8.22 (2H, dd,J= 5.0, 4.0 Hz, H-5,8), 7.99～7.91 (2H, m, H-6, 7), 4.57 (2H, s, H-1′),12.93 (1H, s, 1-OH), 12.68 (1H, s, 4-OH), 5.57 (1H, s,1′-OH)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 154.2(C-1), 144.7 (C-2), 124.5 (C-3), 157.0 (C-4), 110.7(C-4a), 126.5 (C-5), 134.9 (C-6), 135.0 (C-7), 126.5(C-8), 132.8 (C-8a), 186.2 (C-9), 111.4 (C-9a), 186.9(C-10), 132.6 (C-10a), 57.5 (C-1′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[16]，故鑒定化合物 5 為1,4-dihydroxy-2-hydroxymethylanthraquinone。

化合物6：黃色粉末，分子式C16H12O5，ESI-MSm/z: 269.1 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.53 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-3), 7.46 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-4), 7.44 (1H, s, H-5), 7.47 (1H, s, H-8), 2.22(3H, s, -CH3), 12.97 (1H, s, 1-OH)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 159.8 (C-1), 133.5 (C-2), 136.7(C-3), 118.3 (C-4), 131.2 (C-4a), 113.1 (C-5), 151.4(C-6), 152.2 (C-7), 112.7 (C-8), 127.3 (C-8a), 187.9(C-9), 114.8 (C-9a), 180.8 (C-10), 126.1 (C-10a), 15.7(-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[17]，故鑒定化合物6 為1,6,7-trihydroxy-2-methylanthracene-9,10-dione。

化合物7：紅色粉末，分子式C15H14O5，ESI-MSm/z: 273.1 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 5.39 (1H, q,J= 6.4, 12.9 Hz, H-2), 8.16 (1H, d,J=8.2 Hz, H-5), 7.89 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-6), 2.17 (3H,d,J= 6.9 Hz, 2-CH3), 2.18 (3H, s, 3α-CH3), 1.98 (3H,s, 3β-CH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 90.9(C-2), 44.7 (C-3), 131.4 (C-3a), 180.6 (C-4), 124.0(C-4a), 119.7 (C-5), 119.9 (C-6), 152.1 (C-7), 150.5(C-8), 115.1 (C-8a), 183.0 (C-9), 157.9 (C-9a), 14.7(-CH3), 25.4 (3α-CH3), 20.3 (3β-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[5]，故鑒定化合物 7 為(R)-7,8-dihydroxy-α-dunnione。

化合物8：黃色粉末，分子式C12H9NO4，ESI-MSm/z: 254 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ:8.09 (d,J= 7.8 Hz, H-5), 7.71 (t,J= 7.8 Hz, H-6),7.82 (t,J= 7.8 Hz, H-7), 8.23 (d,J= 7.8 Hz, H-8),3.95 (3H, s, H-12), 9.12 (1H, brs, -NH2), 6.98 (1H,brs, -NH2)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 172.9(C-1), 101.6 (C-2), 153.2 (C-3), 180.7 (C-4), 126.4(C-5), 136.1 (C-6), 132.6 (C-7), 127.6 (C-8), 129.7(C-9), 134.2 (C-10), 169.6 (C-11), 52.3 (C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[18]，故鑒定化合物8 為3-amino-2-methoxycarbonyl-1,4-naphthoquinone。

化合物9：黃色粉末，分子式C15H10O6，ESI-MSm/z: 285 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ:6.66 (1H, s, H-3), 6.18 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-6), 6.44(1H, d,J= 2.1 Hz, H-8), 7.40 (1H, d,J= 2.3 Hz,H-2′), 6.89 (1H, d,J= 8.3 Hz, H-5′), 7.41 (1H, dd,J=2.3, 8.3 Hz, H-6′), 12.97 (1H, s, 5-OH)；13C-NMR(150 MHz, CD3OD)δ: 163.9 (C-2), 102.9 (C-3), 181.7(C-4), 161.5 (C-5), 98.9 (C-6), 164.2 (C-7), 93.9(C-8), 157.3 (C-9), 103.7 (C-10), 121.5 (C-1′), 113.4(C-2′), 145.8 (C-3′), 149.8 (C-4′) , 116.1 (C-5′), 119.0(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[19]，故鑒定化合物9 為木犀草素。

化合物10：無色油狀物，分子式C20H24O6，ESI-MSm/z: 359 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 1.97～2.03 (1H, m, H-2), 1.74～1.78 (1H,m, H-3), 2.77 (2H, d,J= 7.7 Hz, H-4), 6.65 (1H, s,H-5), 6.18 (1H, s, H-8), 6.67 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-2′),6.74 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-5′), 6.61 (1H, dd,J= 1.8,8.0 Hz, H-6′), 3.70 (1H, dd,J= 4.1, 11.3 Hz, H-9a),3.39 (1H, dd,J= 4.1, 11.3 Hz, H-9b), 3.64～3.67 (2H,m, H-10), 3.80 (3H, s, -OMe), 3.87 (3H, s, -OMe)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 48.0 (C-1), 47.9(C-2), 39.9 (C-3), 33.6 (C-4), 129.9 (C-4a), 112.3(C-5), 147.2 (C-6), 145.9 (C-7), 117.4 (C-8), 138.6(C-8a), 62.2 (C-9), 65.9 (C-10), 134.1 (C-1′), 113.8(C-2′), 149.0 (C-3′), 145.2 (C-4′), 116.0 (C-5′), 123.2(C-6′), 56.3 (-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[20]，故鑒定化合物10 為異落葉松脂素。

化合物11：無色片狀晶體（三氯甲烷/甲醇），分子式C15H10O6，ESI-MSm/z: 177 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 6.16 (1H, d,J= 9.4 Hz, H-3), 7.86 (1H, d,J= 9.4 Hz, H-4), 6.98 (1H, s,H-5), 6.74 (1H, s, H-8)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 160.8 (C-2), 111.5 (C-3), 144.5(C-4),112.3 (C-5), 142.9 (C-6), 150.5 (C-7), 102.6 (C-8),148.5 (C-9), 110.7 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[21]，故鑒定化合物11 為七葉內(nèi)酯。

化合物12：白色針晶（甲醇），分子式C8H10O2，ESI-MSm/z: 137.1 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 3.71 (1H, t,J= 7.2 Hz, H-1), 2.74 (1H, t,J= 7.2 Hz, H-2), 7.06 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-4), 6.71(1H, d,J= 8.5 Hz, H-5), 6.71 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-7),6.71 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-8)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 64.6 (C-1), 39.4 (C-2), 130.9 (C-3), 130.9(C-4), 116.1 (C-5), 156.7 (C-6), 116.1 (C-7), 130.9(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[22]，故鑒定化合物12 為酪醇。

化合物13：白色針晶（丙酮），分子式C9H8O3，ESI-MSm/z: 163 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 7.42 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-2, 6), 6.81 (2H,d,J= 8.6 Hz, H-3, 5), 7.60 (1H, d,J= 16 Hz, H-7),6.28 (1H, d,J= 16 Hz, H-8)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 127.2 (C-1), 131.1 (C-2), 116.8 (C-3),161.1 (C-4), 116.8 (C-5), 131.1 (C-6), 146.7 (C-7),115.6 (C-8), 171.0 (C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[23]，故鑒定化合物13 為對香豆酸。

化合物14：棕黃色粉末，分子式C10H10O4，ESI-MSm/z: 193 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 7.07 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-2), 6.81 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-5), 6.97 (1H, dd,J= 2.0, 8.2 Hz, H-6),6.29 (1H, d,J= 15.9 Hz, H-7), 7.57 (1H, d,J= 15.9 Hz, H-8), 3.78 (3H, s, -OCH3)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 127.7 (C-1), 115.1 (C-2), 146.8 (C-3),149.6 (C-4), 116.5 (C-5), 122.9 (C-6), 114.8 (C-7),147.0 (C-8), 169.8 (C = O), 52.0 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[24]，故鑒定化合物14 為咖啡酸甲酯。

化合物15：淡黃色油狀物，分子式C14H20O8，ESI-MSm/z: 293 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 7.46 (2H, d,J= 7.3 Hz, H-2, 6), 7.36 (2H,t,J= 7.3 Hz, H-3, 5), 7.30 (1H, t,J= 7.3 Hz, H-4),4.98 (1H, d,J= 11.4 Hz, overlapped, H-7a), 4.72 (1H,d,J= 11.4 Hz, H-7b), 4.46 (1H, d,J= 7.7 Hz, H-1′),3.40～3.60 (4H, m, H-2′～5′), 3.94 (1H, d,J= 11.4 Hz, H-6′a), 3.76 (1H, dd,J= 4.5, 11.4 Hz, H-6′b)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 138.9 (C-1), 129.3(C-2, 6), 129.1 (C-3, 5), 128.7 (C-4), 69.9 (C-7), 103.3(C-1′), 73.5 (C-2′), 77.9 (C-3′), 71.9 (C-4′), 78.9(C-5′), 62.5 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[25]，故 鑒 定 化 合 物 15 為 benzylO-β-Dglucopyranoside。

化合物16：淡黃色油狀物，分子式C13H18O6，ESI-MSm/z: 293 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 7.45 (2H, d,J= 7.2 Hz, H-2, 6), 7.36 (2H,d,J= 7.2 Hz, H-3, 5), 7.31 (1H, d,J= 7.2 Hz, H-4),4.98 (1H, d,J= 11.4 Hz, H-7a), 4, 72 (1H, d,J= 11.4 Hz, H-7b), 4.45 (1H, d,J= 6.0 Hz, H-1′), 3.42 (1H, m,H-2′), 3.47～3.60 (3H, m, H-3′～5′), 3.94 (1H, d,J=11.4 Hz, H-6′a), 3.76 (1H, dd,J= 4.5, 11.4 Hz,H-6′b)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 138.9 (C-1),129.3 (C-2, 6), 129.2 (C-3, 5), 128.7 (C-4), 69.9(C-7), 103.3 (C-1′), 73.5 (C-2′), 77.9 (C-3′), 71.9(C-4′), 78.9 (C-5′), 62.5 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[26]，故鑒定化合物16 為4-O-benzyl-D-glucopyranoside。

化合物17：淡黃色油狀物，分子式C14H20O8，ESI-MSm/z: 317 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 6.72 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-2), 6.70 (1H, d,J= 1.9 Hz, H-5), 6.58 (1H, dd,J= 1.9, 8.0 Hz, H-6),2.18 (2H, m, H-7), 4.05 (1H, m, H-8a), 3.71 (2H, m,H-8b, H-6′a), 4.32 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-1′), 3.21 (1H,m, H-2′), 3.29 (2H, m, H-3′, H-4′), 3.38 (1H, m, H-5′),3.89 (1H, dd,J= 2.1, 12 Hz, H-6′b)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 131.5 (C-1), 116.3 (C-2), 146.1(C-3), 144.6 (C-4), 117.6 (C-5), 121.2 (C-6), 36.6 (C-7),72.1 (C-8), 104.3 (C-1′), 75.1 (C-2′), 77.9 (C-3′), 71.6(C-4′), 78.1 (C-5′), 62.7 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基 本 一 致[27]， 故 鑒 定 化 合 物 17 為 3,4-dihydroxyphenylethyl alcohol 8-O-β-glucopyrnoside。

化合物18：無色油狀物，分子式C14H18O8，ESI-MSm/z: 337 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 6.87 (1H, d,J= 1.5 Hz, H-2), 6.76 (1H, d,J= 8.1 Hz, H-5), 6.74 (1H, dd,J= 1.5, 8.1 Hz, H-6),4.56 (1H, dd,J= 2.8, 10.6 Hz, H-7), 3.97 (1H, dd,J=2.9, 12 Hz, H-8a), 3.69 (1H, dd,J= 10.7, 11.9 Hz,H-8b), 4.46 (1H, d,J= 7.7 Hz, H-1′), 3.19 (1H, dd,J= 7.7, 9.7 Hz, H-2′), 3.62 (1H, dd,J= 8.8, 9.4 Hz,H-3′), 3.43 (1H, dd,J= 8.8, 9.7 Hz, H-4′), 3.49 (1H,m, H-5′), 3.92 (1H, dd,J= 2.1, 12.0 Hz, H-6′a), 3.75(1H, dd,J= 5.5, 12.0 Hz, H-6′b)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 129.9 (C-1), 115.0 (C-2), 146.3(C-3), 146.5 (C-4), 116.1 (C-5), 119.4 (C-6), 78.8 (C-7),72.8 (C-8), 99.5 (C-1′), 80.9 (C-2′), 75.1 (C-3′), 71.8(C-4′), 79.8 (C-5′), 62.5 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[28]，故鑒定化合物18 為cuneataside A。

化合物19：無色針晶（丙酮），分子式C15H10O6，ESI-MSm/z: 285.1 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 6.16 (1H, d,J= 9.4 Hz, H-3), 7.86 (1H, d,J= 9.4 Hz, H-4), 6.98 (1H, s, H-5), 6.74 (1H, s, H-8)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 160.8 (C-2), 111.5(C-3), 144.5 (C-4), 112.3 (C-5), 142.9 (C-6), 150.5(C-7), 102.6 (C-8), 148.5 (C-9), 110.7 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[29]，故鑒定化合物19 為對羥基苯甲醛。

化合物20：無色針晶（甲醇），分子式C8H8O3，ESI-MSm/z: 151 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 7.84～7.91 (2H, m, H-2, 6), 6.81～6.86(2H, m, H-3, 5), 3.86 (3H, s, -OCH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 122.4 (C-1), 132.8 (C-2, 6), 116.2(C-3, 5), 163.6 (C-4), 168.8 (-CHO), 52.2 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[30]，故鑒定化合物20為尼泊金甲酯。

化合物21：白色針晶（氯仿），分子式C8H8O2，ESI-MSm/z: 135 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 7.94 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-2, 6), 6.97 (2H,d,J= 8.8 Hz, H-3, 5), 2.61 (3H, s, H-2′)；13C-NMR(150 MHz, CDCl3)δ: 129.7 (C-1), 131.4 (C-2), 115.7(C-3), 161.5 (C-4), 115.7 (C-5), 131.4 (C-6), 198.7(C-1′), 26.4 (C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[31]，故鑒定化合物21 為對羥基苯乙酮。

化合物22：白色針晶（甲醇），分子式C8H8O3，ESI-MSm/z: 151 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δ: 7.43 (1H, s, H-2), 6.94 (1H, d,J= 7.9 Hz,H-5), 7.42 (1H, d,J= 7.9 Hz, H-6), 9.74 (1H, s,-CHO), 3.91 (3H, s, -OCH3)；13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 130.6 (C-1), 111.3 (C-2), 149.7 (C-3), 154.7(C-4), 116.3 (C-5), 127.9 (C-6), 192.9 (-CHO), 56.4(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[32]，故鑒定化合物22 為香草醛。

化合物23：無色針晶（丙酮），分子式C8H8O4，ESI-MSm/z: 167 [M－H]-。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 7.44 (1H, s, H-2), 6.84 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-5), 7.44 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-6), 3.37 (3H, s,3-OCH3), 9.87 (1H, s, 4-OH), 12.5 (1H, s, -COOH)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 121.4 (C-1), 114.8(C-2), 147.0 (C-3), 150.8 (C-4), 112.5 (C-5), 123.2(C-6), 167.0 (-COOH), 55.3 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的基本一致[33]，故鑒定化合物23 為香草酸。

3.2 細胞毒活性評價

3.2.1 對A549 細胞的細胞毒活性初篩結(jié)果 根據(jù)“2.2”項下方法，對其中18 個化合物進行了體外抗腫瘤活性的實驗，結(jié)果如圖1 所示，在濃度為100 μmol/L 時，化合物8 對A549 細胞增殖抑制率大于50%，其他化合物沒有表現(xiàn)出顯著的細胞毒活性。因此，進一步對化合物8 進行濃度梯度實驗，計算其IC50值。

圖1 牛耳朵化合物 (100 μmol·L-1) 對A549 細胞細胞毒活性初篩結(jié)果Fig. 1 Preliminary screening results of cytotoxic activity of compounds (100 μmol L-1) from P. eburnea on A549 cell line

3.2.2 化合物8 對A549 細胞的IC50值 化合物8對A549 細胞有顯著的抑制作用（P＜0.01），其IC50＝（3.866±0.011）μmol/L，活性高于陽性藥順鉑[IC50＝（9.895±0.025）μmol/L]。

3.3 抗氧化活性篩選結(jié)果

根據(jù)“2.3”項下方法，對其中11 個化合物進行了體外抗氧化活性的實驗，發(fā)現(xiàn)有6 個化合物有顯著的抗氧化活性。結(jié)果見表1，化合物5～7、9～11 均表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性，其中化合物9 和11表現(xiàn)出的DPPH 自由基清除能力和ABTS 自由基清除能力均高于陽性藥VC 和VE。

表1 化合物的DPPH 和ABTS 自由基抑制活性的結(jié)果(±s , n=3)Table 1 Results of DPPH and ABTS+ radical inhibitory activities of selected compounds (x ±s , n=3)

表1 化合物的DPPH 和ABTS 自由基抑制活性的結(jié)果(±s , n=3)Table 1 Results of DPPH and ABTS+ radical inhibitory activities of selected compounds (x ±s , n=3)

化合物 IC50/(μg·mL-1)DPPH ABTS+5 7.270±0.046 2.184±0.005 6 0.548±0.036 0.259±0.049 7 0.625±0.024 0.362±0.020 9 0.161±0.013 0.960±0.041 10 1.190±0.043 0.588±0.023 11 0.024±0.011 0.225±0.012 VC 0.306±0.021 VE 1.502±0.041

4 討論

本實驗從黔產(chǎn)牛耳朵的醋酸乙酯部位分離鑒定了23 個化合物，包含8 個醌類化合物，1 個黃酮類化合物，1 個木質(zhì)素類化合物，1 個香豆素類化合物，8 個酚酸類化合物和4 個苷類化合物，其中化合物1～3、6 和8～22 為首次從報春苣苔屬植物中分離得到。化合物8 對A549 細胞表現(xiàn)出顯著的細胞毒活性。化合物5～7、9～11 均表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性，其中化合物9 和11 的抗氧化活性高于陽性藥VC 和VE。本研究揭示了黔產(chǎn)牛耳朵中的化學(xué)成分，并印證了牛耳朵化學(xué)成分的抗腫瘤活性和抗氧化活性，為貴州牛耳朵資源的進一步開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突