沈大春，孫東磊，敖俊華，陳立君，楊欣妍，盧穎林

(廣東省科學(xué)院南繁種業(yè)研究所，廣東廣州 510316)

0 引言

我國(guó)是食糖消費(fèi)大國(guó)，其中食糖80%以上來(lái)源于甘蔗原料。廣泛的甘蔗種植為保障我國(guó)食糖資源自給自足奠定有力原料基礎(chǔ)。但糖料蔗在生產(chǎn)加工壓榨制糖過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量廢棄物，如大量蔗渣、濾泥和糖蜜及其發(fā)酵酒精殘液等[1]，如果直接燃燒則會(huì)造成大量的資源浪費(fèi)，而隨地棄置又會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染，特別是甘蔗糖廠濾泥的處理問(wèn)題，目前大部分是直接還田做肥料或作魚(yú)塘飼料，濾泥直接還田容易引發(fā)水體和地下水污染二次污染問(wèn)題，作魚(yú)塘飼料消化能力有限，同時(shí)也容易引起水體富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致水環(huán)境污染[2]。

研究表明，甘蔗糖廠濾泥富含豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，含有大量的有機(jī)質(zhì)和部分可溶性碳水化合物(如蔗糖)，同時(shí)含有氮磷鉀等大量元素，以及鈣鎂硫硅等中微量元素，養(yǎng)分全面豐富；濾泥既可以作為有機(jī)-無(wú)機(jī)肥料填充劑也可以作為有機(jī)堆肥的主要原料[3]，對(duì)生產(chǎn)有機(jī)-無(wú)機(jī)肥料過(guò)程的粘結(jié)度和水分等有較好的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)以濾泥作為有機(jī)堆肥的主要原料，添加一定比例的碳源包括：蔗渣、糖蜜發(fā)酵廢液、中藥渣和氨基酸有機(jī)廢料等，利用濾泥高溫發(fā)酵菌劑的高效腐解作用可以實(shí)現(xiàn)堆肥過(guò)程中濾泥的高效降解和有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化，有利于濾泥堆肥腐熟度提高和物料安全穩(wěn)定[4]。

但是在濾泥堆肥過(guò)程中，大量的水分和膠結(jié)物等導(dǎo)致濾泥成團(tuán)，溶解氧不足，微生物難以進(jìn)入分解[5-8]，以及濾泥堆肥過(guò)程溫度的升高導(dǎo)致很多具有發(fā)酵降解功能的菌株失去活性——是限制濾泥高溫堆肥腐熟穩(wěn)定的主要因素。在濾泥高溫堆肥中接種芽孢桿菌菌株可以加快堆肥過(guò)程物質(zhì)轉(zhuǎn)化，縮短堆肥腐熟的周期[9-10]。高溫堆肥過(guò)程中起主要作用的是一類(lèi)耐高溫細(xì)菌(如芽孢桿菌類(lèi)菌株)還有少部分真菌和放線菌等[11-12]，若能將濾泥高溫堆肥過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌分離進(jìn)一步和有機(jī)載體復(fù)配形成高效菌劑，并將其再用于濾泥高溫有機(jī)堆肥的生產(chǎn)，可能會(huì)具有良好的應(yīng)用前景和市場(chǎng)價(jià)值[13-15]。目前已有的有關(guān)濾泥肥料化利用的文獻(xiàn)主要集中在利用其作為輔料，同時(shí)微生物菌株主要是屬于外源添加而不屬于原位分離來(lái)源[16-18]。

本文通過(guò)原位篩選分離菌株GBIF-3制備微生物制劑LC，通過(guò)添加微生物制劑LC對(duì)比研究濾泥固體發(fā)酵及堆肥過(guò)程指標(biāo)變化及過(guò)程影響，為微生物制劑LC在甘蔗糖業(yè)濾泥肥料化利用方面的推廣應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

地衣芽孢桿菌菌株GBIF-3(通過(guò)采集甘蔗糖廠長(zhǎng)期堆放濾泥的環(huán)境土壤樣本，以濾泥為唯一營(yíng)養(yǎng)源連續(xù)富集一周分離得到該優(yōu)勢(shì)菌株，進(jìn)一步通過(guò)劃線分離得到單一菌株)，2018年11月16日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(地址：廣州市先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓)，菌種保藏號(hào)為GDMCC NO.60481。其生物學(xué)特性為：在LB平板上，24 h后長(zhǎng)出菌落，革蘭氏陽(yáng)性G+，菌落生長(zhǎng)快，菌落表面相對(duì)光滑，單個(gè)菌株呈桿狀，大小1～2 μm；生理生化試驗(yàn)結(jié)果顯示菌株淀粉水解、果膠分解、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)、檸檬酸鹽、氨硝、產(chǎn)硫化氫、吲哚試驗(yàn)都呈陽(yáng)性“+”；而甲基紅試驗(yàn)、石蕊牛乳試驗(yàn)和苯丙氨酸脫氫酶試驗(yàn)呈陰性“-”。

試驗(yàn)地點(diǎn)：選取在廣東省韶關(guān)市翁源縣茂源糖業(yè)有限公司內(nèi)(110.09°E，21.32°N)。供試濾泥為糖廠副產(chǎn)物，水分含量72.10%，pH 6.15，干物質(zhì)中有機(jī)質(zhì)590.65 g/kg。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微生物制劑LC的制備

將地衣芽孢桿菌菌株GBIF-3接種到LB培養(yǎng)基上，溫度50℃，轉(zhuǎn)速170 r/min，振蕩培養(yǎng)1～2天，離心后去掉上清液取沉淀，再用100 mL的0.9%滅菌生理鹽水重懸，得到細(xì)菌菌液，調(diào)節(jié)細(xì)菌菌液的細(xì)菌OD值為0.5；將細(xì)菌菌液按重量份85%，和重量份甘蔗渣5%、重量份蔗渣生物炭5%以及重量份甘蔗糖蜜5%混合可得到微生物制劑LC。

LB培養(yǎng)基為：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、瓊脂20 g、水1000 mL，pH自然。

1.2.2 微生物制劑LC的酶活力測(cè)定

按照重量比5%接種至裝有100g濾泥固體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，50℃條件下培養(yǎng)箱固體發(fā)酵0～30天過(guò)程中每天取樣(破壞性取樣)，發(fā)酵液8000 r/min、4℃離心5 min；過(guò)濾除去菌體和固體雜質(zhì)后得到粗酶液，測(cè)定木質(zhì)纖維素酶活和蛋白酶活。酶活力測(cè)定方法：取0.5 mL稀釋后的粗酶液至試管中，加1 mL 1%的CMC-Na溶液和0.5 mL的磷酸緩沖液(0.1 mol/mL，pH值6.0)混勻，于50℃水浴反應(yīng)30 min，取出，加入1.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min中止反應(yīng)，冷卻至室溫，以100℃煮沸10 min失活的粗酶液作為空白對(duì)照組，采用3，5-二硝基水楊酸比色法在540 nm下測(cè)定還原糖的量，計(jì)算酶活。

酶活力定義：酶活力的定義參照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，即在相應(yīng)的條件下(50℃)1 min內(nèi)催化底物水解生成1μmol還原糖的酶量定義為一個(gè)酶活力國(guó)際單位(IU)，簡(jiǎn)稱(chēng)U。

濾泥固體發(fā)酵培養(yǎng)基為：100 g濾泥(以干重計(jì))和50 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基；所述的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基配制方法為：尿素0.3 g、(NH4)2SO41.4 g、KH2PO40.5 g、CaCl2·2H2O 0.4 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、蛋白胨1.0 g、FeSO4·7H2O 5.0 mg、MnSO4·H2O 1.6 mg、ZnSO4·7H2O 1.4 mg、CoCl2·6H2O 2.0 mg，pH自然，去離子水1000 mL，121℃高壓滅菌20 min。

1.2.3 微生物制劑LC對(duì)濾泥固體發(fā)酵降解試驗(yàn)

取若干個(gè)250 mL的三角瓶，向250 mL三角瓶中加入100 g干濾泥(烘干粉狀)和50 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，121℃滅菌后，按重量比接種(渦旋儀混勻后，用特制的5 mL滅菌槍頭直接吸取已配制好的LC制劑)5%微生物制劑LC，分別置于30℃和50℃培養(yǎng)箱內(nèi)，紗布封口，發(fā)酵30天，實(shí)驗(yàn)設(shè)置重復(fù)3次。以接種等量無(wú)菌水作為空白對(duì)照。

固體發(fā)酵結(jié)束后，去除固體發(fā)酵物料表面的菌體，于105℃烘干至恒重稱(chēng)重，測(cè)定降解率，降解率=(降解前總質(zhì)量-降解后總質(zhì)量)/100 g×100%。

1.2.4 微生物制劑LC對(duì)甘蔗糖廠濾泥高溫堆肥過(guò)程效果試驗(yàn)

微生物制劑LC按重量5%比例添加至1000 kg的濾泥堆肥中，周期45天，1000 kg的濾泥堆肥輔料為10 kg尿素、5 kg氨基酸廢料、100 kg蔗渣、5 kg玉米秸稈生物炭和50 kg糖蜜及發(fā)酵酒精殘液，對(duì)照為不添加微生物制劑LC，其他保持一致。在整個(gè)堆肥過(guò)程中每10天翻堆一次，每天從堆體中部隨機(jī)取樣分析物料水分含量和監(jiān)測(cè)堆體上中下最高溫度并取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理，再進(jìn)一步用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素多重比較處理間的差異顯著性分析，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物制劑LC的酶活力測(cè)定分析

由圖1、2可知，在常溫30℃和高溫50℃條件下添加微生物制劑LC固體發(fā)酵30天過(guò)程中，濾泥固體發(fā)酵物料木質(zhì)纖維素酶活和蛋白酶活表現(xiàn)出較大差異，常溫30℃條件下，固體發(fā)酵物料木質(zhì)纖維素酶活最高值為30 U/mL，蛋白酶活最高值為9.5 U/mL；而在高溫50℃條件下，固體發(fā)酵物料木質(zhì)纖維素酶活最高值可達(dá)50 U/g，蛋白酶活最高值可達(dá)22 U/mL，而空白對(duì)照(不加LC，50℃)酶活基本為0 U/mL保持不變。

圖1 微生物制劑LC的木質(zhì)纖維素酶活情況

總之，添加微生物制劑LC在高溫50℃條件下比在常溫30℃條件下，固體發(fā)酵的最高木質(zhì)纖維素總酶活提高66.7%以及最高蛋白酶活提高131.6%。

微生物制劑LC按照重量比5%接種至裝有100 g濾泥的固體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，采用同空白對(duì)照對(duì)比的方法研究了菌劑LC在50℃，170 r/min振蕩，固體發(fā)酵15～30天的酶活變化情況，如圖1和圖2所示，在常溫30℃濾泥固體發(fā)酵條件下，微生物制劑LC產(chǎn)木質(zhì)纖維素酶和蛋白酶總體效率不高，但在高溫50℃條件下，微生物制劑LC可以產(chǎn)生大量木質(zhì)纖維素酶類(lèi)，產(chǎn)酶較快且維持時(shí)間較長(zhǎng)。說(shuō)明添加微生物制劑LC對(duì)濾泥固體發(fā)酵具有明顯的促進(jìn)作用，同時(shí)在不同發(fā)酵時(shí)間段不同酶活作用強(qiáng)度有差異，也體現(xiàn)了不同酶之間較好的協(xié)同作用。綜合可知：微生物制劑LC在高溫50℃條件下，以甘蔗糖廠濾泥作為營(yíng)養(yǎng)底物，其與木質(zhì)纖維素降解相關(guān)的木質(zhì)纖維素總酶活表現(xiàn)出較高的活性，另外，其與蛋白水解相關(guān)的蛋白酶活也表現(xiàn)出較高的活性，總體上證明了微生物制劑LC的作用機(jī)理：在高溫條件下，微生物制劑LC產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素水解酶活性較高，水解作用較強(qiáng)，故在高溫下表現(xiàn)出較好的降解作用。

圖2 微生物制劑LC的蛋白酶活情況

2.2 微生物制劑LC對(duì)濾泥固體發(fā)酵降解效果分析

濾泥固體發(fā)酵降解效果如圖3和表1所示，結(jié)果表明，固體發(fā)酵30天，空白對(duì)照CK和添加微生物制劑LC在30℃和50℃條件下對(duì)濾泥固體發(fā)酵降解率分別為0.5%、8.84%和26.25%。說(shuō)明在高溫條件下，微生物制劑LC產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素水解酶和蛋白水解酶加可以顯著加快濾泥的分解和成分的轉(zhuǎn)化，加速各降解底物的進(jìn)一步分解和轉(zhuǎn)化，且在高溫條件下，微生物制劑LC對(duì)濾泥固體發(fā)酵的降解作用明顯強(qiáng)于常溫條件下的固體發(fā)酵作用。

表1 微生物制劑LC對(duì)濾泥固體發(fā)酵降解率

圖3 微生物制劑LC對(duì)濾泥固體發(fā)酵降解效果

2.3 微生物制劑LC對(duì)甘蔗糖廠濾泥高溫堆肥過(guò)程效果試驗(yàn)

由圖4可知，添加微生物制劑LC對(duì)濾泥堆肥過(guò)程溫度的影響顯示，在整個(gè)堆肥過(guò)程中，添加微生物菌劑LC可以加速濾泥堆肥溫度升高，特別是在初始階段可以起到快速起爆作用，加速堆肥溫度升高，在第10天的堆體溫度可以達(dá)到73℃，通過(guò)翻堆以后在一周內(nèi)又可以達(dá)到最高溫度70℃以上，直至第3次翻堆以后，整個(gè)堆肥過(guò)程由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗進(jìn)入緩慢降溫過(guò)程，進(jìn)入后熟階段；同時(shí)和不添加微生物制劑LC(CK)相比，添加微生物制劑LC處理基礎(chǔ)上對(duì)堆肥溫度提升平均10℃以上，尤其是在高溫階段，和常規(guī)堆肥溫度最高到50℃相比，添加微生物制劑LC的堆體溫度最高可以增加20℃，整體上堆肥溫度數(shù)據(jù)表明，添加微生物制劑LC可促進(jìn)濾泥堆肥過(guò)程溫度的提高。

圖4 微生物制劑LC對(duì)濾泥堆肥過(guò)程溫度的影響

由圖5可知，添加微生物制劑LC對(duì)濾泥堆肥過(guò)程水分的影響顯示，在整個(gè)堆肥過(guò)程中，添加微生物菌劑LC可以促進(jìn)濾泥堆肥水分的損失，特別是在翻堆及補(bǔ)充水分，以后隨著溫度的升高水分損失明顯加快，在前30天的堆體水分損失至堆體含水率45%，進(jìn)入后熟階段堆肥含水量降至40%以下；同時(shí)和不添加微生物制劑LC(CK)相比，添加微生物制劑LC處理基礎(chǔ)上對(duì)堆肥水分損失平均促進(jìn)15%以上，其中含水率=(初始含水率-現(xiàn)在含水率)/初始含水率×100%，尤其是在高溫階段，添加微生物制劑LC的堆體水分損失效率增加，整體上堆體水分變化數(shù)據(jù)圖4、5和堆肥溫度變化情況表明，添加微生物制劑LC可促進(jìn)濾泥堆肥過(guò)程溫度的提高，同時(shí)隨著堆體溫度升高，堆體水分損失量增加。

圖5 微生物制劑LC對(duì)濾泥堆肥過(guò)程水分的影響

3 結(jié)論與展望

本文實(shí)驗(yàn)得出的主要結(jié)論有：①在常溫30℃和高溫50℃條件下添加微生物制劑LC固體發(fā)酵30天，不加LC的空白對(duì)照酶活基本為0 U/mL，添加微生物制劑LC在高溫50℃條件下比在常溫30℃條件下固體發(fā)酵的最高木質(zhì)纖維素總酶活提高66.7%以及最高蛋白酶活提高131.6%。②固體發(fā)酵30天，空白對(duì)照和添加微生物制劑LC在30℃和50℃條件下對(duì)濾泥固體發(fā)酵降解率分別為0.5%、8.84%和26.25%。③微生物制劑LC對(duì)甘蔗糖廠濾泥高溫堆肥過(guò)程效果試驗(yàn)表明添加微生物菌劑LC可以加速濾泥堆肥溫度升高，最高可以達(dá)到73℃，和不添加微生物制劑LC(CK)相比，堆肥溫度提升平均10℃以上，最高可以增加20℃。

甘蔗糖廠濾泥發(fā)酵和堆肥效果數(shù)據(jù)表明，添加微生物制劑LC和不添加微生物制劑LC(CK)相比，添加微生物制劑LC很大程度上促進(jìn)了濾泥堆肥溫度的升高和水分的損失。在高溫環(huán)境下微生物制劑LC在濾泥發(fā)酵過(guò)程表現(xiàn)出較高的木質(zhì)纖維素酶活性和蛋白酶活性，本研究結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相近。溫度是反映堆肥中有機(jī)物降解和微生物活性的關(guān)鍵指標(biāo)之一。高溫堆肥過(guò)程可以殺死沙門(mén)氏菌、大腸桿菌和蛔蟲(chóng)卵等病原微生物，是實(shí)現(xiàn)堆肥無(wú)害化處理的關(guān)鍵因子[19-21]。在本次試驗(yàn)中，未添加微生物制劑LC的濾泥降解率在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中均低于添加微生物制劑LC組，表明添加微生物制劑LC可促進(jìn)濾泥的降解，這與高溫固體發(fā)酵過(guò)程中富含木質(zhì)纖維素和蛋白酶類(lèi)功能酶密切相關(guān)[22-24]。有關(guān)研究也表明，堆肥發(fā)酵過(guò)程中微生物分泌的胞外酶是促進(jìn)堆肥無(wú)害化、減量化及資源化必不可少的活性物質(zhì)，不僅能催化降解堆肥物料中各種有機(jī)質(zhì)，還在腐殖質(zhì)的合成以及污染物毒性的削減等過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用，有效控制酶作用對(duì)實(shí)現(xiàn)有機(jī)廢棄物資源化利用具有重要意義[25]。

綜上所述，本文結(jié)果顯示添加微生物制劑LC促進(jìn)了甘蔗糖廠濾泥的降解和堆肥過(guò)程溫度的升高，在產(chǎn)業(yè)化利用上將對(duì)甘蔗糖廠廢棄物合理循環(huán)利用、促進(jìn)地方糖廠和種植戶增收及社會(huì)經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定具有顯著的積極影響。隨著農(nóng)業(yè)勞動(dòng)力減少、農(nóng)業(yè)化肥結(jié)構(gòu)調(diào)整以及施肥方式的改變，蔗區(qū)土壤營(yíng)養(yǎng)不平衡和酸化現(xiàn)象近年來(lái)呈顯著增加趨勢(shì)，如何提高蔗區(qū)的甘蔗產(chǎn)量和糖分一直是廣大科研人員、糖廠管理人員和蔗農(nóng)關(guān)心的問(wèn)題，若能進(jìn)一步加大對(duì)甘蔗糖廠廢棄物的轉(zhuǎn)化利用，形成高附加值產(chǎn)品回到甘蔗種植管理土壤中，則可降低化學(xué)品投入的生產(chǎn)成本，促進(jìn)綜合經(jīng)濟(jì)效益提高。