雷光鴻，樊紅日，李 元，陳 亮，李莉嬌，尹 麗*

(1廣西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院輕工化工學(xué)院，廣西南寧 530003；2廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004)

0 引言

低聚果糖(FOS)合成過程中的關(guān)鍵酶是β-呋喃果糖苷酶(β-Ffase)，葡萄糖和果糖分子的同時存在，調(diào)控好該過程中主要的底物分子蔗糖的濃度，將有助于酶將其聚合生成低聚果糖，在提高轉(zhuǎn)化效率的情況下，促進(jìn)了產(chǎn)物FOS的產(chǎn)生[1]。目前有關(guān)微生物催化生產(chǎn)低聚果糖的相關(guān)報道較少，Shin等[2]在研究利用蔗糖生產(chǎn)低聚果糖之后，評估3種不同的金黃色葡萄球菌菌株使用糖蜜作為蔗糖等效物生產(chǎn)低聚果糖的能力，并且在55℃和pH 5.5條件下培育24 h后實(shí)現(xiàn)了FOS的生產(chǎn)，但是FOS的產(chǎn)率低。黑曲霉具有良好的特性，本文研究了黑曲霉菌株的不同發(fā)酵條件(糖蜜添加量、氮源、孢子接種量、溫度和pH等單因素條件)對黑曲霉菌株產(chǎn)β-Ffase酶酶活和菌絲體濃度(DCW)的影響，得到利用糖蜜產(chǎn)β-Ffase酶的優(yōu)化條件。

1 材料與方法

1.1 菌株與原料

黑曲霉Aspergillus niger，編號：ATCC 20611，下簡稱黑曲霉，凍干管保藏菌種，購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection)；甘蔗糖蜜：由廣西南寧糖業(yè)股份有限公司明陽糖廠提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

YM培養(yǎng)基：麥芽糖提取物3.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，酵母提取物3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，115℃滅菌30 min，作為黑曲霉活化(種子)培養(yǎng)基。

FM培養(yǎng)基：蔗糖20.0 g/L，酵母提取物15.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，NaNO32.0 g/L，K2HPO45.0 g/L，用0.1 mol/L HCl調(diào)pH至5.5，121℃滅菌20 min，作為黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基。

1.2.2 黑曲霉菌絲體的制備

先將黑曲霉ATCC 20611菌株經(jīng)YM培養(yǎng)基活化，在通過發(fā)酵培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)酶后，分離出成熟的菌絲體并將其保存在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中。

1.2.3 黑曲霉菌絲體酶活的測定

β-Ffase酶活的測定：1 U的β-Ffase定義為1 min酶催化蔗糖反應(yīng)產(chǎn)生1 μmol的還原糖所需的酶量，參考Dorta等[3]的酶活測定方法并加以修改后具體如下：配制4 mL 25%的蔗糖溶液和6 mL pH 5.0的檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液，混合，加入0.04 g黑曲霉菌體后，50℃條件下水浴震蕩反應(yīng)2 h后置于電爐上后加熱沸騰10 min使酶失活。加入1 mL上述稀釋適當(dāng)倍數(shù)的上清液于25 mL的酶標(biāo)管中，隨后加入2 mL DNS試劑，置于沸水浴中計時2 min后，迅速放置于冰水中冷卻，最后在酶標(biāo)管中加入超純水至25 mL，于540 nm波長下測定樣品對的吸光值。根據(jù)制備的DNS標(biāo)準(zhǔn)曲線代入計算出菌絲體酶活。

1.2.4 DCW的測定

使用干重法測定發(fā)酵液菌絲體濃度。分別將離心管置于烘箱中烘干至恒重，隨后置于干燥器中冷卻至室溫后稱重(X1)，黑曲霉發(fā)酵過程中每間隔12 h取5 mL發(fā)酵液樣品于上述已經(jīng)烘干處理后的離心管中，在7000 r/min的條件下離心10 min，棄上清液，加入10 mL生理鹽水振蕩混勻，隨后同樣在7000 r/min的條件下離心10 min后倒掉上清液，重復(fù)該步驟1次。隨后將帶有菌絲體沉淀的離心管置于烘箱烘干至恒重，再稱重(X2)，每個樣品進(jìn)行3次平行測定后取平均值。

式(1)中，DCW為β-Ffase酶菌絲體濃度，g/L；X2為干燥至恒重后菌絲體和離心管的總質(zhì)量，g；X1為干燥至恒重后離心管的質(zhì)量，g；V為發(fā)酵液體積，mL。

1.2.5 糖蜜預(yù)處理方法

量取500 mL糖蜜于燒杯中，以1∶1將糖蜜與蒸餾水在2 L大燒杯中混合，將2 mmol/L EDTA溶液加入甘蔗糖蜜溶液中，靜置12 h，取上清液，在上清液中加入適量的活性炭(1.5% w/v)，脫色，12000 r/min離心15 min，取上清液。

1.2.6 黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化

根據(jù)參考文獻(xiàn)[3-4]提供的培養(yǎng)條件，預(yù)處理后糖蜜添加量10%，氮源酵母粉添加量10 g/L，孢子接種量7.5 %，培養(yǎng)基pH 6.0，發(fā)酵溫度35℃，200 r/min條件下培養(yǎng)48 h，β-Ffase酶活289.17 U/mL，細(xì)胞干重7.95 g/L。在此基礎(chǔ)上，將新鮮的黑曲霉孢子接種于糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)基的優(yōu)化，考察不同條件單因素對黑曲霉菌株產(chǎn)β-Ffase酶酶活和DCW的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖蜜添加量對菌株產(chǎn)β-Ffase的影響

預(yù)處理后的糖蜜，極大程度上保留甘蔗糖蜜中蔗糖含量，有效地除去了原糖蜜中膠體灰分等不利于微生物生長產(chǎn)酶的有害成分，另外，糖蜜本身就含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，生物素含量也很可觀，是很好的發(fā)酵原料，可作為黑曲霉菌絲體發(fā)酵生長和產(chǎn)酶的發(fā)酵原料(廉價碳源替代品)。本研究進(jìn)一步選取2.5%、5%、10%、15%和20%糖蜜添加量分析β-Ffase酶活和菌絲體DCW，將新鮮的黑曲霉孢子接種于糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中，孢子接種量7.5%，氮源(酵母粉)添加量為10 g/L，培養(yǎng)基pH 6.0，發(fā)酵溫度35℃，200 r/min條件下培養(yǎng)48 h，考察不同糖蜜添加量對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶及菌株生長的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖1所示。

圖1 糖蜜添加量對黑曲霉菌株生長和產(chǎn)酶的影響

由圖1可知，不同糖蜜添加量對黑曲霉菌株產(chǎn)酶活性和菌絲體干重的影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)糖蜜添加量由2.5%增加到15%時，β-Ffase酶活由268.10 U/mL增長到382.01 U/mL；菌絲體DCW由4.68 g/L增長到7.93 g/L，該階段黑曲霉菌株不斷利用糖蜜中的營養(yǎng)成分，生長旺盛的同時持續(xù)產(chǎn)酶，糖蜜培養(yǎng)基可有效提高菌株的生長量和產(chǎn)酶效果，而當(dāng)糖蜜添加量繼續(xù)增大達(dá)到20%時，過多的糖蜜添加對菌絲體生長和產(chǎn)酶情況產(chǎn)生抑制作用，菌絲體酶活和DCW分別下降到338.86 U/mL和7.55 g/L，此后糖蜜量的增加不利于黑曲霉菌株生長和產(chǎn)酶。綜合考慮，以15%糖蜜添加量作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，更適合黑曲霉菌株的糖蜜發(fā)酵生長，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 溫度對菌株產(chǎn)β-Ffase的影響

黑曲霉對發(fā)酵溫度較敏感，之前有關(guān)黑曲霉菌株研究表明[5]，黑曲霉菌株適合在25℃之間的環(huán)境下發(fā)酵生長產(chǎn)酶。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)溫度過高或過低時，菌株代謝活性都會受到影響，從而抑制黑曲霉菌株的生長和酶的合成分泌。因此，為了使得菌株生長旺盛并獲得較高的β-Ffase酶活性，需要探究黑曲霉菌株在糖蜜條件下生長的合適溫度。實(shí)驗(yàn)以20℃、25℃、30℃、35℃和40℃來分析β-Ffase酶活和菌絲體DCW，將新鮮的黑曲霉孢子接種于糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中，糖蜜添加量15%，氮源(酵母粉)添加量為10 g/L，孢子接種量7.5%，培養(yǎng)基pH 6.0，200 r/min條件下培養(yǎng)48 h，考察不同溫度對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶及菌株生長的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 溫度對黑曲霉菌株生長和產(chǎn)酶的影響

從圖2可知，隨著溫度的升高，黑曲霉菌絲體的DCW和β-Ffase酶活呈先升高再降低的趨勢，由20℃上升到30℃之前，β-Ffase酶活和DCW隨著溫度的升高而增加，發(fā)酵溫度為30℃時，黑曲霉菌株產(chǎn)酶活性達(dá)到最大，β-Ffase酶活為372.43 U/mL，DCW為8.11 g/L；當(dāng)溫度超過30℃后，黑曲霉菌株的酶活呈現(xiàn)下降趨勢，溫度升高到35℃時，菌株產(chǎn)酶活力有所下降，β-Ffase酶活降至335.18 U/mL；DCW為7.19 g/L，在40℃時，β-Ffase酶活只有308.15 U/mL，DCW為6.49 g/L。溫度過高，酶的產(chǎn)生受到抑制，黑曲霉菌株生物量減少，β-Ffase酶活力降低，影響發(fā)酵周期及產(chǎn)酶效率。由此，選定30℃為黑曲霉菌株在糖蜜發(fā)酵條件下最適的產(chǎn)酶溫度較為合適。

2.3 pH值對菌株產(chǎn)β-Ffase的影響

pH值是影響黑曲霉生長和代謝活性的重要因素之一，且黑曲霉菌株所分泌的果糖基轉(zhuǎn)移酶多為酸性酶(pH 5.0左右)，pH值通過影響甘蔗糖蜜培養(yǎng)環(huán)境下，菌絲體對有效成分溶解后利用進(jìn)程，發(fā)酵過程中的氧化還原反應(yīng)和β-Ffase酶活性，對菌絲體生長和酶的積累有較大影響[6]。以pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0分析β-Ffase酶活和菌絲體DCW，將新鮮的黑曲霉孢子接種于糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中，糖蜜添加量15%，氮源(酵母粉)添加量為10 g/L，孢子接種量7.5%，發(fā)酵溫度30℃，200 r/min條件下培養(yǎng)48 h，考察不同pH值對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶及菌株生長的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH對黑曲霉菌株生長和產(chǎn)酶的影響

由圖3可見，糖蜜培養(yǎng)基中pH值對黑曲霉菌株生長和產(chǎn)酶有較大影響，在初始pH值由4不斷增大的過程中，DCW和β-Ffase酶活呈現(xiàn)增加的趨勢；當(dāng)pH值為5.5時，β-Ffase酶活達(dá)到最大值，為409.30 U/mL，此時DCW為8.75 g/L，黑曲霉菌株生長良好，菌絲體適應(yīng)在此偏酸性環(huán)境下繁殖和產(chǎn)酶；而隨著pH值繼續(xù)增加，pH值為6.0時菌株產(chǎn)酶活力有所下降，β-Ffase酶活降至364.60 U/mL，此時DCW為9.17 g/L；當(dāng)pH值6.5時，β-Ffase酶活降至345.02 U/mL，此時DCW為8.23 g/L。糖蜜培養(yǎng)基環(huán)境中的氫離子濃度調(diào)節(jié)微生物的增殖和酶的合成，在中性至堿性環(huán)境下會分散質(zhì)膜抑制酶活性和膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，抑制黑曲霉菌絲體生長和產(chǎn)酶[7]，由此，黑曲霉菌株在糖蜜培養(yǎng)基中最適合的生長產(chǎn)酶pH值為5.5。

2.4 氮源對菌株產(chǎn)β-Ffase的影響

以5、10、15、20和25 g/L酵母粉添加量分析β-Ffase酶活和菌絲體DCW，將新鮮的黑曲霉孢子接種于糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中，糖蜜添加量15%，孢子接種量7.5%，培養(yǎng)基pH 5.5，發(fā)酵溫度30℃，200 r/min條件下培養(yǎng)48 h，考察酵母粉(氮源)添加量對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶及菌株生長的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 酵母粉添加量對黑曲霉菌株生長和產(chǎn)酶的影響

從圖4可知，隨著酵母粉添加量增加，菌絲體酶活呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)酵母粉的添加量為20 g/L時，β-Ffase酶活力最大，達(dá)到411.48 U/mL，菌絲體生長良好，DCW達(dá)到8.56 g/L。當(dāng)酵母粉添加量達(dá)到25 g/L時，其菌絲體進(jìn)一步生長，DCW達(dá)到9.69 g/L，而此時β-Ffase酶活卻下降，為380.99 U/mL，過量的氮和磷可能導(dǎo)致菌株的快速生長但不利于細(xì)胞產(chǎn)酶，限制了β-Ffase酶活力[8]。菌絲過度生長，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)多用于其他生命活動而產(chǎn)酶量減少，酶活性開始下降，由此確定最適的酵母粉添加量為20 g/L。

2.5 孢子接種量對菌株產(chǎn)β-Ffase的影響

以2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%和15%孢子接種量分析β-Ffase酶活和菌絲體DCW，將新鮮的黑曲霉孢子接種于糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中，糖蜜添加量15%，氮源(酵母粉)添加量為20 g/L，培養(yǎng)基pH 5.5，發(fā)酵溫度30℃，200 r/min條件下培養(yǎng)48 h，考察不同接種量對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶及菌株生長的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 孢子接種量對黑曲霉菌株生長產(chǎn)酶的影響

由圖5可見當(dāng)孢子接種量由2.5%增長到10%時，黑曲霉菌株的β-Ffase酶活和DCW均呈現(xiàn)上升趨勢，該階段菌絲體生物量處于增長時期，且黑曲霉菌株生物量過少而不能有效的利用糖蜜發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分，使得發(fā)酵周期滯后，不利于菌株分泌β-Ffase酶，從而影響了黑曲霉發(fā)酵甘蔗糖蜜的效率和產(chǎn)酶效果，因此需進(jìn)一步增大接種量，黑曲霉菌株在短時間內(nèi)快速繁殖且產(chǎn)酶活性良好的效果[9]。

當(dāng)孢子接種量達(dá)到10% 時，β-Ffase酶活達(dá)到最高為414.82 U/mL，菌絲體DCW達(dá)到8.45 g/L。此后，接種量繼續(xù)增加時，β-Ffase酶活性出現(xiàn)下降趨勢，菌絲體卻在進(jìn)一步生長。當(dāng)接種量為12.5%時，β-Ffase酶活為386.67 U/mL，DCW達(dá)到9.23 g/L；因?yàn)殒咦咏臃N量過大，黑曲霉菌絲體迅速生長繁殖，糖蜜發(fā)酵液粘度增大而溶氧量不夠，不利于黑曲霉菌株分泌β-Ffase，菌株產(chǎn)酶受抑制；當(dāng)接種量為15%時，菌株已過量生長，糖蜜中的營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，菌絲體生長受限，β-Ffase酶活降至371.27 U/mL，DCW為8.91 g/L；這與前人研究黑曲霉的生長和產(chǎn)酶曲線隨著時間的推移，菌絲體的生長和產(chǎn)酶效率所呈現(xiàn)先增加而后減少的趨勢相一致[6]。因此，選取10%接種量作為黑曲霉產(chǎn)酶的最適孢子接種量，更利于黑曲霉菌株在糖蜜條件下生長和產(chǎn)酶。

3 討論與結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黑曲霉菌株產(chǎn)β-Ffase酶的優(yōu)化發(fā)酵條件為：采用預(yù)處理的甘蔗糖蜜，添加量為15%、有機(jī)氮源酵母粉20 g/L、pH 5.5、孢子接種量10%、溫度30℃；進(jìn)一步加入0.3%表面活性劑吐溫-80，促進(jìn)β-Ffase酶活性的表達(dá)；在優(yōu)化條件下連續(xù)培養(yǎng)黑曲霉，菌株生長和產(chǎn)酶情況如圖6所示，菌株在此條件下生長良好。培養(yǎng)48 h后，與文獻(xiàn)[3-4]提供的培養(yǎng)基條件相比較，β-Ffase酶活達(dá)到463.87 U/mL，提高了1.6倍，菌絲體DCW為11.77 g/L，提高了1.48倍，提高菌株產(chǎn)酶活性和促進(jìn)菌株生長的效果。

圖6 糖蜜培養(yǎng)基優(yōu)化條件下的發(fā)酵過程

本研究提出黑曲霉菌株產(chǎn)β-Ffase酶的發(fā)酵條件，這將有助于探究甘蔗糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)低聚果糖，促進(jìn)其工業(yè)化利用。研究發(fā)現(xiàn)具有高β-Ffase酶活性的黑曲霉菌株能夠催化甘蔗糖蜜，高效地轉(zhuǎn)化為FOS，該過程避免了昂貴的酶純化程序的需要[10]。糖蜜作為催化底物，整個黑曲霉菌絲體作為生物催化劑，能大大降低工業(yè)上生產(chǎn)FOS的生產(chǎn)成本。因此，本研究中開發(fā)的用于FOS生產(chǎn)的黑曲霉菌株和生物工藝在FOS食品和飼料添加劑等生產(chǎn)中具有很高的應(yīng)用潛力。