燕品?！】艿抡≈苜F華　李偉　程超

摘要：文章以鳳頭姜仔姜和老姜為實驗材料，利用乙醇萃取反復沉淀的方法制備鳳頭姜仔姜、老姜醇溶黃酮，采用化學發(fā)光法構建了超氧陰離子自由基（O2-·）、羥自由基（·OH）、H2O2和對DNA損傷的保護作用4種抗氧化體系，分別測定鳳頭姜仔姜、老姜醇溶黃酮在4種不同抗氧化體系中的抗氧化能力。結果顯示，鳳頭姜仔姜、老姜清除O2-·的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為（26.761 3±0.416 8），（31.108 3±0.337 0） μg/mL；清除·OH的IC50分別為（4.276 3±0.889 8），（14.395 0±0.969 6） μg/mL；清除H2O2的IC50分別為（0.172 3±0.002 1），（0.172 0±0.004 4） μg/mL；對DNA損傷保護的IC50分別為（6.832 0±1.020 6），（8.547 0±0.461 6） μg/mL。T檢驗發(fā)現(xiàn)鳳頭姜仔姜醇溶黃酮的抗氧化能力顯著強于老姜，但在過氧化氫體系中，鳳頭姜仔姜的抗氧化能力與老姜無顯著差異。

關鍵詞：鳳頭姜仔姜；鳳頭姜老姜；醇溶黃酮；化學發(fā)光法；抗氧化

中圖分類號：TS201.2文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2023）06-0053-06

Abstract： In this paper， with tender and old Fengtou ginger as the experimental material， the alcohol-soluble flavonoids of tender and old Fengtou ginger are prepared by ethanol extraction and repeated precipitation. Four antioxidation systems including superoxide anion free radical （O2-·）， hydroxyl free radical （·OH）， H2O2 and the protection effect of DNA damage are established by chemiluminescence method. The antioxidant capacity of alcohol-soluble flavonoids of tender and old Fengtou ginger in the four different antioxidant systems is determined respectively. The results show that the half maximal inhibitory concentration （IC50） of tender and old Fengtou ginger on scavenging O2-· is （26.761 3±0.416 8），（31.108 3±0.337 0） μg/mL; the IC50 on scavenging ·OH is （4.276 3±0.889 8），（14.395 0±0.969 6） μg/mL; the IC50 on scavenging H2O2 is （0.172 3±0.002 1），（0.172 0±0.004 4） μg/mL; the IC50 on the protection of DNA damage is （6.832 0±1.020 6），（8.547 0±0.461 6） μg/mL. T test shows that the antioxidant capacity of tender Fengtou ginger alcohol-soluble flavonoids is significantly stronger than that of old ginger， but there is no significant difference between the antioxidant capacity of tender and old Fengtou ginger in hydrogen peroxide system.

Key words： tender Fengtou ginger; old Fengtou ginger; alcohol-soluble flavonoids; chemiluminescence method; antioxidation

收稿日期：2022-12-30

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFD0400104）；恩施州科技局計劃項目（D20190023）

作者簡介：燕品睿（1997—），男，碩士研究生，研究方向：生物資源開發(fā)利用。

*通信作者：程超（1976—），女，教授，博士，研究方向：食品化學及資源開發(fā)。

生姜（Zingiber officinale Roscoe）是姜屬草本植物的新鮮根莖[1]，因其獨特的風味在世界范圍內被廣泛種植，我國是生姜的主要發(fā)源地之一，具有兩千多年的種植歷史[2]。湖北省來鳳縣有五百余年的生姜種植歷史，全縣年產量約4 500萬公斤，產量居全省之首。來鳳縣生姜形如鳳凰頭，因此俗稱“鳳頭姜”，風味質構等品質獨特。鳳頭姜仔姜無筋脆嫩、辛辣適中、美味可口、食用價值高，因此由仔姜加工而成的產品備受歡迎。

生姜營養(yǎng)成分豐富，新鮮生姜可溶性糖、淀粉、蛋白質含量分別為2.1%～5.3%、5.8%～7.9%、7.9%～10.1%；此外，生姜還含有黃酮、維生素及蛋白酶等多種特征成分，正是生姜中特征成分的存在才使其具有抗氧化、抗炎、抗癌、降血糖等多種生物活性[3]。在生姜特征成分中，黃酮含量高達0.75%。現(xiàn)已證明黃酮具有一定的抗氧化活性[4]，但不同黃酮的抗氧化能力有差異，主要影響因素有內因和外因兩種，外因主要包括黃酮提取分離的系統(tǒng)溶劑，不同的系統(tǒng)溶劑導致萃取的黃酮結構、溶解性等有差異[5]，因此抗氧化效果隨之變化。前期研究發(fā)現(xiàn)，乙醇提取的生姜黃酮溶液旋轉濃縮低溫靜置后，分別生成兩種不同的產物——上清液和結晶，分別命名為醇提水溶黃酮和醇溶黃酮，其中醇提水溶黃酮對超氧陰離子自由基、羥自由基、H2O2均具有較好的清除作用[6]。影響黃酮抗氧化效果的內因主要包括生姜自身所含的黃酮物質的種類，而影響內因的主要因素是生姜的品種和生長環(huán)境，劉步云等[7]發(fā)現(xiàn)，云南黃姜和永康黃姜的抗氧化和抗炎癥效果要優(yōu)于其他生姜。梅邢等[6]研究發(fā)現(xiàn)，鳳頭姜老姜的醇溶和水溶黃酮抗氧化效果較好，而人們喜食的鳳頭姜仔姜和老姜的黃酮抗氧化功能的差異目前還未見相關報道。

目前用于評價抗氧化能力的方法多種多樣，如高效液相色譜法、分光光度法、化學發(fā)光法、電子自旋共振法、電化學法和熒光光譜法，其中化學發(fā)光法以其靈敏度高、儀器簡單、操作方便等優(yōu)點受到了廣泛關注[8]。因此，本文以鳳頭姜仔姜、老姜為試材，采用醇提濃縮反復沉淀的方法制備鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮，利用化學發(fā)光法的4種抗氧化體系系統(tǒng)評價其抗氧化能力的差異，進而為鳳頭姜資源的深度開發(fā)提供理論資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

鳳頭姜仔姜（8月初采收）、鳳頭姜老姜（11月采收）：湖北省鳳頭食品有限公司。

1.1.2 主要試劑

氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、鄰菲羅啉、碳酸鈉、碳酸氫納、抗壞血酸、硫酸銅、雙氧水、鄰苯三酚：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；蘆?。悍治黾?，上海西亞實業(yè)總公司；魯米諾：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

RE-2000A旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；GloMax-Multi Jr單管化學發(fā)光儀 美國Promega公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮的提取方法

將鳳頭姜仔姜和老姜分別洗凈瀝干切塊，榨汁取汁液并用尼龍布（200目）過濾，取濾液，于4 ℃靜置24 h后取上清液，加入無水乙醇至終濃度達到80%，保持1 h，期間反復振搖3次，而后離心15 min得上清液（4 000 r/min），旋轉濃縮至乙醇揮發(fā)，將濃縮液于4 ℃靜置24 h，去上清液，取沉淀加蒸餾水混勻，于4 ℃再次靜置24 h，如此反復處理3次，最后將結晶部分冷凍干燥，得鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮[5]。

1.3.2 鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮得率測定

蘆丁標準曲線的制作方法：配制0.2 mg/mL蘆丁標準溶液，分別取0，1，2，3，4，5，6 mL此標準溶液于25 mL容量瓶中，依次加入5% NaNO2溶液0.6 mL、10% Al（NO3）3溶液0.6 mL、4% NaOH溶液8 mL、60%乙醇定容，靜置15 min后測定510 nm處的吸光度值，記為A510[6-9]，以A510為縱坐標、蘆丁質量（mg）為橫坐標繪制散點圖，線性擬合后得回歸方程y=0.439 0x－0.007 9，R2=0.999 2。

鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮含量測定：稱取1.3.1制備的黃酮粉末，用60%乙醇溶解并定容至25 mL，移取1 mL，按蘆丁標準曲線制作方法測定生姜黃酮溶液的A510，按式（1）計算黃酮含量：

C=A510+0.007 90.439×F。（1）

式中：C為黃酮含量（mg/mL）；F為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮對O2-·的清除作用

在發(fā)光池中依次加入50 μL不同濃度的鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮溶液、魯米諾和碳酸緩沖液混合物900 μL、6.25×10-4 mol/L鄰苯三酚50 μL，反應溫度30 ℃，連續(xù)測定 400 s發(fā)光強度，間隔2 s 記數(shù)，此為樣品發(fā)光管（chemiluminescence intensity of sample，簡寫為CLs）?？瞻装l(fā)光管（chemiluminescence intensity of blank，簡寫為CLb）用60%乙醇替換黃酮溶液，本底發(fā)光管（chemiluminescence intensity of background，簡寫為CLg）用重蒸水替換鄰苯三酚溶液[10-13]。

1.3.4 鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮對·OH的清除作用

在發(fā)光池中依次加入50 μL不同濃度的鳳頭姜老姜和仔姜醇溶黃酮溶液、pH 9.0的0.05 mol/L 硼砂700 μL、1.0 mmol/L CuSO4 和1.0 mmol/L鄰菲羅啉溶液各50 μL、1 mmol/L VC 100 μL、0.15% H2O2 50 μL，間隔3 s記數(shù)，記錄400 s發(fā)光強度 [14-16]，此為樣品發(fā)光管（CLs）。空白發(fā)光管（CLb）用60%乙醇替換黃酮溶液，本底發(fā)光管（CLg）用重蒸水替換H2O2溶液。

1.3.5 鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮對H2O2的清除作用

在發(fā)光池中依次加入50 μL不同濃度的鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮溶液、0.1 mmol/L魯米諾溶液（用pH 7.4的0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液配制）600 μL、0.4 mmol/L FeSO4 50 μL、1.5% H2O2 50 μL，反應溫度30 ℃，間隔2 s記數(shù)，測定100 s發(fā)光強度[17]，此為樣品發(fā)光管（CLs）。空白發(fā)光管（CLb）用60%乙醇替換黃酮溶液，本底發(fā)光管（CLg）用重蒸水替換H2O2溶液。

1.3.6 鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮對DNA損傷的保護作用

在發(fā)光池中依次加入100 μL不同濃度的鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮溶液、800 μL DNA-Cu2+-Phen溶液（用0.1 mol/L醋酸緩沖液配制，含有3 μg/mL DNA、7.5×10-5 mol/L CuSO4、5.25×10-4 mol/L Phen）、4.2×10-3 mol/L VC 100 μL、3% H2O2 200 μL，間隔3 s記數(shù)，記錄800 s發(fā)光強度[18-20]，此為樣品發(fā)光管（CLs）?？瞻装l(fā)光管（CLb）用60%乙醇替換黃酮溶液，本底發(fā)光管（CLg）用重蒸水替換H2O2溶液。

1.3.7 鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮抗氧化數(shù)據統(tǒng)計分析

實驗平行3次，結果以“平均值±標準偏差”表示。采用SPSS 25.0進行T檢驗，采用Excel 2010和Origin 2021繪圖。按式（2）計算清除率（I）：

I（%）=CLb－CLsCLb－CLg×100。（2）

2 結果與分析

2.1 鳳頭姜老姜和仔姜醇溶黃酮對O2-·的清除作用

以60%乙醇為溶劑，配制0.35，0.56，0.7，0.92，1.4 mg/mL的鳳頭姜老姜醇溶黃酮溶液，0.18，0.36，0.72，0.96，1.46 mg/mL的鳳頭姜仔姜醇溶黃酮溶液，按照1.3.3實驗方法測定其對O2-·的清除作用，結果見圖1。

根據圖1中a、b不同濃度鳳頭姜老姜、仔姜醇溶黃酮清除O2-·的發(fā)光強度曲線，按照式（2）計算不同質量濃度黃酮對O2-·的清除率，以清除率（y）為縱坐標、黃酮質量濃度（μg/mL）為橫坐標（x）繪制劑量-效應關系圖，見圖1中c。生姜醇溶黃酮濃度越高，清除O2-·能力越強。此外，依據Excel擬合得鳳頭姜仔姜、老姜醇溶黃酮清除O2-·的回歸方程，計算可得到鳳頭姜仔姜、老姜清除O2-·的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為（26.761 3±0.416 8），（31.108 3±0.337 0） μg/mL，IC50越小，說明黃酮對O2-·的清除能力越強，因此對比IC50可知鳳頭姜仔姜醇溶黃酮對O2-·的清除能力強于老姜。

2.2 鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮對·OH的清除作用

以60%乙醇為溶劑，配制0.04，0.22，0.34，0.44，0.68 mg/mL的鳳頭姜老姜醇溶黃酮溶液，0.03，0.06，0.10，0.20，0.34 mg/mL的鳳頭姜仔姜醇溶黃酮溶液，按照1.3.4實驗方法測定其對·OH的清除作用，結果見圖2。

按照測定鳳頭姜仔姜、老姜醇溶黃酮對·OH的清除效果的方法繪制對·OH清除能力的劑量效應關系圖并擬合回歸方程，見圖2中c。兩種生姜醇溶黃酮對·OH的清除能力符合冪函數(shù)關系，根據回歸方程計算可得出鳳頭姜仔姜、老姜的IC50為（4.276 3±0.889 8），（14.395 0±0.969 6） μg/mL，由此可見鳳頭姜仔姜對·OH的清除能力強于老姜。

2.3 鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮對H2O2的清除作用

以60%乙醇為溶劑，配制1.35，3.00，4.50，6.00，10.50 μg/mL的鳳頭姜老姜醇溶黃酮溶液，0.15，1.50，3.00，6.00，7.50 μg/mL的鳳頭姜仔姜醇溶黃酮溶液，按照1.3.5實驗方法測定不同生姜醇溶黃酮對H2O2的清除作用，結果見圖3。

按照測定鳳頭姜仔姜、老姜醇溶黃酮對H2O2的清除效果的方法繪制對H2O2清除能力的劑量-效應關系圖并擬合回歸方程，見圖3中c。兩種生姜醇溶黃酮濃度越大，其對H2O2的清除作用越強。根據回歸方程計算可得出鳳頭姜仔姜、老姜的IC50為（0.172 3±0.002 1），（0.172 0±0.004 4） μg/mL，由此可見鳳頭姜老姜對H2O2的清除能力較強。

2.4 鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮對DNA損傷的保護作用

以60%乙醇為溶劑，配制0.04，0.07，0.10，0.16，0.20 mg/mL的鳳頭姜老姜醇溶黃酮溶液，0.02，0.05，0.09，0.16，0.18 mg/mL的鳳頭姜仔姜醇溶黃酮溶液，按照1.3.6實驗方法測定對DNA損傷的保護作用，結果見圖4。

按照測定鳳頭姜仔姜、老姜醇溶黃酮對DNA損傷的保護作用的方法繪制對DNA損傷保護作用的劑量-效應關系圖并擬合回歸方程，見圖4中c。兩種生姜醇溶黃酮對DNA損傷的保護作用隨著醇溶黃酮濃度的增加而增強，根據回歸方程可計算鳳頭姜仔姜、老姜的IC50分別為（6.832 0±1.020 6），（8.547 0±0.461 6） μg/mL，由IC50可以看出鳳頭姜仔姜醇溶黃酮對DNA損傷的保護作用強于老姜。

2.5 鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮抗氧化效果對比

利用SPSS軟件對兩種生姜醇溶黃酮對O2-·、·OH、H2O2的清除能力和DNA損傷保護作用的IC50進行T檢驗，結果見圖5。

對比圖5中的IC50可以看出，鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮對H2O2的IC50值最小，而對O2-·的IC50值最大，說明對H2O2清除體系最敏感，對O2-·體系敏感性最差。此外，鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮抗氧化能力有差異，通過T檢驗可以看出，鳳頭姜仔姜醇溶黃酮除在H2O2體系中清除效果與老姜的無顯著差異外，在其他3種抗氧化體系中，鳳頭姜仔姜醇溶黃酮的抗氧化能力顯著強于老姜，這說明抗氧化體系對生姜醇溶黃酮抗氧化能力影響較大，但4種抗氧化體系的相關性尚不明確，因此以鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮對4種抗氧化體系的IC50進行相關性分析，結果見圖6。

由圖6可知，在4種抗氧化體系中， O2-·清除體系和·OH清除體系、H2O2清除體系、DNA損傷保護體系之間呈顯著正相關，可能是因為生物體內產生的自由基主要包括O2-·、·OH、脂質過氧化產物、單線態(tài)氧等自由基，而O2-·是第一氧自由基[21-22]，說明O2-·與其他自由基的產生具有相關性，所以導致抗氧化劑對它們的清除作用也有相關性。此外，鳳頭姜仔姜和老姜醇溶黃酮對DNA損傷的保護作用與O2-·和·OH顯著相關，可能是因為生物體內自由基如O2-·、·OH、脂質過氧化產物會引起核酸分子破壞、碳水化合物碳鏈斷裂等，即DNA損傷是由自由基引發(fā)的。

3 結論

本文采用4種抗氧化體系評價了不同生姜醇溶黃酮對O2-·、·OH、H2O2的清除能力及對DNA損傷的保護作用，通過比較IC50發(fā)現(xiàn)醇溶黃酮對O2-·、·OH的清除效果以及對DNA損傷的保護作用由弱到強依次為鳳頭姜老姜、仔姜；對H2O2的清除效果由弱到強依次為鳳頭姜仔姜、老姜。通過對鳳頭姜老姜、仔姜醇溶黃酮不同抗氧化體系的IC50值進行T檢驗分析發(fā)現(xiàn)，鳳頭姜仔姜醇溶黃酮的抗氧化能力顯著強于老姜，但過氧化氫體系除外。產生此差異的原因可能是鳳頭姜在生長代謝過程中，黃酮類化合物的種類及相對含量發(fā)生了改變，李東芹[23]研究發(fā)現(xiàn)產自山東安丘的老姜中姜烯酚、姜酮及其甲基化衍生物含量高于仔姜，但姜酚系列乙?；苌锏暮康陀谧薪６P頭姜中黃酮類化合物的種類和相對含量的變化規(guī)律有待進一步研究。

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