徐同迎 焦倩 姜宏

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山東省神經(jīng)相關(guān)疾病的機(jī)制與重點防治實驗室,山東省沿海地區(qū)神經(jīng)退變疾病協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 青島 266071)

神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)存在于哺乳動物胚胎的腦組織以及成年人側(cè)腦室室管膜下區(qū)和海馬齒狀回顆粒下層中,具有自我增殖和分化的潛能［1-3］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷以后,靜止的NSCs被激活并參與到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)過程中［4］。去泛素化酶(DUBs)可以逆轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)泛素化降解過程,進(jìn)而影響多種生物學(xué)過程,包括細(xì)胞凋亡和自噬、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和干細(xì)胞的發(fā)育等［5-8］。卵巢腫瘤結(jié)構(gòu)域蛋白(OTUs)是DUBs家族成員,具有內(nèi)源性連鎖特異性［9-10］。OTUD3是OTUs亞家族中的一員,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和神經(jīng)退行性疾病關(guān)系密切,其底物包括PTEN、GRP78、p53和IRP2蛋白［8,11-14］?？p隙連接蛋白(Cx)通道是機(jī)體大多數(shù)組織中相鄰細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外區(qū)域進(jìn)行物質(zhì)交換和信號交流主要通道［15-16］。其中Cx43是Cx中分布最廣泛家族成員［17］,與基因轉(zhuǎn)錄、發(fā)育、自噬調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)運輸和細(xì)胞外小泡介導(dǎo)遠(yuǎn)程通訊有關(guān)［18-20］。OTUD3是否調(diào)節(jié)Cx43而參與NSCs增殖分化等生物學(xué)行為,目前尚未見相關(guān)報道。本研究利用OTUD3敲除(OTUD3-/-)的胚胎小鼠,于體外分離并且培養(yǎng)OTUD3-/-和野生型(WT)胚胎小鼠NSCs,檢測OTUD3對NSCs中Cx43表達(dá)影響,同時提取胚胎小鼠腦皮質(zhì)蛋白,驗證OTUD3對Cx43表達(dá)影響。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑

表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、N-2 supplement、B-27 supplement購自美國Gibco公司;GAPDH抗體和Cx43抗體購自美國CST公司;OTUD3抗體購自美國Abcam公司;Ki67抗體、Nestin抗體、β-tubulin Ⅲ抗體購自美國Millipore公司;羊抗兔IgG-HRP購自中國愛博泰克生物公司;ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司。

1.2 實驗動物及其飼養(yǎng)

3月齡OTUD3-/-小鼠(中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)和3月齡WT小鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供)置于恒溫(21±2)℃、恒濕(50±10)%、12-12 h晝夜交替光照下飼養(yǎng),自由飲水與取食。同種基因型小鼠之間進(jìn)行交配,待妊娠第14天時,異氟烷氣體麻醉孕鼠,以體積分?jǐn)?shù)0.75的乙醇消毒腹部后,沿腹中線剪開,使用鑷子取出串珠樣OTUD3-/-小鼠和WT胚胎小鼠各3只,置于預(yù)冷的PBS中,用于后續(xù)實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1胚胎小鼠腦皮質(zhì)組織的提取 剝離出所有OTUD3-/-和WT胚胎小鼠的全部腦組織,剔除腦膜后分離腦皮質(zhì)組織。取出每只胚胎小鼠的一部分腦皮質(zhì)組織置入1.5 mL EP管內(nèi),加入配置好的蛋白裂解液,組織研磨儀研磨1 min,冰上裂解30 min后,4 ℃下12 000 r/min離心20 min,提取腦皮質(zhì)組織蛋白用于后續(xù)實驗。

1.3.2NSCs的分離和傳代 將OTUD3-/-和WT胚胎小鼠剩余部分腦皮質(zhì)組織,剪碎至1 mm×1 mm×1 mm,使用1 mL槍頭反復(fù)吹打組織直至形成細(xì)胞懸液,400目篩網(wǎng)過濾后置于大離心管中,以1 000 r/min離心5 min,棄去上清液;加入完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,細(xì)胞計數(shù)后將其接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中,接種密度約為1×108個/L,并分別標(biāo)記為OTUD3-/--NSCs和WT-NSCs,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng);隔天添加完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)4～6 d時,根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)(細(xì)胞生長所形成神經(jīng)球聚集增多時)傳代,傳至第3代時,于倒置顯微鏡下觀察第1、3天時OTUD3-/--NSCs和WT-NSCs的生長狀態(tài)。

1.3.3NSCs的培養(yǎng) 將高壓滅菌后的玻片置于24孔板中,加入多聚賴氨酸溶液室溫下孵育5 min,0.01 mol/L PBS洗2次后,超凈臺晾干;將傳代至第3代的神經(jīng)球消化為單細(xì)胞后,調(diào)整細(xì)胞密度為1×109個/L,接種細(xì)胞懸液至上面制備好的玻片上,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取OTUD3-/--NSCs和WT-NSCs各3個玻片,使用完全培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)3 d以后,用于檢測Ki67;取OTUD3-/--NSCs和WT-NSCs各6個玻片,使用分化培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)7 d以后,用于檢測Nestin和β-tubulin Ⅲ。

1.3.4細(xì)胞免疫熒光染色 將前面培養(yǎng)3 d或7 d的OTUD3-/--NSCs和WT-NSCs玻片從24孔板取出,吸棄培養(yǎng)基,用4 ℃預(yù)冷的4% PFA溶液室溫固定30 min,0.01 mol/L的PBS清洗3次,每次5 min,加入封閉液,室溫下封閉1 h;向使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d的NSCs中加入Ki67一抗(1∶400),向使用分化培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d的NSCs中加入Nestin一抗(1∶100)和β-tubulin Ⅲ一抗(1∶500),室溫孵育1 h后,4 ℃搖床孵育過夜,0.01 mol/L PBS洗3次,每次5 min;加入AF555或AF488標(biāo)記的熒光二抗(1∶500),室溫避光孵育1 h;將含DAPI封片液滴于載玻片上,將生長細(xì)胞的玻片面緩慢接觸封片液,避光保存,倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5Western blotting方法檢測腦皮質(zhì)和NSCs中OTUD3和Cx43表達(dá)水平 NSCs培養(yǎng)至第3代時,傳代后接種于6孔板(2 mL/孔)中,每組設(shè)置3個復(fù)孔,調(diào)整密度為1×108個細(xì)胞/L;繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約90%時,加入已配置好的蛋白裂解液,組織研磨儀研磨1 min,冰上裂解30 min后,4 ℃下12 000 r/min離心20 min,提取NSCs蛋白用于后續(xù)實驗。配制聚丙酰胺凝膠,向凝膠孔加入1.3.1中制備好的腦皮質(zhì)組織蛋白樣品或NSCs蛋白樣品,電壓調(diào)至80 V進(jìn)行SDS蛋白電泳,待樣品進(jìn)入分離膠后,將電壓調(diào)為120 V,PVDF轉(zhuǎn)膜,使用100 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h以后,分別加入OTUD3一抗(1∶1 000)和Cx43一抗(1∶1 000),4 ℃搖床孵育過夜,次日使用TBST洗條帶3次,每次10 min;根據(jù)一抗種屬加入HRP偶聯(lián)的山羊抗兔二抗(1∶10 000),于室溫下孵育1 h后,TBST漂洗3次,每次洗10 min,ECL化學(xué)發(fā)光液避光孵育1 min顯影。使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH條帶結(jié)果作為內(nèi)參照,計算目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 WT和OTUD3-/-胚胎小鼠NSCs的鑒定

倒置顯微鏡下觀察顯示,第3代OTUD3-/--NSCs和WT-NSCs培養(yǎng)1 d時均形成由多細(xì)胞組成的神經(jīng)球,培養(yǎng)3 d時增殖形成的神經(jīng)球均增多(圖1)。細(xì)胞免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示,使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d時的WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs當(dāng)中Ki67均染色陽性(圖2A),圖中綠色為Ki67;使用分化培養(yǎng)基培養(yǎng)至第7天WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs中Nestin和β-tubulin Ⅲ均染色陽性(圖2B),其中綠色為Nestin,紅色為β-tubulin Ⅲ。通過以上結(jié)果可以鑒定本研究中原代提取培養(yǎng)的細(xì)胞為NSCs,具有增殖和分化能力。

圖1 第3代WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs培養(yǎng)第1、3天時神經(jīng)球生長狀況(4倍)

A：第3代WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs培養(yǎng)第3天時Ki67染色呈陽性(細(xì)胞免疫熒光染色,10倍),B：第3代WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs培養(yǎng)第7天時Nestin和β-Tubulin Ⅲ染色陽性(細(xì)胞免疫熒光染色,40倍)

2.2 WT和OTUD3-/-胚胎小鼠NSCs和腦皮質(zhì)組織中OTUD3、Cx43的表達(dá)情況

Western blotting法檢測結(jié)果示,WT-NSCs當(dāng)中OTUD3、Cx43條帶灰度值分別為1.023±0.062、1.035±0.093;OTUD3-/--NSCs中無OTUD3蛋白表達(dá),Cx43條帶的灰度值為0.592±0.102。WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs的上述兩種蛋白比較,差異均有顯著意義(t=16.82、3.21,P<0.05),見圖3A。WT胚胎小鼠腦皮質(zhì)組織中OTUD3、Cx43條帶的灰度值分別為0.929±0.060、0.905±0.0149;OTUD3-/-胚胎小鼠腦皮質(zhì)組織中無OTUD3蛋白表達(dá),Cx43條帶灰度值為0.522±0.012,WT胚胎小鼠和OTUD3-/-胚胎小鼠腦皮質(zhì)組織上述兩種蛋白比較,差異均具有顯著意義(t=10.04、20.41,P<0.05),見圖3B。

A：WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs中OTUD3、Cx43表達(dá),B：WT和OTUD3-/-胚胎小鼠腦皮質(zhì)中OTUD3、Cx43表達(dá)

3 討 論

NSCs是一類具有自我增殖和分化潛能的細(xì)胞,在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和修復(fù)受損神經(jīng)組織中發(fā)揮重要作用,具有修復(fù)和代替受損腦組織的功能,并可以重建部分神經(jīng)功能環(huán)路［3,21-22］。近年研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展與縫隙連接密切相關(guān),縫隙連接在細(xì)胞間信息傳遞、物質(zhì)交換和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面都發(fā)揮重要作用［23］。Cx43在神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞與少突膠質(zhì)細(xì)胞間可以傳遞死亡信號以及鈣超載等危險信號［24］。也有研究表明Cx43可以通過氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞損傷,抑制Cx43后可以促進(jìn)細(xì)胞生長并提升細(xì)胞對于應(yīng)激情況的抵抗能力［25］,但目前具體機(jī)制尚不清楚。NSCs存在于哺乳動物胚胎期的大腦,胚胎小鼠大腦皮質(zhì)中有大量的NSCs,Cx43在胚胎發(fā)育期的腦組織中廣泛表達(dá),本研究選擇胚胎期第14天小鼠的腦皮質(zhì)區(qū),體外培養(yǎng)NSCs,探討Cx43調(diào)控NSCs生物行為學(xué)的具體機(jī)制。

泛素化信號通路在神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)元生理功能中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,而DUBs作為調(diào)節(jié)蛋白泛素化的中心分子,其對神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控受到越來越多的關(guān)注。OTUD3屬于DUBs家族,是OTUs亞家族中的一員［11］,其功能具有組織特異性和時間特異性,可通過調(diào)控不同靶蛋白的穩(wěn)定性,調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖［26］。OTUD3可以穩(wěn)定PTEN蛋白表達(dá)水平,PTEN的缺乏可以調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因cyclinB2和cyclinD1,進(jìn)而縮短細(xì)胞周期,影響NSCs增殖分化［11］。本研究中使用異氟烷氣體麻醉孕鼠以后取出串珠樣胚胎小鼠,分離提取胚胎WT和OTUD3-/-小鼠NSCs,分別標(biāo)記為WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs,在完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)良好。Ki67是一種表達(dá)于細(xì)胞周期G1、S、G2和M期的核抗原,其表達(dá)水平能夠客觀地反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)。本研究應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光染色對第3代培養(yǎng)了3 d的WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs進(jìn)行Ki67檢測,結(jié)果為陽性;應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光染色對第3代培養(yǎng)了7 d的WT-NSCs和OTUD3-/--NSCs進(jìn)行Nestin和β-tubulin Ⅲ檢測,結(jié)果為陽性,提示本研究中原代提取培養(yǎng)的細(xì)胞為NSCs,并有增殖和分化能力。

接下來,本研究應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測敲除OTUD3后胚胎小鼠NSCs和腦皮質(zhì)組織中OTUD3蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,與WT-NSCs相比,OTUD3-/--NSCs無OTUD3蛋白的表達(dá);與WT胚胎小鼠腦皮質(zhì)組織相比,OTUD3-/-胚胎小鼠腦皮質(zhì)組織也無OTUD3蛋白的表達(dá),提示胚胎小鼠NSCs中和腦皮質(zhì)組織中OTUD3敲除成功。

Cx43參與細(xì)胞增殖過程,通過控制cyclinD1-CDK4-p27復(fù)合體的核轉(zhuǎn)位,進(jìn)而阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程［27］。NSCs發(fā)育的同時,Cx亞型的表達(dá)模式也會發(fā)生變化,Cx43在胚胎發(fā)育期的腦組織中廣泛表達(dá)［28］。隨著NSCs在體內(nèi)分化為神經(jīng)元,Cx43表達(dá)水平下降,但是Cx43在NSCs表達(dá)調(diào)控仍需進(jìn)一步研究。為明確Cx43在OTUD3調(diào)控NSCs生物學(xué)功能中的作用,本研究采用Western blotting技術(shù)檢測敲除OTUD3后胚胎小鼠腦皮質(zhì)和NSCs中Cx43的表達(dá)情況,結(jié)果顯示OTUD3-/--NSCs中Cx43表達(dá)水平明顯降低,同時在動物水平進(jìn)一步驗證,顯示OTUD3-/-后Cx43表達(dá)明顯降低,由于Cx43是NSCs增殖的抑制蛋白,通過改變細(xì)胞周期進(jìn)展參與調(diào)控NSCs的增殖行為。而OTUD3可以通過調(diào)控下游靶蛋白,調(diào)控細(xì)胞增殖和分化。由此推測OTUD3可能通過調(diào)控Cx43影響NSCs的增殖和分化等生物學(xué)行為,進(jìn)而影響神經(jīng)發(fā)生。

綜上所述,敲除OTUD3后體外培養(yǎng)的NSCs中Cx43表達(dá)下降,可能通過影響細(xì)胞間的連接,進(jìn)而促進(jìn)NSCs的增殖,在神經(jīng)發(fā)育過程發(fā)揮著重要作用。但OTUD3是否通過影響其泛素化水平影響Cx43表達(dá),具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

倫理批準(zhǔn)和動物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會的審核批準(zhǔn)(文件號QDU-AEC-20233-47)。所有實驗過程均遵照《倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)/守則》的條例進(jìn)行。

作者聲明：所有作者均參與了研究的設(shè)計、論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文,且均聲明不存在利益沖突。