劉禎珍　賈倩雯　李田田　周姝靜　遲乃玉　張慶芳

摘要：為探究低鹽泡菜的最佳制作工藝，對(duì)鹽濃度為0%、2%、4%的3種泡菜發(fā)酵過程中pH、總酸、還原糖、可溶性固形物、亞硝酸鹽等理化指標(biāo)進(jìn)行追蹤檢測，感官評(píng)判泡菜產(chǎn)品的品質(zhì)，采用高通量技術(shù)進(jìn)行菌群分析。結(jié)果表明，不同鹽濃度的泡菜發(fā)酵過程中總酸、可溶性固形物、亞硝酸鹽含量均有差異。發(fā)酵第9天時(shí)，不同鹽濃度的泡菜的pH均達(dá)到3.6左右，亞硝酸鹽含量均不超過6.0 mg/L，無鹽泡菜的總酸、還原糖含量最高，分別達(dá)2.73 g/dL和2.80 mmol/L，4%鹽濃度的泡菜的可溶性固形物含量最高，達(dá)11.05%。對(duì)不同時(shí)間下3種鹽濃度的泡菜進(jìn)行評(píng)定，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵30 d、4%鹽濃度的泡菜產(chǎn)品評(píng)價(jià)最好。細(xì)菌多樣性分析結(jié)果表明，乳酸菌（Lactobacillus，10.09%）、明串珠菌（Leuconostoc，4.29%）等菌群占絕對(duì)優(yōu)勢。

關(guān)鍵詞：低鹽；泡菜；感官評(píng)價(jià)；制作工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TS255.54文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2023）06-0132-06

Abstract： In order to explore the best production process of low-salt pickles， pH， total acid， reducing sugar， soluble solids， nitrite and other physicochemical indexes of three kinds of pickles with salt concentration of 0%， 2%， 4% during the fermentation are traced and detected， and then the quality of pickle products is evaluated by sensory evaluation， and high throughput technology is used to analyze the microflora. The results show that the content of total acid， soluble solids and nitrite in pickles during fermentation is different with different salt concentrations. On the 9th day of fermentation， the pH of pickles with different salt concentrations is all about 3.6， and the nitrite content is all less than 6.0 mg/L. The content of total acid and reducing sugar of pickles without salt is the highest， reaching 2.73 g/dL and 2.80 mmol/L respectively. The content of soluble solids of pickles with 4% salt concentration is the highest of 11.05%. The three kinds of pickles with different salt concentrations are evaluated at different time， and it is found that the pickle products fermented for 30 days with 4% salt concentration have the best evaluation.The results of bacterial diversity analysis show that Lactobacillus （10.09%） and Leuconostoc （4.29%） are the dominant microflora.

Key words： low salt; pickle; sensory evaluation; optimization of production process

收稿日期：2022-12-24

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC0311100）；遼寧省自然科學(xué)基金（2014020134）

作者簡介：劉禎珍（1999－），女，碩士研究生，研究方向：微生物與發(fā)酵工程。

*通信作者：張慶芳（1965－），女，教授，博士，研究方向：微生物資源開發(fā)與利用。

我國泡菜歷史悠久，具有“爽、脆、咸、鮮”的特色。其以蔬菜為原料，利用微生物在高鹽鹵水中進(jìn)行厭氧或兼性厭氧發(fā)酵而成，成品中含有豐富的有機(jī)酸、維生素、膳食纖維、氨基酸及益生菌[1]。

有研究表明[2-3]，泡菜含有大量的乳酸菌，乳酸菌發(fā)酵除了可將原料中的糖類、蛋白質(zhì)、脂肪等大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)變成更易吸收的小分子物質(zhì)如氨基酸和脂肪肽以外，還可合成多種維生素來提高泡菜中的有效營養(yǎng)成分。適當(dāng)食用泡菜不但能補(bǔ)充人體多種膳食纖維和微量元素，而且能有效改善機(jī)體胃腸道功能，預(yù)防膽固醇等多種疾病[4]。在泡菜加工過程中，影響泡菜品質(zhì)的因素眾多。大多數(shù)學(xué)者對(duì)泡菜發(fā)酵工藝的研究主要集中在發(fā)酵菌種的選擇和配比、溫度、配方和香辛料等方面，但隨著研究的進(jìn)行，鹽作為發(fā)酵蔬菜中必備的原料，其對(duì)泡菜品質(zhì)的影響逐漸受到學(xué)者們的關(guān)注[5-10]。傳統(tǒng)泡菜腌漬多使用高鹽食鹽水（10%～20%），如處理不當(dāng)不但在后期處理時(shí)會(huì)給環(huán)境帶來極大負(fù)擔(dān)，而且人體過多攝入鹽分還會(huì)造成高血壓、腎功能受損等不良后果[11]。歐雪等[12]探究了不同鹽濃度（2%、5%、8%）對(duì)接種蘿卜泡菜的影響，發(fā)現(xiàn)鹽濃度越高，泡菜的硬度和脆度降低速率越緩慢，鹽度過低會(huì)導(dǎo)致泡菜酸軟。Xiong等[13]探究了鹽濃度對(duì)中國傳統(tǒng)酸菜發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前期鹽濃度的影響較大，鹽濃度過高會(huì)抑制乳酸菌繁殖代謝，延緩酸菜的成熟進(jìn)程。因此，探究泡菜的食鹽添加量對(duì)優(yōu)化泡菜工藝、提高泡菜品質(zhì)具有重要意義。除此之外，現(xiàn)在泡菜多是家庭作坊式生產(chǎn)，腌制手法不當(dāng)易導(dǎo)致亞硝酸鹽含量超標(biāo)。亞硝酸鹽作為一級(jí)致癌物亞硝胺的前體物質(zhì)，攝入過量會(huì)導(dǎo)致機(jī)體患癌概率增高[14]。

為探究低鹽泡菜的最佳制作工藝，本實(shí)驗(yàn)利用自然發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵混合型泡菜，探究不同低鹽濃度泡菜的pH、總酸、可溶性固形物、還原糖、亞硝酸鹽等多項(xiàng)理化指標(biāo)的變化趨勢，再結(jié)合感官評(píng)價(jià)評(píng)判泡菜產(chǎn)品的品質(zhì)，并利用高通量技術(shù)對(duì)其進(jìn)行微生物菌群分析，以期為泡菜腌制過程中鹽濃度的選擇以及泡菜產(chǎn)品品質(zhì)的改良提供理論參考，為符合人們健康飲食理念的低鹽泡菜提供了相應(yīng)的理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

圓白菜、白蘿卜、胡蘿卜、黃瓜、地環(huán)、洋姜、食鹽（氯化鈉）：市售。

1.2 試劑

亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀、硼酸鈉、氫氧化鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鹽（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid， DNS）、氯化鈉、四水酒石酸鉀鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

PH828 pH計(jì) 希瑪儀器儀表有限公司；BioTek Synergy HTX多功能酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；TD10WZS手持式折射儀 研朗科學(xué)儀器（上海）有限公司；DW-86L500 －86 ℃超低溫冷柜 澳柯瑪（AUCMA）股份有限公司；電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.4 方法

1.4.1 低鹽泡菜的制作工藝

取無機(jī)械性損壞、無蟲咬等的新鮮蔬菜，用無菌水沖洗，晾干后切成2～3 cm的小塊放于滅菌后的泡菜壇子中，按0%、2%、4% 3種低鹽濃度分別加入食鹽，放置于室溫（＜20 ℃）下發(fā)酵，每天取15 mL發(fā)酵液進(jìn)行分析，連續(xù)取樣9 d，取樣時(shí)先將泡菜輕輕搖勻，對(duì)樣品進(jìn)行理化指標(biāo)檢測并存樣于－80 ℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 理化指標(biāo)分析檢測

pH值的測定：從泡菜壇子底部取汁，用紗布過濾后，用pH計(jì)測量濾液；可溶性固形物含量的測定：從泡菜壇子底部取汁，采用手持式折射儀測定；亞硝酸鹽含量的測定：按國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.33－2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》測定；總酸含量的測定：按國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 12456－2008《食品中總酸的測定》測定；還原糖含量的測定：按國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.7－2008《食品中還原糖的測定》測定。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4.3 感官評(píng)價(jià)

按照《中國泡菜的品質(zhì)評(píng)定與標(biāo)準(zhǔn)探討》[15]制定低鹽泡菜的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1，各項(xiàng)目滿分共計(jì)200分。

1.4.4 微生物菌群分析

本實(shí)驗(yàn)無菌過濾出低鹽泡菜樣品干物質(zhì)60 g，再加入15 mL發(fā)酵液打成勻漿過濾，參照基因組試劑盒方法提取勻漿中DNA。以細(xì)菌16S rRNA的V4區(qū)域作為目標(biāo)DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢測擴(kuò)增效果。最后將檢測合格的樣品PCR產(chǎn)物送至北京諾禾致源科技股份有限公司，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化，形成測序文庫并用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測序。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照，數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值。采用Excel 2010處理數(shù)據(jù)；采用Origin 2018繪圖。

測序結(jié)果分析：采用GenBank 數(shù)據(jù)庫（核酸序列數(shù)據(jù)庫）、BLAST（序列局部比對(duì)工具）、Clustal X1.83（多序列比對(duì)工具）進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽濃度對(duì)pH和總酸的影響

由圖1中a可知，發(fā)酵起始，0%、2%、4% 3種不同鹽濃度發(fā)酵液的pH值均在6.6左右；發(fā)酵前期，pH急劇下降，第3天發(fā)酵液的pH分別達(dá)到4.44，4.65，4.86；發(fā)酵中后期，發(fā)酵液的pH值下降趨勢減緩，在第9天均達(dá)到3.6左右。0%、2%、4% 3種不同鹽濃度中，食鹽濃度越低，泡菜發(fā)酵液的pH值下降速度越快，但最終pH值差距不大。由圖1中b可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷增加，總酸含量在發(fā)酵前中期迅速上升（未加鹽組高于另外兩組），第7天后開始趨于穩(wěn)定。發(fā)酵起始，3組總酸含量均為0.25 g/dL，其中未加鹽組發(fā)酵液的總酸含量上升趨勢最快，第5天達(dá)到1.8 g/dL，第9天達(dá)到2.5 g/dL，遠(yuǎn)高于其他兩組。而2%、4%鹽濃度的發(fā)酵液總酸含量在第9天分別達(dá)到1.42 g/dL和0.83 g/dL。

通常乳酸菌在發(fā)酵前期大量繁殖代謝有機(jī)酸，pH急劇下降，當(dāng)發(fā)酵液的pH值降低到一定程度后又會(huì)抑制乳酸菌的代謝繁殖，pH趨于平緩。發(fā)酵前期，0%鹽濃度的發(fā)酵液與2%、4%鹽濃度的發(fā)酵液相比，pH值下降速率和總酸含量上升速率較快，這可能與滲透壓相關(guān)。大多數(shù)微生物細(xì)胞的滲透壓為30.17～61.15 kN/m2，1%食鹽溶液的滲透壓大約在61.17 kN/m2，與微生物細(xì)胞的滲透壓相近。因此，0%鹽濃度的發(fā)酵液無法借助溶液滲透壓來抑制微生物的生長代謝；而2%鹽濃度所產(chǎn)生的滲透壓可能略高于微生物細(xì)胞的滲透壓，該鹽濃度溶液滲透壓可以一定程度抑制微生物的生長繁殖和產(chǎn)酸；4%鹽濃度所產(chǎn)生的滲透壓略高于2%鹽濃度的滲透壓，抑菌效果也好于2%鹽濃度。申文熹等[9]研究發(fā)現(xiàn)，較高鹽濃度會(huì)抑制部分乳酸菌如乳酸乳球菌和明串珠菌的生長代謝，減緩pH和總酸的變化趨勢。值得注意的是，這兩種菌是泡菜發(fā)酵過程中的重要菌種。發(fā)酵中后期，乳酸菌代謝乳酸等多種弱酸性物質(zhì)使發(fā)酵液呈酸性，抑制有害微生物的生長，維持微生物菌落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。隨著溶液中pH值下降到4.0，不耐酸的異型乳酸菌逐漸被高耐酸、產(chǎn)酸能力強(qiáng)的同型乳酸菌所替代，3種不同鹽濃度的泡菜總酸含量迅速增加，但較高鹽濃度會(huì)影響乳酸菌的同型發(fā)酵，總酸含量始終與鹽濃度成反比。歐雪等[12]在探究不同鹽濃度（2%、5%、8%）接種蘿卜泡菜的有機(jī)酸含量中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中2%鹽濃度組的乳酸、乙酸和蘋果酸含量遠(yuǎn)高于其他兩組，這也證實(shí)了微生物代謝會(huì)受到鹽濃度的影響。

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)發(fā)酵過程中測得的pH值和總酸變化趨勢推測，一定鹽濃度范圍內(nèi)，鹽濃度越低，pH下降速率和總酸含量上升速率越快，高鹽濃度可能會(huì)抑制乳酸菌的生長代謝，與低鹽濃度相比，pH值更高，總酸生成量更低，泡菜鹽水的鹽濃度與總酸含量呈顯著的負(fù)相關(guān)，這一推測和曹佳璐[16]的研究相佐證。

2.2 不同鹽濃度對(duì)還原糖和可溶性固形物的影響

由圖2中a可知，3組發(fā)酵液的還原糖含量隨時(shí)間增加的趨勢明顯。發(fā)酵初期，所有發(fā)酵液中的還原糖含量較高，分別為22.33，14.20，8.80 g/L，從第2天開始，3組還原糖含量急劇下降，第4天后開始上下浮動(dòng)但整體呈下降趨勢，除第9天外，發(fā)酵過程中未加鹽組的還原糖含量始終高于其他兩組，第9天3組發(fā)酵液的還原糖含量基本都穩(wěn)定在2.40 g/L左右。由圖2中b可知，3組發(fā)酵液中可溶性固形物含量差異顯著但整體呈上升趨勢。其中4%鹽濃度的發(fā)酵液可溶性固形物含量高，為4.5%，上升趨勢最快，第8天達(dá)到11.05%，2%鹽濃度次之，0%鹽濃度最慢。發(fā)酵初始，0%和2%鹽濃度的發(fā)酵液中可溶性固形物含量相差不大，在2.05%左右。發(fā)酵過程中2%鹽濃度發(fā)酵液中可溶性固形物含量在第2天上升趨勢明顯，可達(dá)4.18%，后期趨勢平緩，第8天達(dá)到5.82%；未加鹽組發(fā)酵液中可溶性固形物含量上升趨勢最平緩，第8天僅達(dá)2.71%。

發(fā)酵前期，可溶性固形物含量受鹽濃度的影響很大。鹽濃度改變引起鹵水滲透壓和泡菜內(nèi)部水分活度的變化：鹽度越高，泡菜內(nèi)部水分活度越低，溶液中所含析出物質(zhì)越多，原料自帶微生物所能利用的物質(zhì)也越多。根據(jù)蔬菜種類和品種的不同，所含維生素、氨基酸、糖類、微量元素、膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì)和自帶微生物都有所差別。發(fā)酵過程中糖類變化受諸多因素的影響：蔗糖可被腸膜明串珠菌中葡萄糖蔗糖酶和細(xì)菌或真菌中蔗糖水解酶水解成葡萄糖和果糖；葡萄糖作為微生物最常利用的還原糖，可通過己糖發(fā)酵途徑生成乳酸、乙酸、乙醇和二氧化碳等多種物質(zhì)，而果糖在果糖激酶或甘露醇脫氫酶的作用下被轉(zhuǎn)化成己酸、乙酸等多種物質(zhì)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)酵前期，發(fā)酵液的菌群豐度和物種豐度較低，原料中析出的還原糖量和生成的還原糖量之和大于消耗量，發(fā)酵液中還原糖含量上升；但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，微生物大量繁殖，糖類消耗迅速，還原糖生成量遠(yuǎn)小于消耗量，發(fā)酵液中還原糖含量下降，第4天還原糖含量達(dá)到最低值；之后3組發(fā)酵液的酸度持續(xù)上升，霉菌、酵母菌等不耐酸微生物死亡，菌群開始演替，發(fā)酵液中還原糖含量也開始波動(dòng)；隨著耐酸性微生物如植物乳桿菌占據(jù)主導(dǎo)地位，菌群結(jié)構(gòu)變得穩(wěn)定，此外，乳酸菌代謝的乳酸等有機(jī)酸在發(fā)酵液中累積到一定程度后可能會(huì)反向抑制菌群代謝，進(jìn)而導(dǎo)致蔗糖利用減慢，發(fā)酵液中還原糖含量最終趨于平穩(wěn)。

2.3 不同鹽濃度對(duì)亞硝酸鹽的影響

由圖3可知，發(fā)酵初期，0%、2%、4%鹽濃度的發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量不斷上升，起始含量分別為0.83，0.25，1.5 mg/L，分別在第7，4，4天達(dá)到亞硝峰（9.14，6.96，8.29 mg/L）。發(fā)酵前期，未加鹽組泡菜的亞硝酸鹽含量較低，發(fā)酵第3天開始急劇上升，第7天達(dá)到亞硝峰（9.14 mg/L），后期始終維持在一個(gè)較高水平，第9天亞硝酸鹽含量為5.73 mg/L；2%鹽濃度組泡菜整體亞硝酸鹽含量偏低，第4天達(dá)到亞硝峰（6.96 mg/L）后開始下降，最終達(dá)到1.5 mg/L；4%鹽濃度的泡菜前期亞硝酸鹽含量高，第4天開始迅速下降，第7天開始略有波動(dòng)，最終達(dá)到5 mg/L左右。我國GB 2762－2005《食品中污染物限量》中明文規(guī)定蔬菜及其制品腌漬蔬菜中所含亞硝酸鹽的限量不得超過20 mg/kg，因此，3組實(shí)驗(yàn)中亞硝酸鹽含量均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

亞硝酸鹽和硝酸鹽之間可以相互轉(zhuǎn)化。大多有關(guān)蔬菜腌制的研究[17-18]都發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了蔬菜腌制時(shí)期硝酸鹽含量持續(xù)下降到較低水平，亞硝酸鹽含量逐漸上升達(dá)到亞硝酸鹽峰值后開始下降這一規(guī)律。硝酸鹽作為自然界中最普遍存在的含氮化合物，可被植物儲(chǔ)存在體內(nèi)。泡菜自然發(fā)酵初期，pH值較高，乳酸菌等尚未成為優(yōu)勢菌群，腸桿菌、酵母菌等有害菌群此時(shí)占據(jù)優(yōu)勢，其中大腸桿菌、白喉棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌和黏質(zhì)賽氏桿菌等革蘭氏陰性好氧菌產(chǎn)生的硝酸還原酶都會(huì)導(dǎo)致大量亞硝酸鹽產(chǎn)生[19]。攝入過多亞硝酸鹽可能會(huì)引發(fā)高鐵血紅蛋白癥，嚴(yán)重引起消化系統(tǒng)癌變。目前降解亞硝酸鹽主要為微生物降解和酸降解：發(fā)酵液pH>4.5時(shí)，亞硝酸鹽降解主要依靠植物乳桿菌、短乳桿菌、干酪乳桿菌鼠李糖亞種等[20-22]乳酸菌分泌的亞硝酸還原酶；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳酸菌大量代謝乳酸，pH降到4.0以下以酸降解為主。

此外，食用過程中部分硝酸鹽會(huì)被人體消化道中的硝酸還原菌轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽[23]。食物發(fā)酵時(shí)硝酸鹽轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽越多，人體消化道細(xì)菌可利用硝酸鹽越少，生成的亞硝酸鹽越少，因此在發(fā)酵過程中盡可能將硝酸鹽轉(zhuǎn)為亞硝酸鹽后再降解，可能更有利于人體安全。

2.4 感官評(píng)價(jià)

隨機(jī)選擇10位食品專業(yè)同學(xué)進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)后組成感官評(píng)定小組對(duì)9種不同鹽濃度、不同發(fā)酵時(shí)間的泡菜進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，對(duì)得到的感官數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并從中選出評(píng)分較高的產(chǎn)品，評(píng)定結(jié)果見圖4。

由圖4和表2可知，發(fā)酵10 d的泡菜普遍評(píng)價(jià)不高，特別是滋味，但4%鹽濃度的泡菜整體表現(xiàn)優(yōu)于其他兩種鹽濃度。發(fā)酵20 d時(shí)，不同鹽濃度的泡菜各項(xiàng)指標(biāo)差異不大，但4%鹽濃度的泡菜略遜一籌。發(fā)酵30 d后，不同鹽濃度的感官評(píng)價(jià)出現(xiàn)較大差異，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，顏色評(píng)價(jià)整體下降，但是其余3項(xiàng)評(píng)價(jià)均有所提升，其中4%鹽濃度的泡菜整體評(píng)分最佳，2%鹽濃度的泡菜整體評(píng)分和4%鹽濃度的泡菜相近。

上述感官評(píng)分表明，發(fā)酵30 d、4%的泡菜和發(fā)酵30 d、2%的泡菜差異不顯著。為在這二者之間選出最優(yōu)產(chǎn)品，采取隨機(jī)抽樣調(diào)查。

由圖5可知，選擇4%鹽濃度泡菜產(chǎn)品的人數(shù)最多，總占比達(dá)到63.34%，與2%鹽濃度相比明顯更受歡迎，最終確定發(fā)酵30 d、4%鹽濃度的泡菜為終產(chǎn)品。

2.5 低鹽泡菜微生物菌群分析

蔬菜發(fā)酵過程中理化指標(biāo)尤其是亞硝酸鹽的變化可能受到微生物的影響，而不同品種和不同產(chǎn)地的蔬菜本身自帶的微生物種類和數(shù)量也有所差別[24-25]。利用Illumina HiSeq 2500技術(shù)對(duì)發(fā)酵30 d、4%鹽濃度的泡菜（P1）進(jìn)行16S rRNA測序。結(jié)果顯示，低鹽泡菜（P1）的原始細(xì)菌總序列為106 745條，去冗雜和優(yōu)化數(shù)據(jù)后，最終總堿基數(shù)目為40 131 997 bp，序列總數(shù)為96 991條，平均長度為414 bp。

由表3可知，P1經(jīng)過16S rRNA測序分析后，該產(chǎn)品已知分類細(xì)菌可歸屬到7個(gè)門、11個(gè)綱、23個(gè)目、38個(gè)科、58個(gè)屬、157個(gè)種。

2.6 基于門水平低鹽泡菜中的微生物群落

由圖6可知，在門水平上，P1物種相對(duì)豐度大于0.1%的已知分類細(xì)菌門有藍(lán)藻門（Cyanobacteria，55.80%）、變形菌門（Proteobacteria，29.53%）、厚壁菌門（Firmicutes，15.78%）。其中Cyanobacteria在門水平菌群中占據(jù)了絕對(duì)優(yōu)勢。錢楊等[26]對(duì)不同原料發(fā)酵的四川傳統(tǒng)泡菜的微生物多樣性解析發(fā)現(xiàn)，4種泡菜中主要門水平是厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門，但原料不同會(huì)導(dǎo)致同種微生物的相對(duì)豐度存在差異，這可能是與本研究存在一定差異的原因。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)[27]，藍(lán)藻細(xì)菌與葉綠體有較近的親緣關(guān)系，葉綠體中有多種類型藍(lán)藻細(xì)菌的部分基因組?；诖?，推測P1中出現(xiàn)的藍(lán)藻門細(xì)菌有以下兩種原因：一是可能低鹽泡菜的鹽濃度過低，無法很好抑制雜菌生長；二是因?yàn)闃悠芳尤肓诉^多的蔬菜，從而受到了蔬菜宿主基因組污染。

閆鳴霄等[28]分析探討了泡菜發(fā)酵中影響大腸桿菌生長的因素，發(fā)現(xiàn)在一定鹽濃度范圍（1%～6%）內(nèi)，高鹽、高蒜濃度、低pH的發(fā)酵環(huán)境可以有效抑制大腸桿菌生長，這基本與本研究的發(fā)酵環(huán)境相同。查找P1藍(lán)藻綱的相應(yīng)基因序列并與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了BLAST比對(duì)佐證。通過Clustal X1.83軟件進(jìn)行多序列對(duì)比，結(jié)果見圖7。其中P1所含大部分藍(lán)藻基因與NCBI中葉綠體基因（NC_046879）相似度極高，最高可達(dá)100%?；谝陨辖Y(jié)果，推測可能是P1受到了宿主（混合蔬菜）基因組污染。因此，提取宿主中微生物DNA時(shí)如何有效避免宿主基因組干擾，是今后需攻克的難題。

2.7 基于屬水平低鹽泡菜中的微生物群落

由圖8可知，在屬水平上，P1中相對(duì)豐度大于0.1%的已知分類細(xì)菌屬有葉綠體（Chloroplast，53.80%）、線粒體（Mitochondria，10.73%）、其他（Others，10.10%）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus，10.09%）、果膠桿菌屬（Pectobacterium，4.42%）、明串珠菌屬（Leuconostoc，4.29%）、沙雷氏菌屬（Serratia，1.31%）、腸桿菌屬（Enterobacter，1.16%）、乳球菌屬（Lactococcus，1.02%）。

陳佩等[8]研究發(fā)現(xiàn)漢中地區(qū)泡菜水中細(xì)菌大多隸屬于乳酸菌，平均含量>85%，產(chǎn)生差異的原因可能是本研究樣本選取的主要成分是泡菜干物質(zhì)。此外，結(jié)果表明，P1在屬水平上沒有相應(yīng)藍(lán)藻細(xì)菌屬，取而代之的是葉綠體（Chloroplast），這佐證了筆者的推論，證實(shí)了終產(chǎn)品中藍(lán)藻門細(xì)菌確實(shí)是葉綠體，這也和趙玲艷等[29]的推測相吻合。

3 結(jié)論

本研究對(duì)3種不同低鹽混合型自然發(fā)酵泡菜發(fā)酵過程中理化指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測，推測發(fā)酵前期蔬菜表面附著的微生物以蔬菜為原料進(jìn)行發(fā)酵，需氧型微生物為主導(dǎo)消耗其中的還原糖和含氮化合物，亞硝酸鹽逐步上升并在第4，5天達(dá)到亞硝峰。隨著容器中氧氣的消耗，兼性厭氧和厭氧乳酸菌逐漸占據(jù)上風(fēng)并且開始產(chǎn)生乳酸，亞硝酸鹽被乳酸菌等微生物和酸分解，含量下降最后趨于穩(wěn)定，且低于國家標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合模糊感官評(píng)價(jià)，確定發(fā)酵30 d、4%鹽濃度的自然發(fā)酵泡菜發(fā)酵制備工藝最佳。本研究對(duì)發(fā)酵30 d、4%鹽濃度的低鹽泡菜進(jìn)行16S rRNA分析，發(fā)現(xiàn)乳酸菌屬（Lactobacillus）占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢，證實(shí)了低鹽泡菜開發(fā)的可行性。后續(xù)本課題組將繼續(xù)探究不同低鹽濃度混合型泡菜的風(fēng)味物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，為之后開發(fā)新型低鹽風(fēng)味泡菜奠定了理論研究和小試基礎(chǔ)。

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