王琳娜,王靜

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266071; 2 山東省慢性病醫(yī)院(山東省康復(fù)中心)檢驗(yàn)科)

肺癌是臨床上發(fā)病率最高的癌癥之一,也是全球范圍內(nèi)惡性腫瘤死亡的常見原因之一[1]。非小細(xì)胞肺癌是肺癌中最常見的病理類型,其早期診斷具有一定的難度,且5年生存率較低[2]。肺癌發(fā)病早期多無典型臨床表現(xiàn),一經(jīng)發(fā)現(xiàn)往往已經(jīng)發(fā)展至中晚期,預(yù)后不佳。外泌體天然存在于人體體液中,其成分中含有mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)等能夠攜帶重要生物信息的分子,腫瘤源性或腫瘤相關(guān)的外泌體含有豐富的生物成分,可作為信號信使參與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中細(xì)胞間通訊,是調(diào)節(jié)微環(huán)境的重要遞質(zhì)[3]。由于這些外泌體可以從各種體液中分離出并檢測到,已成為腫瘤診斷和預(yù)后有潛力的新的生物標(biāo)記物。miRNA是一種非編碼小分子RNA,可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡,在腫瘤的診斷、預(yù)后和治療中發(fā)揮重要作用[4]。外泌體中的miRNA-486-3p在很多惡性腫瘤中均呈現(xiàn)異常表達(dá),如肝癌、胰腺癌、肺癌或胰腺癌等[5]。本研究通過檢測并分析非小細(xì)胞肺癌病人和健康體檢者血清外泌體miR-486-3p表達(dá)水平差異,探究血清外泌體miR-486-3p對非小細(xì)胞肺癌的早期診斷價(jià)值?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2018年10月—2020年9月,選取本院收治的非小細(xì)胞肺癌病人120例為觀察組,以同期本院體檢的健康志愿者120例為對照組。觀察組男93例,女27例;年齡40～79歲,平均(59.87±10.39)歲。病人納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)影像學(xué)及病理檢查確診為非小細(xì)胞肺癌;②意識清楚,無精神系統(tǒng)疾病,認(rèn)知正常,能夠通過語言或行為與他人正常交流。排除標(biāo)準(zhǔn):①肝腎功能嚴(yán)重不全者;②免疫系統(tǒng)疾病病人;③合并其他惡性腫瘤者;④除肺部以外其他惡性腫瘤病人。對照組男95例,女25例;年齡38～80歲,平均(60.34±11.27)歲。所有對照組受試者影像學(xué)檢查、實(shí)驗(yàn)室檢測均未見明顯異常;意識清醒,無精神系統(tǒng)疾病。所有研究對象知情同意且研究通過本院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 檢測指標(biāo)及方法

采集兩組受試者空腹靜脈血5 mL,以4 000 r/min離心15 min,獲取血清,應(yīng)用Auto 2000發(fā)光儀(美國,SBI公司)檢測血清中癌胚抗原(CEA)、糖類抗原125(CA125)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)及細(xì)胞角蛋白抗原片段21-1(CYFRA21-1)水平。應(yīng)用Exo Quick-TM試劑(美國,SBI公司)提取血清外泌體,按照試劑說明書操作。用磷鎢酸溶液染色法染色后,透射電鏡(Olympus)觀察外泌體顆粒形態(tài),納米顆粒跟蹤分析(NTA)技術(shù)測定外泌體粒徑大小。應(yīng)用Western blot法檢測外泌體表面蛋白標(biāo)志物CD81和TSG101表達(dá),實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測miR-486-3p水平。收集受試者一般資料,對病人手術(shù)后腫瘤組織病理學(xué)、腫瘤病灶最大直徑等進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 血清外泌體的鑒定

透射電鏡觀察顯示,外泌體具有脂質(zhì)雙層囊泡結(jié)構(gòu)(圖1);NTA 技術(shù)觀察結(jié)果顯示,外泌體顆粒直徑呈單峰正態(tài)分布,峰值處顆粒直徑約為 90 nm,顆粒主要分布于20～300 nm(圖2)。Western blot檢測顯示,外泌體表達(dá)CD81和TSG101表面標(biāo)志蛋白(圖3)。

圖2 NTA 檢測外泌體顆粒的直徑分布

圖3 Western blot方法檢測外泌體表面標(biāo)志蛋白 CD81以及TSG101表達(dá)

2.2 兩組血清檢測指標(biāo)比較

觀察組血清CEA、CA125、NSE和CYFRA21-1水平均高于對照組(t=10.701～31.406,P<0.01),觀察組血清外泌體miR-486-3p水平顯著低于對照組(t=17.155,P<0.01)。見表1和圖4。

表1 兩組間血清檢測指標(biāo)比較

圖4 兩組miR-486-3p表達(dá)比較

2.3 不同病理特征非小細(xì)胞肺癌miR-486-3p表達(dá)比較

觀察組高齡、男性、有淋巴轉(zhuǎn)移性病灶及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期病人的miR-486-3p表達(dá)水平均低于中青年、女性、無淋巴轉(zhuǎn)移性病灶及TNM分期Ⅰ～Ⅱ期病人(t=8.168～19.658,P<0.05),而組織學(xué)診斷差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同病理特征非小細(xì)胞肺癌miR-486-3p表達(dá)比較

2.4 miR-486-3p對非小細(xì)胞肺癌的診斷效能評估

ROC曲線分析顯示,血清外泌體miR-486-3p診斷非小細(xì)胞肺癌的曲線下面積(AUC)為0.781,95%置信區(qū)間(CI)為0.724～0.839,診斷的靈敏度為51.67%,特異度為98.33%,最佳界值為0.945(圖5)。

圖5 miR-486-3p表達(dá)診斷非小細(xì)胞肺癌的ROC曲線

3 討 論

肺癌在臨床上發(fā)病率較高,其病死率居惡性腫瘤首位,其中非小細(xì)胞肺癌病人占80%以上[6]。很多病人在明確診斷時(shí)往往已經(jīng)發(fā)展至中晚期,若早期明確診斷,采取手術(shù)等措施綜合治療,5年生存率能夠顯著提高[7]。CEA、CA125、NSE、CYFRA21-1等腫瘤標(biāo)志物是常見的肺癌篩查指標(biāo),但其靈敏度、特異度均較低,無法滿足臨床需求[8]。低劑量螺旋CT具有發(fā)現(xiàn)早期病灶的能力,但卻容易引起醫(yī)生對疾病的誤判,導(dǎo)致進(jìn)行一些不必要的治療;另外,頻繁的CT檢查也對病人的健康不利[9]。其他檢查,如支氣管病理活檢,屬于有創(chuàng)檢查,病人接受難度較高,對于早期非小細(xì)胞肺癌病人的診斷價(jià)值比較有限。因此,尋找特異度及靈敏度更高的檢測方法是肺癌篩查的目標(biāo)。

外泌體的本質(zhì)是一種細(xì)胞外囊泡,其體積較小,直徑通常介于20～300 nm范圍內(nèi),它們主要由細(xì)胞分泌產(chǎn)生,并通過胞吐的方式釋放進(jìn)入各種體液,外泌體可在血液、尿液、汗液以及腦脊液等多種體液中存在[10]。Exocarta數(shù)據(jù)庫顯示,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的外泌體超過萬種,在各種外泌體中,其組成成分包括蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA以及脂質(zhì)[11]。這些成分是體內(nèi)新陳代謝的重要物質(zhì),參與體內(nèi)的物質(zhì)交換,因此它們在腫瘤發(fā)生的早期即可出現(xiàn)一定的變化,對腫瘤早期診斷以及治療后病情的評估都有著重要的意義,已成為腫瘤血清生物標(biāo)記研究的熱點(diǎn)[12]。

本文研究主要檢測血清外泌體中的miRNA。miRNA屬于非編碼RNA,能夠通過mRNA的靶向互補(bǔ)作用而達(dá)成對基因表達(dá)的調(diào)控作用。目前研究認(rèn)為,miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過程中有一定的臨床作用,這也是癌癥治療中的新思路。有研究表明,miRNA在惡性腫瘤病人體內(nèi)多呈異常表達(dá),與多種惡性腫瘤病人的預(yù)后關(guān)系密切,具有一定的早期診斷價(jià)值。本文結(jié)果顯示,觀察組血清CEA、CA125、NSE、CYFRA21-1的水平均高于對照組,而血清外泌體miR-486-3p水平低于對照組,提示檢測腫瘤標(biāo)志物能一定程度篩選出肺癌病人。

TNM是分析肺癌的病理類型、浸潤程度等方面的常用分型方式。本文研究結(jié)果顯示,觀察組高齡、男性、有淋巴轉(zhuǎn)移性病灶及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期病人的miR-486-3p表達(dá)水平均低于中青年、女性、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴轉(zhuǎn)移性病灶者。提示腫瘤細(xì)胞惡化程度越高,miR-486-3p表達(dá)水平可能越低。

綜上所述,非小細(xì)胞肺癌在肺癌中比較常見,預(yù)后較差,早期診斷并及時(shí)予以治療措施,能夠延長病人生存時(shí)間。血清外泌體miR-486-3p屬于常見抑癌miRNA,在非小細(xì)胞肺癌中呈現(xiàn)低水平表達(dá),且非小細(xì)胞肺癌病人惡化程度越高,血清外泌體miR-486-3p表達(dá)水平越低,二者之間呈負(fù)相關(guān),提示血清外泌體miR-486-3p對非小細(xì)胞肺癌具有一定的早期診斷價(jià)值。外泌體miRNA是外泌體的重要組成部分,在機(jī)體免疫、疾病進(jìn)展,尤其是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、變化中都有參與。但是目前,臨床上對于外泌體的研究還處于基礎(chǔ)階段,在理論體系方面尚不完善,并且在科研投入和技術(shù)支持方面都存在一定的欠缺,有待進(jìn)一步深入。外泌體中的很多組成部分均有望成為疾病的無創(chuàng)生物標(biāo)志物,為疾病的早期發(fā)現(xiàn)、預(yù)后評估提供可靠的臨床依據(jù)。