楊佩雯，張培良,2，韓竹箴，楊穎博,3，吳 弢*

1. 上海中醫(yī)藥大學中藥研究所，上海 201203

2. 安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012

3. 上海圖鋒醫(yī)藥科技有限公司，上海 201203

萊菔子RaphaniSemen是十字花科植物蘿卜RaphanussativusL. 的干燥成熟種子，收錄于《中國藥典》2020 年版一部，具有消食除脹和降氣化痰的功效，臨床常用于治療消化系統疾病和高血壓等[1-3]。目前從萊菔子中分離純化、鑒定的化合物主要為硫苷及其降解產物、生物堿、苯丙素及其衍生物、黃酮、萜類、甾體等[4]?，F代藥理研究表明，萊菔子中的水溶性生物堿能夠降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓[5]，芥子堿可顯著調節(jié)高脂血癥大鼠的血脂水平[6]，萊菔苷能夠促進大鼠離體回腸的運動[7]，萊菔素能夠抑制人乳腺癌細胞的增殖[8]和脂肪細胞的分化[9]，萊菔硫烷可通過促進白色脂肪細胞的褐變而減少肥胖小鼠的脂質累積[10]。

為了從萊菔子中尋找更多具有降脂活性的化合物，本研究從萊菔子70%乙醇提取物中分離、純化、鑒定了14 個化合物，分別為降萊菔硫代酸乙酯（ethyl norsulforaphanate，1）、萊菔酸甲酯（methyl raphanide，2）、芥子堿（sinapine，3）、(E)-2-(4-hydroxy-2-oxoindolin-3-ylidene)acetonitrile（4）、2-(4-hydroxy-2-oxoindolin-3-yl)acetonitrile（5）、6-methoxyindole-3-carboxylic acidO-β-Dglucopyranosyl ester（6）、cappariloside A（7）、3′,6-二芥子酰基蔗糖（3′,6-disinapoyl sucrose，8）、吐葉醇（vomifoliol，9）、3,4-二羥基苯甲醛（3,4-dihydroxybenzaldehyde，10）、3, 4-二羥基苯甲酸（3,4-dihydroxybenzoic acid，11）、5-羥甲基糠醛（5-hydroxy methylfurfural，12）、2-羥甲基-5-呋喃丙烯酸乙酯（2-hydroxymethyl-5-furanacrylic acid ethyl ester，13）和β-谷甾醇（β-sitosterol，14），結構見圖1。其中化合物1 和2 為新化合物，4、6、10、11 和13 為首次從萊菔子中分離得到的化合物。此外，通過3T3-L1 前脂肪細胞的胰島素抵抗模型對新化合物1和2 進行了體外調脂活性篩選。結果表明，化合物1和2 均具有潛在的調脂活性，化合物1 較化合物2 在5、10 μmol/L 下顯示出更好的調脂活性。本研究為充分開發(fā)和利用萊菔子提供了一定的理論依據。

圖1 化合物1～14 的結構Fig. 1 Structures of compounds 1—14

1 儀器與材料

Bruker AVANCE III 400 MHz 核磁共振波譜儀（瑞士Bruker 公司）；6545 四極桿飛行時間液質聯用系統（美國Agilent 公司）；LC-3000 型高效液相色譜儀（北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）；Capcell Pak C18MG II 制備液相色譜柱（250 mm×20 mm，5 μm，日本資生堂公司）；Sepacore 型中低壓制備色譜儀（瑞士BUICHI 公司）；BSA124S-CW 型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；Spectrum Two 型紅外光譜儀（美國PerkinElmer 公司）；TU-1901 型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；MILLPORE 型Milli-Q 純水儀（美國Bedford 公司）；BB150 型CO2恒溫箱（賽默飛世爾科技有限公司）；SYNERGY H4 型全功能酶標儀（美國BioTek 公司）；IX2 型全內反射熒光顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；CKX41 型生物顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；GENESPEED416 型低速離心機（基因有限公司）；100～200、200～300、300～400目硅膠（青島海洋化工廠分廠）；GF254薄層色譜硅膠板（煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）；制備純乙腈（上海泰坦科技股份有限公司）；二氯甲烷、甲醇、乙醇、醋酸乙酯、EDTA、MgSO4、NaHCO3（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；DMSO（翌圣生物科技有限公司）；胎牛血清、雙抗、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；PBS 緩沖液、DMEM 高糖培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒（大連美侖生物技術有限公司）；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（STBF2497V，質量分數≥99%，美國Sigma-Aldrich 公司）；地塞米松（S12HS194411，質量分數≥99%）、牛胰島素（J16HS187861，27 U/mg）、羅格列酮（W28D11H135759，質量分數≥98%）、尼羅紅染料（M18HS175211，BR，質量分數≥98%）、洛伐他?。ㄅ朅07HS190930，質量分數≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司。

3T3-L1 小鼠脂肪前體細胞購自中國科學院上海細胞庫。

萊菔子藥材（50 kg）2020 年11 月購買于安徽亳州市，由上海中藥標準化研究中心吳立宏研究員鑒定為十字花科植物蘿卜R.sativusL.的干燥成熟種子，標本憑證（lfz.202011）保存于上海中醫(yī)藥大學中藥研究所標本室。

2 提取與分離

稱取萊菔子藥材50 kg，粉碎，用70%乙醇水溶液冷浸提取，提取料液比1∶4，共提取5 次。50 ℃減壓回收試劑，得到總提取物浸膏質量約7438 g。取7398 g 總浸膏加8 L 水混懸，用8 L 醋酸乙酯分別萃取3 次，收集水部位和醋酸乙酯部位，低溫減壓濃縮得到水部位浸膏（7038 g）和醋酸乙酯部位浸膏（360 g）。取320 g 醋酸乙酯部位浸膏經硅膠柱色譜分離，石油醚-醋酸乙酯（20∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶1）以及二氯甲烷-甲醇（100∶1、80∶1、60∶1、40∶1、20∶1、10∶1、5∶1、0∶1）梯度洗脫，收集組分Fr. A～I。Fr. B 放置過夜后，析出晶體，得到化合物14（20 mg）。Fr. E 經閃柱色譜，用二氯甲烷-甲醇（100∶0、80∶1、60∶1、50∶1和0∶100）梯度洗脫，得到組分Fr. E1～5。Fr. E1經ODS 反相色譜柱色譜，用甲醇-水（2∶8、3∶8、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0）梯度洗脫，得到化合物12（2 mg）。Fr. F 經ODS 反相色譜柱色譜，用甲醇-水（1∶9、2∶8、3∶8、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0）梯度洗脫，得到組分Fr. F1～4，Fr. F4 經Sephadex LH-20 凝膠柱色譜，用石油醚-二氯甲烷-甲醇（5∶5∶1）等度洗脫，得到組分Fr. F4-1～F4-4。Fr. F4-3 用半制備高效液相純化得到化合物1（4 mg，tR=22 min，乙腈-水20∶80，8 mL/min）和9（8 mg，tR=30 min，乙腈-水20∶80，8 mL/min）。組分Fr. F3 經硅膠柱色譜，用二氯甲烷-甲醇（100∶0、100∶1、80∶1、60∶1、40∶1、20∶1、10∶1、5∶1、0∶1）梯度洗脫，得到組分Fr. F3-1～F3-2。組分Fr. F3-1 用半制備高效液相純化得到化合物5（2 mg，tR＝21 min，乙腈-水15∶85，8 mL/min）和化合物10（5 mg，tR＝22 min，乙腈-水15∶85，8 mL/min）。組分Fr. F2經凝膠柱色譜，甲醇為洗脫劑，得到組分Fr. F2-1～F2-3。組分Fr. F2-3 用半制備型高效液相純化得到化合物4（2 mg，tR＝35 min，乙腈-水20∶80，8 mL/min）。Fr. G 經ODS 反相色譜柱色譜，用甲醇-水（2∶8、3∶8、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0）梯度洗脫，得到組分Fr. G1～G10。組分Fr. G1 經硅膠柱色譜，用二氯甲烷-甲醇（100∶0、80∶1、60∶1、40∶1、30∶1）梯度洗脫，得到Fr. G1-1～G1-3。Fr. G1-2 用半制備型高效液相純化得到化合物2（14 mg，tR＝17 min，乙腈-水20∶80，8 mL/min）和11（29 mg，tR＝16 min，乙腈-水13∶87，8 mL/min）。組分Fr. G4 經70%甲醇凝膠柱分離后，用半制備型高效液相純化得到化合物13（2 mg，tR＝36 min，乙腈-水27∶73，8 mL/min）。Fr. H經ODS 反相色譜柱分離，用甲醇-水（2∶8、3∶8、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0）梯度洗脫，得到組分Fr. H1～4。組分Fr. H1 經硅膠柱色譜分離，采用醋酸乙酯-甲醇（100∶0、80∶1、60∶1、40∶1、15∶1）梯度洗脫，得到Fr. H1-1～H1-3。組分 Fr. H1-1 經凝膠柱分離，得到 Fr.H1-1-1～H1-1-4。Fr. H1-1-4 用半制備型高效液相純化，得到化合物7（3 mg，tR＝21 min，乙腈-水17∶83，8 mL/min）。組分Fr. H2 經硅膠柱分離，采用醋酸乙酯-甲醇（100∶0、80∶1、60∶1、40∶1、15∶1）體系洗脫，得到Fr. H2-1～H2-2。Fr. H2-2經制備型高效液相純化得到化合物6（4 mg，tR＝32 min，乙腈-水15∶85，8 mL/min）。Fr. H4 經薄層制備，得到化合物8（5 mg）。取50 g 水部位浸膏，經過反復硅膠柱色譜、凝膠柱色譜、制備液相色譜純化得到化合物3（19 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：無色油狀物；HR-ESI-MSm/z232.044 4[M＋Na]+（計算值為232.043 6，C7H15NNaO2S2），得到分子式為 C7H15NO2S2，不飽和度為 2。(nm): 244 (0.2)；IR 光譜顯示有S=O (1007 cm-1)、C=S (1193 cm-1) 等官能團的特征吸收峰。1H-NMR 譜（表1）中，在δH2.64 (3H, s, H-5) 處為1 個甲基亞磺?；鶜湫盘?，在δH3.64 (2H, td,J= 6.8,1.6 Hz, H-2)、2.84 (2H, m, H-4)、2.04 (2H, m, H-3) 處是3 個亞甲基氫信號；由13C-NMR 譜和DEPT 譜可知，在δC192.4 (C-1) 處有1 個氨基硫代甲酸酯的季碳信號，在δC52.3 (C-4)、44.5 (C-2)、23.1 (C-3) 處有3 個亞甲基碳信號，在δC38.2 (C-5) 處有1 個甲基亞磺?；夹盘枴Ｒ陨虾舜殴舱駭祿c文獻報道的Iberin[11]部分相似，兩者可能都有1 個3-(甲基亞磺酰基)丙基，但化合物1 的相對分子質量較Iberin多46，推測化合物1 可能比Iberin 多1 個-CH2OCH3或-OCH2CH3片段。根據1H-NMR 譜中δH4.44 (2H,q,J= 7.1 Hz, H-1′) 和1.29 (3H, t,J= 7.1 Hz, H-2′)處的氫信號和13C-NMR 譜中δC66.9 (C-1′) 和δC14.7 (C-2′) 處的碳信號，可判斷化合物1 較Iberin多1 個-OCH2CH3片段。為了進一步解析化合物1的結構，分析1H-1H COSY 譜（圖2）可知，δH4.44(2H, q,J= 7.1 Hz, H-1′)/1.29 (3H, t,J= 7.1 Hz,H-2′) 相關，以及δH3.64 (2H, td,J= 6.8, 1.6 Hz,H-2)/2.04 (2H, m, H-3)/2.84 (2H, m, H-4) 相關，分別構成兩個自旋偶合片段。結合HMBC 譜中H-4 (δH2.84) 與C-5 (δC38.2) 的遠程相關，說明化合物1 存在1 個3-(甲基亞磺酰基)丙基。經查閱SciFinder 數據庫，確定化合物1 為新化合物，并命名為降萊菔硫代酸乙酯。

圖2 化合物1 和2 的關鍵1H-1H COSY () 與HMBC相關 ()Fig. 2 Key 1H-1H COSY () and HMBC ()correlations of compounds 1 and 2

表1 化合物1 和2 的1H-NMR (400 MHz, CD3OD) 和 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) 數據Table 1 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) and 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) data of 1 and 2

化合物2：無色油狀物；HR-ESI-MSm/z214.051 7[M＋Na]+（計算值為214.050 8，C7H13NNaO3S），得到分子式為 C7H13NO3S，不飽和度為 3。(nm): 207 (0.2)；IR 光譜顯示有S=O (1015 cm-1)、C=O (1699 cm-1) 等官能團的特征吸收峰。1H-NMR 譜（表1）中，在δH6.45 (1H, m, H-4) 和6.54 (1H, d,J= 15.2 Hz, H-5) 處有1 組反式雙鍵氫信號，在δH3.25 (2H, t,J= 6.7 Hz, H-2) 和2.46 (2H,m, H-3) 處為2 組亞甲基氫信號，在δH3.62 (3H, s,-OCH3) 處有1 個氧甲基氫信號，在δH2.60 (3H, s,H-6) 處為甲基亞磺?；鶊F中的氫信號。由13C-NMR譜和DEPT 譜可知，在δC159.5 (C-1) 處有1 個酰胺的羰基碳信號，在δC139.0 (C-4)、 136.3 (C-5) 處為1 組雙鍵的烯碳信號，在δC33.4 (C-3)、40.4 (C-2)處有2 個亞甲基碳信號，在δC52.5 (C-1′) 處有1 個氧甲基碳信號，在δC40.4 (C-6) 處有1 個甲基亞磺酰基碳信號。以上 NMR 數據與 methyl-(E)-5-(methylsulfinyl) pent-4-enoate[12]的非常相似，推測兩者都有1 個4-(甲基亞磺?；?-3-烯丁基團，但化合物2 的相對分子質量比上述已知化合物多15，推測化合物2 中可能有1 個-NH-片段。為了進一步解析化合物1 的結構，分析1H-1H COSY 譜（圖2）可知，δH3.25 (H-2)/δH2.46 (H-3)/δH6.45 (H-4)/δH6.54(H-5) 相關，構成1 個自旋偶合系統。此外，HMBC譜中，H-6 (δH2.60) 與C-5 (δC136.3) 相關，判斷化合物2 有1 個4-(甲基亞磺?；?-3-烯丁基。比較兩者碳譜中對應位置的化學位移，發(fā)現化合物2 的C-2向低場位移了7.9 個化學位移，且HMBC 譜中C-1(δC159.5) 與H-2 (δH3.25) 具有遠程相關，說明C-1通過N原子與4-(甲基亞磺酰基)-3-烯丁基相連。經查閱SciFinder 數據庫，確定化合物2 為新化合物，并命名為萊菔酸甲酯。

化合物1 和2 均為甲硫氨酸的衍生物，但兩者的生成途徑不同。萊菔子中的脂肪族硫苷Glucoiberin 在黑芥子酶的作用下，先被降解為中間產物thiohydroximate-O-sulfonate，隨后通過羅森重排生成異硫氰酸酯Iberin。因為異硫氰酸酯中有一個親電性很強的碳原子，所以異硫氰酸酯很可能與親核試劑（乙醇）發(fā)生反應從而生成化合物1[13-14]。而化合物2 則可能是直接經過甲硫氨酸的側鏈延長，生成醛肟，然后通過貝克曼重排、氧化以及GRS1酶催化脫氫而生成的[14-15]（圖3）。根據生成途徑推測，化合物1 為異硫氰酸酯和乙醇的人工產物，而化合物2 的生成途徑不涉及甲醇、乙醇等試劑，所以化合物2 不是人工產物。

圖3 化合物1 和2 可能的生成途徑Fig. 3 Possible produced pathways of compounds 1 and 2

化合物3：黃色油狀物；分子式C16H24NO5；ESI-MSm/z310 [M]+；碘化鉍鉀試液顯橘紅色，1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.68 (1H, d,J= 15.9 Hz, H-7), 6.96 (2H, s, H-2, 6), 6.48 (1H, d,J= 15.9 Hz, H-8), 4.67 (2H, m, H-10), 3.89 (6H, s, 2×-OCH3), 3.83 (2H, s, H-11), 3.30 (9H, s, 3×-NCH3),以上波譜數據與文獻數據基本一致[16]，并且與芥子堿對照品薄層行為一致，鑒定化合物3 為芥子堿。

化合物4：淡黃色粉末；分子式C10H6N2O3；ESI-MSm/z209 [M＋Na]+；1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 7.16 (1H, m, H-6), 6.52 (1H, s, H-2), 6.47(1H, d,J= 8.4 Hz, H-5), 6.34 (1H, d,J= 7.6 Hz,H-7)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 167.3 (C-9),158.6 (C-4), 145.2 (C-7a), 144.9 (C-3), 135.7 (C-6),117.1 (C-1), 109.2 (C-5), 102.6 (C-7), 97.1 (C-2)。以上波譜數據與文獻數據基本一致[17]，鑒定化合物4 為(E)-2-(4-hydroxy-2-oxoindolin-3-ylidene) acetonitrile。

化合物5：淡黃色粉末；分子式C10H8N2O2；ESI-MSm/z187 [M－H]-；1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 7.09 (1H, t,J= 8.0 Hz, H-6), 6.51 (1H, d,J= 8.3 Hz, H-7), 6.45 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-5), 3.30(1H, m, H-3), 3.18 (2H, m, H-2)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 179.4 (C-9), 155.7 (C-4), 145.2(C-7a), 131.3 (C-6), 118.1 (C-1), 111.1 (C-5), 103.0(C-7), 41.9 (C-3), 17.4 (C-2)。以上波譜數據與文獻數據基本一致[17]，鑒定化合物5 為2,3-dihydro-4-hydroxy-2-oxo-1H-indole-3-acetonitrile。

化合物6：無色油狀物；分子式C16H19NO8；ESI-MSm/z352 [M－H]-；1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 3.56～3.40 (4H, m, H-2′～5′), 3.71 (1H,dd,J= 12.1, 4.7 Hz, H-6′b), 3.83 (3H, s, -OCH3), 3.87(1H, dd,J= 12.2, 2.0 Hz, H-6′a), 5.72 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-1′), 6.86 (1H, dd,J= 8.8, 2.3 Hz, H-5), 6.97(1H, d,J= 2.2 Hz, H-7), 7.94 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-4),7.95 (1H, s, H-2)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:165.7 (C-8), 158.5 (C-6), 139.0 (C-7a), 133.2 (C-2),122.6 (C-4), 121.5 (C-3a), 112.8 (C-5), 107.6 (C-3),96.0 (C-7), 95.3 (C-1′), 78.8 (C-5′), 78.3 (C-3′), 74.2(C-2′), 71.2 (C-4′), 62.4 (C-6′), 55.9 (-OCH3)。以上波譜數據與文獻數據基本一致[18]，鑒定化合物6 為6-methoxyindole-3-carboxylic acidO-β-D-glucopyranosyl ester。

化合物7：淡黃色油狀物；分子式C16H18N2O6；ESI-MSm/z333 [M－H]-；1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 3.53～3.42 (3H, m, H-2′～4′), 3.60 (1H,dd,J= 8.7, 7.7 Hz, H-5′), 3.72 (1H, dd,J= 12.0, 4.8 Hz, H-6′b), 3.90 (1H, dd,J= 12.1, 1.9 Hz, H-6′a),4.19 (2H, d,J= 3.0 Hz, H-8), 5.09 (1H, d,J= 7.8 Hz,H-1′), 6.80～6.75 (1H, m, H-7), 7.05 (2H, m, H-6, 8),7.13 (1H, s, H-2)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:153.1 (C-4), 140.0 (C-7a), 124.0 (C-2), 123.6 (C-6),121.3 (C-3a), 118.4 (C-9), 107.4 (C-7), 105.3 (C-5),104.8 (C-3), 102.5 (C-1′), 78.4 (C-5′), 78.2 (C-3′),75.2 (C-2′), 71.4 (C-4′), 62.5 (C-6′), 16.2 (C-8)。以上波譜數據與文獻數據基本一致[19]，鑒定化合物7 為cappariloside A。

化合物8：淡黃色粉末；分子式C34H42O19；ESI-MSm/z753 [M－H]-；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.61 (1H, d,J= 15.8 Hz, H-3"), 7.55(1H, d,J= 15.8 Hz, H-3"′), 7.02 (2H, s, H-5", 9"),7.01 (2H, s, H-5"′, 9"′), 6.54 (1H, m, H-2"), 6.50 (1H,d,J= 15.9 Hz, H-2"′), 5.60 (1H, d,J= 6.4 Hz, H-1),5.37～5.44 (2H, m, H-3′, 4′), 5.30 (1H, d,J= 3.6 Hz,4-OH), 5.25 (1H, d,J= 5.8 Hz, 2-OH), 4.98 (1H, d,J= 5.0 Hz, 3-OH), 4.90 (1H, t,J= 6.3 Hz, 1′-OH),4.69 (1H, t,J= 5.7 Hz, 6′-OH), 4.46 (1H, d,J= 10.8 Hz, 4′-OH), 4.01～4.31 (4H, m, H-6, 1′a, 5′), 3.80(6H, s, 6", 8"-OCH3), 3.78 (6H, s, 6"′, 8"′-OCH3),3.57～3.74 (2H, m, H-6′a, 1′b), 3.48 (1H, dt,J= 9.1,4.5 Hz, H-6′b), 3.26 ～3.42 (3H, m, H-2～4)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 166.7 (C-1"′),165.5 (C-1"), 148.0 (C-6", 8"), 148.0 (C-6"′, 8"′),145.8 (C-3"), 145.4 (C-3"′), 138.3 (C-7"), 138.3(C-7"′), 124.4 (C-4"), 124.3 (C-4"′), 114.7 (C-2", 2"′),106.1 (C-5", 9"), 106.1 (C-5"′, 9"′), 103.1 (C-1), 90.9(C-2′), 82.9 (C-5′), 77.1 (C-5), 73.1 (C-3′), 72.5 (C-3),71.4 (C-4′), 70.6 (C-2), 70.1 (C-4), 64.3 (C-1′), 63.6(C-6), 62.2 (C-6′), 56.1 (6", 8"-OCH3), 56.0 (6"′,8"′-OCH3)。以上波譜數據與文獻數據基本一致[19]，鑒定化合物8 為3′,6-二芥子?；崽?。

化合物9：無色油狀物；分子式C13H20O3；ESI-MSm/z247 [M＋Na]+；1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 5.88 (1H, t,J= 1.4 Hz, H-2), 5.80 (2H, m,H-7, 8), 4.32 (1H, qd,J= 6.3, 3.9 Hz, H-9), 2.62～2.11 (2H, m, H-6), 1.92 (3H, dd,J= 3.7, 1.4 Hz,H-11), 1.24 (3H, d,J= 6.4 Hz, H-10), 1.07～0.99(6H, m, H-12, 13)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:201.3 (C-1), 167.5 (C-3), 136.9 (C-7), 130.1 (C-8),127.1 (C-2), 79.9 (C-4), 68.7 (C-9), 50.7 (C-6), 42.4(C-5), 24.5 (C-12), 23.8 (C-13), 23.5 (C-10), 19.6(C-11)。以上波譜數據與文獻數據基本一致[20]，鑒定化合物9 為吐葉醇。

化合物10：褐色粉末；分子式C7H6O3；ESI-MSm/z137 [M－H]-；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:9.69 (1H, s, H-1), 7.31 (1H, m, H-3, 6), 6.91 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-7)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:193.1 (C-1), 153.8 (C-5), 147.2 (C-4), 130.8 (C-2),126.4 (C-7), 116.2 (C-6), 115.3 (C-3)。以上波譜數據與文獻數據基本一致[21]，鑒定化合物10 為3,4-二羥基苯甲醛。

化合物11：褐色粉末；分子式C7H6O4；ESI-MSm/z153 [M－H]-；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:7.45 (2H, m, H-3, 7), 6.82 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 170.3 (C-1), 151.5(C-5), 146.0 (C-4), 123.9 (C-7), 123.1 (C-2), 117.7(C-3), 115.7 (C-6)。以上波譜數據與文獻數據基本一致[22]，鑒定化合物11 為3,4-二羥基苯甲酸。

化合物12：無色油狀物；分子式C6H6O3；ESI-MSm/z149 [M＋Na]+；1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 9.53 (1H, s, H-1), 7.39 (1H, d,J= 3.6 Hz,H-3), 6.59 (1H, d,J= 3.6 Hz, H-4)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 179.5 (C-1), 163.2 (C-5), 153.8(C-2), 125.0 (C-3), 110.9 (C-4), 57.6 (C-6)。以上波譜數據與文獻數據基本一致[16]，鑒定化合物12 為5-羥甲基糠醛。

化合物13：無色油狀物；分子式C10H12O4；1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.41 (1H, d,J= 15.7 Hz, H-3), 6.70 (1H, d,J= 3.3 Hz, H-5), 6.42 (1H, d,J= 3.3 Hz, H-6), 6.26 (1H, d,J= 15.7 Hz, H-2), 4.57(2H, s, H-8), 4.21 (2H, q,J= 7.1 Hz, H-9), 1.30 (3H,t,J= 7.2 Hz, H-10)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:168.7 (C-1), 159.1 (C-7), 151.8 (C-4), 132.5 (C-3),117.4 (C-5), 115.9 (C-2), 111.0 (C-6), 61.6 (C-9),57.5 (C-8), 14.6 (C-10)。以上波譜數據與文獻數據基本一致[23]，鑒定化合物13 為2-羥甲基-5-呋喃丙烯酸乙酯。

化合物14：白色粉末；分子式C29H50O；ESI-MSm/z415 [M＋H]+；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ:5.36 (1H, d,J= 5.1 Hz, H-6), 3.53 (1H, ddd,J= 15.4,10.7, 4.4 Hz, H-3), 2.37～2.17 (2H, m, H-4)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 141.0 (C-5), 121.9(C-6), 72.0 (C-3), 57.0 (C-14), 56.3 (C-17), 50.3(C-9), 46.0 (C-21), 42.5 (C-13), 42.5 (C-4), 40.0(C-12), 37.5 (C-10), 36.7 (C-1), 36.4 (C-18), 34.15(C-2), 32.1 (C-7), 31.9 (C-8), 29.4 (C-2), 28.5 (C-22),26.3 (C-15), 24.5 (C-27), 23.3 (C-11), 21.3 (C-29),20.0 (C-23), 19.6 (C-26), 19.2 (C-24), 12.2 (C-28),12.1 (C-25)。以上波譜數據與文獻數據基本一致[16]，鑒定化合物14 為β-谷甾醇。

4 體外調脂活性篩選

4.1 化合物對3T3-L1 前脂肪細胞存活率的影響

采用CCK-8 法[24]，測試化合物1 和2 對3T3-L1前脂肪細胞存活率的影響。3T3-L1 前脂肪細胞使用DMEM 高糖培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清、1%的雙抗）于37 ℃和5% CO2的條件下培養(yǎng)。待細胞長至密度70%～80%，用胰蛋白酶將3T3-L1 前脂肪細胞消化后，用DMEM 高糖培養(yǎng)液將其制成4×104個/mL的細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)12 h；設對照組、給藥組。吸棄原培養(yǎng)基，對照組加入含0.1% DMSO 的DMEM高糖培養(yǎng)基100 μL，給藥組分別給予含10 μmol/L化合物的DMEM 高糖培養(yǎng)基100 μL，在原相同環(huán)境條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h；吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 含有10% CCK-8 試劑的培養(yǎng)基溶液后，放入培養(yǎng)箱0.5 h 后取出，用酶標儀在450 nm 波長下測定吸光度（A），并計算細胞存活率。

結果表明，化合物1 和2 在10 μmol/L 濃度下對3T3-L 前脂肪細胞48h 內存活率均大于90%，因此選取5、10 μmol/L 的濃度用于后續(xù)活性研究，結果見表2。

表2 化合物1 和2 對3T3-L1 前脂肪細胞存活率的影響(x ±s , n=3)Table 2 Effects of compounds 1 and 2 on survival rate of 3T3-L1 preadipocytes (x ±s , n=3)

4.2 3T3-L1 前脂肪細胞胰島素抵抗模型的建立

根據文獻報道的方法[25]，通過3T3-L1 前脂肪細胞胰島素抵抗模型，測試化合物對該細胞胰島素抵抗的影響，從而評價化合物的調脂活性。3T3-L1前脂肪細胞2×104個/孔接種于24 孔板，分為對照組、模型組、陽性對照組、給藥組。待細胞在完全培養(yǎng)基中生長至融合度 100%后，更換新鮮的DMEM 高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；對照組更換2 mL 新鮮的DMEM 高糖培養(yǎng)基，模型組加入2 mL誘導分化培養(yǎng)基I（DMEM 高糖培養(yǎng)基中含牛胰島素 10 μg/mL、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤 0.5 mmol/L、地塞米松0.25 μmol/L、羅格列酮1 μmol/L），陽性藥組加入2 mL 含5 mol/L 陽性藥物洛伐他汀的誘導分化培養(yǎng)基I，給藥組分別加入2 mL 含5、10 μmol/L化合物的誘導分化培養(yǎng)基I，培養(yǎng)48 h；對照組繼續(xù)更換2 mL 新鮮的DMEM 高糖培養(yǎng)基，模型組換成2 mL 誘導分化培養(yǎng)基II（DMEM 高糖培養(yǎng)基中含牛胰島素10 μg/mL），陽性對照組加入2 mL 含5 μmol/L 陽性藥物洛伐他汀的誘導分化培養(yǎng)基II，給藥組分別加入2 mL 含5、10 μmol/L 化合物的誘導分化培養(yǎng)基II，培養(yǎng)48 h；各組換為2 mL DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。在3T3-L1 細胞誘導分化第7 天，棄去原培養(yǎng)基，每孔加入200 μL PBS 洗去殘余培養(yǎng)基后，棄去PBS。根據文獻報道的方法[26]，使用DMEM 高糖培養(yǎng)基配制含1 μg/mL 尼羅紅染液，每孔加入尼羅紅染液200 μL，避光染色10 min后，棄去尼羅紅染液。每孔用PBS 洗滌細胞1 遍后，再加200 μL PBS。用酶標儀在激發(fā)波長485 nm 和發(fā)射波長572 nm 下檢測各組A值，并根據公式計算各組細胞中相對脂肪含量。用熒光顯微鏡觀察并拍照。

與對照組相比，模型組細胞中的相對脂肪含量明顯增加（P＜0.001）。與模型組相比，化合物1 在5、10 μmol/L 濃度下對3T3-L1 細胞中脂肪的生成均有顯著的抑制作用（P＜0.01、0.001），而化合物2 在10 μmol/L 濃度下顯示一定的抑制脂肪生成的作用（P＜0.05），結果見表3。此外，從圖4 可以看出，采用尼羅紅處理后，經誘導分化后的各組細胞內積累的大量脂滴被染成紅色。將各給藥預處理組細胞的尼羅紅染色程度與模型組細胞比較，發(fā)現陽性藥洛伐他汀、化合物1 和2 的細胞內脂滴均有不同程度地減少。綜上所述，化合物1 和2 均具有潛在的調脂活性。

表3 化合物1 和2 對3T3-L1 前脂肪細胞內相對脂肪含量的影響 (±s , n=3)Table 3 Effects of compounds 1 and 2 on relative fat content in 3T3-L1 preadipocytes (± s , n=3)

表3 化合物1 和2 對3T3-L1 前脂肪細胞內相對脂肪含量的影響 (±s , n=3)Table 3 Effects of compounds 1 and 2 on relative fat content in 3T3-L1 preadipocytes (± s , n=3)

與對照組比較：###P＜0.001；與模型組比較：***P＜0.001 **P＜0.01 *P＜0.05###P ＜ 0.001 vs control group; ***P ＜ 0.001 ** P ＜ 0.01 *P ＜ 0.05 vs model group

組別 給藥濃度/(μmol·L-1) 相對脂肪含量對照0.70±0.02 1.00±0.03###陽性對照 5 0.77±0.00***1 5 0.86±0.01**10 0.79±0.01***模型2 5 0.94±0.05 10 0.95±0.01*

圖4 化合物1 和2 對3T3-L1 細胞胰島素抵抗模型中細胞形態(tài)和脂質積累的影響Fig. 4 Effects of compounds 1 and 2 on cell morphology and lipid accumulation in insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes

5 討論

從萊菔子70%乙醇提取物中分離得到14 個化合物，包括2 個新的含硫衍生物，5 個首次從萊菔子中分離得到的化合物。對這2 個新化合物進行了體外調脂活性篩選。結果表明，化合物1 和2 均具有潛在的調脂活性，其中化合物1 較2 在5、10 μmol/L 下顯示出更好的調脂活性。本研究豐富了萊菔子的化學成分，并用胰島素抵抗模型評價了化合物1 和2 的體外調脂活性，為萊菔子進一步的開發(fā)和利用提供了參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突