黃海楓，夏 鑫*，范奕輝

（1.河北省海洋與水產(chǎn)科學(xué)研究院（河北省海洋漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站），河北秦皇島 066000；2.河北省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室，河北秦皇島 066000；3.國立釜慶大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)學(xué)院食品工學(xué)部，釜山 612022）

目前，國際上魚油的研究在其來源和活性分子、工作原理、分子靶標(biāo)等19個大項中開展，在多領(lǐng)域結(jié)出豐碩成果。BHATT等[1]在頂級醫(yī)學(xué)期刊《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》中指出，正常健康人群服用魚油制劑有利于預(yù)防心血管疾病和糖尿病。河鲀肝油基本性狀與海產(chǎn)天然魚肝油相似，肝油中含有多種維生素、脂肪酸和微量的河鲀毒素（Tetrodotoxin，TTX），除毒去脂的河鲀肝油被證明在緩解癌痛、抑瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面藥理作用突出，且無毒性及成癮性反應(yīng)[2]。多年來，國內(nèi)外的研究大部分專注于TTX，對肝油中其他營養(yǎng)成分研究較少。其實河鲀肝油中不但富含多種脂肪酸，也含有維生素A、維生素D等保健性生物成分。在國際國內(nèi)雙循環(huán)格局下，食品營養(yǎng)與健康產(chǎn)業(yè)正在從較低層次朝高附加值、高技術(shù)水平、高加工深度、高規(guī)模經(jīng)濟(jì)方向演變。高端食品、保健食品、功能食品發(fā)展加速，開展富含營養(yǎng)功能因子食品的新型工藝和質(zhì)量控制技術(shù)的研究及集成，研究開發(fā)產(chǎn)品質(zhì)量可控、環(huán)境友好的清潔生產(chǎn)工藝是科技發(fā)展的必然趨勢[3]。因此，如果能夠通過新型制備技術(shù)提取肝油并高值化利用開發(fā)，變廢為寶，既能提升資源生物利用率，提高產(chǎn)業(yè)附加值，又可減少廢棄油脂對環(huán)境的污染，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益與生態(tài)效益。而河鲀肝油中的維生素A隨季節(jié)和生殖情況是有顯著變化的，如蟲紋東方鲀產(chǎn)卵前每克肝中含維生素A高達(dá)4 100國際單位（International Units，IU），產(chǎn)卵后降為960 IU[4]。因此，建立快速可靠、簡便易行的魚肝油質(zhì)量檢測方法，對有效評價河鲀魚肝油品質(zhì)優(yōu)劣、幫助人們合理使用魚油具有現(xiàn)實參考意義。本實驗通過亞臨界萃取設(shè)備提取河鲀肝油，并采用高效液相色譜法對河鲀肝油中維生素A1和維生素D3成分進(jìn)行檢測研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

河鲀肝臟（唐山海都）；視黃醇（純度≥95%，阿拉丁）；膽鈣化醇（純度≥99%，麥克林）；甲醇（迪馬科技）；無水乙醇、石油醚、乙醚、正己烷、抗壞血酸溶液、氫氧化鉀和無水硫酸鈉（均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑）。

萃取設(shè)備（河南省亞臨界生物技術(shù)有限公司CBE-5L型）；Agilent1200高效液相色譜儀；HH-S型恒溫水浴振蕩器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（力辰科技RE-2000A型）；KQ-400E超聲儀；Milli-Q純水處理器；JA1003型電子分析天平；H/T12MM型高速離心機(jī)。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚肝油制備方法

選取處理好的河鲀肝臟1 kg，放入萃取罐啟用真空萃取程序，以丁烷為萃取溶劑，30 ℃萃取30～40 min，重復(fù)3～4次，結(jié)束脫溶后回收殘液增加提取率。用布氏漏斗重復(fù)抽濾去脂，澄清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，100 ℃旋蒸至無水分餾出，得到純凈澄清河鲀肝油樣品備用。

1.2.2 樣品處理

（1）維生素A的提取。準(zhǔn)確稱取5 g魚肝油樣品，加入20 mL無水乙醇溶解稀釋搖勻。加入5 mL 10%抗壞血酸和10 mL氫氧化鉀溶液，于沸水浴回流30 min。將皂化液并入分液漏斗，用蒸餾水沖洗回流系統(tǒng)，沖洗液并入分液漏斗中，用50 mL石油醚萃取，合并醚層用蒸餾水洗至中性液，經(jīng)無水硫酸鈉濃縮至干，加入甲醇溶解并定容至10 mL，用0.22 μm濾膜過濾后上機(jī)分析。當(dāng)樣品中同時存在幾種維生素A形式時，可通過堿水解的方式將其變成單一的視黃醇，以便于測定[5]。

（2）維生素D的提取。準(zhǔn)確稱取5 g魚肝油樣品，加入50 mL正己烷渦旋混勻，放入高速冷凍離心機(jī)，4 ℃下以7 500 r·min-1離心5 min得到上清液。取5 mL上清液，使用0.22 μm濾膜過濾后待分析[6]。

1.2.3 確立色譜條件

（1）維生素A檢測條件的確立。色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；梯度洗脫：0～13 min，甲醇96%，13～20 min，甲醇96%→100%，20～24min，甲醇100%，24～24.5 min，甲醇100%→96%，24.5～30 min，甲醇96%；流速：0.8 mL·min-1；波長：325 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

（2）維生素D檢測條件的確立。色譜柱：Waters Symmetry R-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；等度洗脫：0～30 min，甲醇96%；流速：1.0 mL·min-1；波長264 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.4 色譜分析方法

本實驗采用外標(biāo)法定量，配制不同濃度的維生素A、維生素D標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，分別注入高效液相色譜儀中，測定響應(yīng)的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定樣品中維生素A、維生素D的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

對肝油分離效果產(chǎn)生影響的主要因素包括色譜柱類型、柱容量、流動相流速、流動相組成和比例。本實驗主要考察了色譜柱類型、流動相比例、流動相流速對肝油分離效果的影響。

2.1.1 維生素A檢測條件的優(yōu)化

（1）色譜柱的篩選。不同的色譜柱分離效果不同，本實驗中使用兩種常用色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18、Waters Symmetry R-C18對樣品中維生素A、維生素D進(jìn)行分離，并比較分離效果。將4 μg·mL-1維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜儀，對比兩柱的分析效果（圖1）。兩柱都在10 min內(nèi)出峰完全。使用Agilent柱時，維生素A的保留時間為7.152 min，峰面積為783.2，對稱因子為1.048，峰形較好；使用Waters柱時，維生素A的保留時間為8.591 min，峰面積為175.4，對稱因子為1.001，但出現(xiàn)了雙峰連在一起的情況。經(jīng)對比，選擇Agilent柱對維生素A進(jìn)行檢測。

圖1 使用不同色譜柱檢測維生素A效果

（2）流動相比例的優(yōu)化。使用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，調(diào)節(jié)流動相中甲醇與水比例為95∶5、96∶4、98∶2，比較不同流動相條件下維生素A的分離效果（圖2）。當(dāng)甲醇∶水=95∶5時，圖中出現(xiàn)雙峰，基線較不平穩(wěn)；當(dāng)甲醇∶水=96∶4時，峰形最佳，出峰時間比較合適。當(dāng)甲醇∶水=98∶2時，維生素A出峰時間過早且基線不平穩(wěn)。經(jīng)對比選擇甲醇∶水=96∶4為流動相進(jìn)行維生素A的檢測。

圖2 使用不同流動相比例檢測維生素A效果

（3）流速的優(yōu)化。流速是影響目標(biāo)物峰形的重要因素之一，流速增大目標(biāo)物的出峰時間會隨之提前，峰形變得尖銳，如流速過大，易造成柱壓過高，影響峰形美觀，也會縮短色譜柱的使用壽命[7]。將1 μg·mL-1的維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜，調(diào)整流速為0.5 mL·min-1、0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1進(jìn)行分析（圖3）。

圖3 使用不同流速檢測維生素A效果

當(dāng)流速為0.5 mL·min-1時，維生素A出現(xiàn)雙峰難以分離的情況；流速為0.8 mL·min-1時，出峰時間合適，基線較平，峰形較好；流速為1 mL·min-1時，出峰時間較早，且基線不平穩(wěn)；流速為1.5 mL·min-1時，出峰時間過早，基線不平且柱壓過大。經(jīng)對比選用0.8 mL·min-1的流速進(jìn)行維生素A的檢測。

2.1.2 維生素D檢測條件的優(yōu)化

（1）色譜柱的篩選。將200 μg·mL-1的維生素D標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜，使用兩個品牌的色譜柱進(jìn)行分離效果比較（圖4）。結(jié)果表明，兩柱檢測維生素D均可在30 min內(nèi)出峰完全。使用Agilent柱時，維生素D的保留時間為19.555 min，峰面積為9 596.4，對稱因子為0.415，峰形外觀較差；使用Waters柱時，維生素D的保留時間為20.210 min，峰面積為6 490.6，對稱因子為1.097，峰形外觀較規(guī)整，出峰時間合適，響應(yīng)更高。經(jīng)對比選擇Waters色譜柱進(jìn)行維生素D的檢測。

圖4 使用不同色譜柱檢測維生素D效果

（2）流動相比例的優(yōu)化。以Waters Symmetry R-C18色譜柱作分析柱，設(shè)流動相甲醇∶水為95∶5、96∶4、98∶2，測定維生素D（圖5）。

圖5 使用不同流動相比例檢測維生素D效果

當(dāng)流動相為甲醇∶水=95∶5時，峰形較好，但出峰時間較晚；當(dāng)流動相為甲醇∶水=96∶4時，出峰時間比較合適，峰形較好，且相鄰峰之間影響較小。當(dāng)流動相比例為甲醇∶水=98∶2時，峰形較差，有雙峰相連現(xiàn)象。經(jīng)對比選擇甲醇∶水=96∶4為流動相進(jìn)行維生素D的檢測。

（3）流速的優(yōu)化。將200 μg·mL-1的維生素D標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜，調(diào)整流速為0.5 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1進(jìn)行色譜分析（圖6）。當(dāng)流速為0.5 mL·min-1時，出峰很小且峰形難看；流速為1.0 mL·min-1時，峰形好看，分離情況良好；流速為1.5 mL·min-1時，峰形較好但雜質(zhì)峰很大并顯示柱壓過高。經(jīng)對比選擇1.0 mL·min-1的流速進(jìn)行維生素D檢測。

圖6 使用不同流速檢測維生素D效果

2.2 檢測結(jié)果

2.2.1 維生素A檢測結(jié)果

選Agilent Eclipse XDB-C18柱為分析柱，流動相為甲醇∶水（96∶4），流速為0.8 mL·min-1，建立維生素A標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線，線性回歸方程為y=103.478 87x-3.567 22。結(jié)果顯示維生素A在0.2～6.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 5。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線，以同一份樣品同天內(nèi)檢測5次，檢測結(jié)果為0.74 mg/100 g、0.75 mg/100 g、0.76 mg/100 g、0.74 mg/100 g和0.76 mg/100 g，維生素A的平均含量為0.75 mg/100 g，日內(nèi)精密度（RSD）為1.3%。

2.2.2 維生素D檢測結(jié)果

選Waters Symmetry R-C18柱分析，流動相甲醇∶水（96∶4），流速1.0 mL·min-1，建立維生素D標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線，線性回歸方程為y=111.998 66x-63.620 36，結(jié)果顯示維生素D在1～200 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.998 5。據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線，以同一份樣品同天內(nèi)檢測5次，結(jié)果為0.70 mg/100 g、0.68 mg/100 g、0.69 mg/100 g、0.70 mg/100 g和0.68 mg/100 g，維生素D的平均含量為0.69 mg/100 g，日內(nèi)精密度（RSD）為1%。

3 結(jié)論

本實驗通過亞臨界萃取法制備河鲀肝油，利用HPLC法檢測魚肝油樣品中維生素A及維生素D的含量。通過對不同色譜柱、流動相比例、流速大小的分析篩選，優(yōu)化得到最佳色譜條件，測得樣品中維生素A平均含量為0.75 mg/100 g，維生素D平均含量為0.69 mg/100 g。本方法綠色環(huán)保，簡便易行，能滿足對魚肝油中維生素A及維生素D含量檢測的要求，并可為進(jìn)一步研究此類功能性油脂提供參考。