尹建行，賀春萍，梁艷瓊，李銳，張營(yíng),3

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 ?？?571101；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

橡膠樹(shù)“兩病”是橡膠樹(shù)炭疽病和白粉病的合稱(chēng)，兩種病害?；旌习l(fā)生，是影響橡膠干膠產(chǎn)量的主要病害，給我國(guó)天然橡膠產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重影響[1]。目前防治橡膠樹(shù)“兩病”的主要手段為化學(xué)防治，但因橡膠樹(shù)樹(shù)體高大導(dǎo)致施藥器械缺乏、化學(xué)藥劑用量大及藥劑殘留造成生態(tài)環(huán)境污染等問(wèn)題，因此，亟待開(kāi)發(fā)安全性高、效果好的新型藥劑。

利用生防菌和化學(xué)殺菌劑聯(lián)合防治植物病害能夠使生防和化防形成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，既能減少化學(xué)藥劑的使用量[2]，減緩病原菌抗藥性的產(chǎn)生和對(duì)環(huán)境的污染[3]，又能促進(jìn)生防菌的定殖和生防效果的穩(wěn)定性[4-6]，并且有些生防菌和化學(xué)殺菌劑還能相互促進(jìn)，產(chǎn)生增效作用[7-9]。劉郵洲等[10]研究表明枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）sf628 與咪鮮胺錳鹽復(fù)配對(duì)番茄枯萎病防效為75.95%~79.41%。張艷麗[11]研究發(fā)現(xiàn)生防木霉菌（Trichoderma spp.）與化學(xué)殺菌劑復(fù)配對(duì)辣椒疫病的田間防效顯著優(yōu)于單施化學(xué)殺菌劑，而且能夠減少25%~32%雙炔酰菌胺和10%丁子香酚的使用量。楊秀榮等[12]研究表明，生防菌B579 與多菌靈復(fù)配對(duì)蔬菜苗期立枯病有較好防效。尹敬芳[13]探究表明生防細(xì)菌BS 與烯酰嗎啉可協(xié)同抑制辣椒疫霉病，減量50%的烯酰嗎啉與BS 復(fù)配后的防治效果和烯酰嗎啉單劑相當(dāng)，并且還具有增效作用。以上研究表明，菌藥協(xié)同防治植物病害具有較好的應(yīng)用前景。

目前對(duì)于橡膠樹(shù)“兩病”在生物防治和菌藥協(xié)同方面開(kāi)展的研究較少，本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)室內(nèi)毒力測(cè)定和盆栽試驗(yàn)表明，枯草芽孢桿菌Czk1 與化學(xué)藥劑25%丙環(huán)唑 戊唑醇、25%咪鮮胺復(fù)配后，對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病菌具有較好抑制作用，并篩選出了防治橡膠樹(shù)炭疽病的最佳復(fù)配組合。在此基礎(chǔ)上，本研究開(kāi)展菌藥最佳復(fù)配組合對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病和白粉病的田間防治試驗(yàn)，測(cè)定菌藥復(fù)配劑對(duì)橡膠樹(shù)“兩病”的防治效果，探討復(fù)配劑有無(wú)增效作用。以期為開(kāi)發(fā)安全、高效的橡膠樹(shù)炭疽病和白粉病的菌藥復(fù)配使用技術(shù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

生防菌枯草芽孢桿菌Czk1 由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所熱帶特色經(jīng)濟(jì)作物病害實(shí)驗(yàn)室4℃低溫保藏；LB 液體培養(yǎng)基參照謝立等[14]方法；化學(xué)殺菌劑詳情見(jiàn)表1；ZWYR-D2403 型恒溫培養(yǎng)振蕩器購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司；3WF-3 型背負(fù)式噴霧噴粉機(jī)購(gòu)自山東華盛中天機(jī)械集團(tuán)；TSB-35（W）熱力煙霧機(jī)購(gòu)自深圳市隆瑞科技有限公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自德國(guó)耶拿分析儀器股份公司。

表1 3 種化學(xué)殺菌劑Table 1 3 kinds of chemical fungicides

1.2 生防菌液的制備

用無(wú)菌牙簽挑取在LB 固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)好的Czk1 菌株的單菌落，接入LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，180 r/min 條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)12 h 即為生防菌Czk1菌液原液（OD600=2.137，菌液濃度=4.07 108cfu/mL）。

1.3 田間防效測(cè)定

試驗(yàn)地點(diǎn)在海南省儋州市中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場(chǎng)7 隊(duì)，供試橡膠品種熱研7-33-97，橡膠種植年限4 年，田間驗(yàn)證25%丙環(huán)唑 戊唑醇、25%咪鮮胺和Czk1 單用和/或復(fù)配對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病和白粉病的防治效果。復(fù)配劑各濃度按照體積比Czk1:25%丙環(huán)唑 戊唑醇為7:3 或Czk1:25%咪鮮胺為8:2 配制[15]。試驗(yàn)隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)4 次重復(fù)，每小區(qū)10 株橡膠樹(shù)。試驗(yàn)處理：（1）Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復(fù)配劑高濃度（Czk1菌液50 倍液+25%丙環(huán)唑 戊唑醇200 倍液）；（2）Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復(fù)配劑中濃度（Czk1 菌液100倍液+25%丙環(huán)唑 戊唑醇500倍液）；（3）Czk1+25%咪鮮胺復(fù)配劑中濃度（Czk1 菌液100 倍液+25%咪鮮胺1 000 倍液）；（4）Czk1+25%咪鮮胺復(fù)配劑低濃度（Czk1 菌液200 倍液+25%咪鮮胺1 500 倍液）；（5）25%丙環(huán)唑 戊唑醇200 倍液；（6）25%丙環(huán)唑 戊唑醇500 倍液；（7）25%咪鮮胺1 000 倍液；（8）25%咪鮮胺1 500 倍液；（9）Czk1 菌液50 倍液；（10）Czk1 菌液100 倍液；（11）Czk1 菌液200 倍液；（12）16%百菌清咪鮮胺 三唑酮熱霧劑250 mL/hm2；（13）水噴霧。各藥劑有效成分的濃度見(jiàn)表2。每處理4 次重復(fù)，于2021年3 月始見(jiàn)橡膠樹(shù)“兩病”后噴霧（煙），各處理藥液用量為1 000 L/hm2，按照每公頃噴施1 000 L 藥液計(jì)算殺菌劑和生防菌原液的用量，再加水定容至1000L/hm2。隔7 d 重復(fù)噴霧1 次。于第1 次施藥時(shí)調(diào)查記錄病情基數(shù)，第2 次施藥10 d后調(diào)查最終病情，并計(jì)算防效。橡膠樹(shù)炭疽病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下[16]，0 級(jí)：葉片無(wú)病斑；1 級(jí)：葉片有少量病斑，病斑占葉面積1%~5%；2 級(jí)：葉片有較多病斑，病斑占葉片面積6%~15%；3 級(jí)：葉片病斑占葉片面積16%~25%以下，或病斑在古銅葉基部1/2內(nèi)的主脈上；4級(jí)：葉片病斑占葉片面積26%~50%，或病斑在古銅期葉基部；5 級(jí)：葉片病斑占葉片面積50%以上，或葉片嚴(yán)重畸形，或落葉，或芽枯死。橡膠樹(shù)白粉病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下[17]，0 級(jí)：無(wú)病斑；1 級(jí)：病斑面積占葉片總面積1%~5%；3 級(jí)：病斑面積占葉片總面積的6%~10%；5 級(jí)：病斑面積占葉片總面積的11%~15%，或葉片組織因病而輕度畸形；7 級(jí)：病斑面積占葉片總面積的16%~20%，或葉片因病而卷曲；9級(jí)：病斑面積占葉片總面積的20%以上，或葉片因病而嚴(yán)重卷曲。每小區(qū)隨機(jī)選取5 株橡膠樹(shù)，每株膠樹(shù)東、南、西、北方向各取1 蓬葉，每蓬葉隨機(jī)取5 片中間小葉（共100 片），進(jìn)行病情基數(shù)調(diào)查。

表2 各處理藥劑的有效成分及濃度Table 2 The active ingredient and concentration of each fungicide

病情指數(shù)和防治效果計(jì)算公式為：

病情指數(shù)=∑（各級(jí)葉片數(shù) 級(jí)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)最高病級(jí)）100

防治效果[18]（%）=[1-（空白對(duì)照區(qū)藥前病情指數(shù)處理區(qū)藥后病情指數(shù)）/（空白對(duì)照區(qū)藥后病情指數(shù) 處理區(qū)藥前病情指數(shù)）] 100；

1.4 Horsfall法測(cè)定復(fù)配劑對(duì)橡膠“兩病”的協(xié)同能力

協(xié)同能力測(cè)定采用Horsfall 法并稍加改進(jìn)，計(jì)算協(xié)同增效[13,19,20]。計(jì)算公式：

式中：IR 為增效比率；Eab 為混劑的實(shí)際防效；Eth為混劑的理論防效。Eth=單劑生防菌實(shí)際防效 配比中的百分率+化學(xué)殺菌劑實(shí)際防效 配比中的百分率。若IR>1，為增效作用；若IR<1，為拮抗作用；IR=1，為相加作用。

1.5 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用IBM SPSS Statistics 22.0 軟件和Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，采用LSD 法進(jìn)行數(shù)據(jù)間的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)配劑對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病的田間防治效果

試驗(yàn)結(jié)果表明（表3），防治橡膠樹(shù)炭疽病效果最好的藥劑組合是Czk1+咪鮮胺復(fù)配劑中濃度，防效為75.18%；其次是Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復(fù)配劑高濃度、單劑25%丙環(huán)唑 戊唑醇200 倍液、單劑25%咪鮮胺1 000 倍液和單劑Czk1 菌液50 倍液，防效分別是58.24%、53.11%、54.20%和51.95%，除Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復(fù)配高濃度處理外，其余3 個(gè)處理均顯著低于Czk1+25%咪鮮胺復(fù)配劑中濃度的防效；Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復(fù)配劑中濃度、Czk1+25%咪鮮胺復(fù)配劑低濃度、單劑25%咪鮮胺1 500 倍液和單劑Czk1 菌液100 倍液、200 倍液的防治效果與對(duì)照藥劑16%百菌清 咪鮮胺 三唑酮的差異并不顯著，防效分別為39.02%、35.99%、33.94%、42.55%、39.68%和25.57%；單劑25%丙環(huán)唑 戊唑醇500 倍液的防治效果最差，僅為10.38%，低于對(duì)照藥劑，但差異并不顯著。

表3 復(fù)配劑對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病的防治效果Table 3 Control efficacy of compound of Bacillus subtilis and fungicides on anthracnose of rubber tree

2.2 復(fù)配劑對(duì)橡膠樹(shù)白粉病的田間防治效果

由表4 可知，防治橡膠樹(shù)白粉病效果最好的藥劑組合是單劑25%丙環(huán)唑 戊唑醇500 倍液和單劑25%咪鮮胺1 500 倍液，防效分別為82.11%和76.88%，兩者的差異不顯著；其次是Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復(fù)配劑中濃度，防效為71.34%；防治橡膠樹(shù)白粉病效果較好的是Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復(fù)配劑高濃度、Czk1+25%咪鮮胺復(fù)配劑中和低濃度，防效分別為59.54%、64.27%和59.51%，顯著優(yōu)于對(duì)照藥劑16%百菌清 咪鮮胺 三唑酮；單劑25%咪鮮胺1 000 倍液的防治效果和對(duì)照藥劑16%百菌清 咪鮮胺 三唑酮相當(dāng)，分別為51.90%和51.18%；單劑25%丙環(huán)唑 戊唑醇200 倍液、單劑Czk1 菌液50 倍液、100 倍液和200倍液的防治效果較差，顯著低于對(duì)照藥劑16%百菌清咪鮮胺 三唑酮，其中單劑Czk1 菌液100 倍液的防治效果最差，防效僅為27.66%，顯著低于其他處理。

表4 復(fù)配劑對(duì)橡膠樹(shù)白粉病的防治效果Table 4 Control efficacy of Bacilus subtilis and fungicides on powdery mildew of rubber tree

2.3 復(fù)配劑對(duì)橡膠樹(shù)“兩病”防治協(xié)同能力的影響

采用Horsfall 法分析復(fù)配劑對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病和白粉病的協(xié)同防治增效作用。如表5 所示，除Czk1+25%咪鮮胺復(fù)配劑低濃度的處理組對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病防治有拮抗作用外，其余復(fù)配劑處理組在防治橡膠樹(shù)炭疽病和白粉病時(shí)均具有增效作用。在橡膠樹(shù)炭疽病防治方面，增效作用最強(qiáng)的處理組是Czk1+25%咪鮮胺復(fù)配劑中濃度，增效比率為1.68；其次是Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復(fù)配劑中濃度和Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復(fù)配劑高濃度，增效比率分別為1.19 和1.11。在橡膠樹(shù)白粉病防治方面，增效作用最強(qiáng)的復(fù)配劑處理組是Czk1+25%咪鮮胺復(fù)配劑中濃度，增效比率為1.98；增效作用較強(qiáng)的處理組是Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復(fù)配劑高濃度和中濃度，增效比率分別為1.49 和1.62，而Czk1+25%咪鮮胺復(fù)配劑低濃度的增效作用稍弱?？傮w來(lái)看，Czk1+25%咪鮮胺復(fù)配劑中濃度和Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復(fù)配劑中濃度對(duì)橡膠樹(shù)兩種葉部病害的防治均具有較好的增效作用，而Czk1+25%咪鮮胺復(fù)配劑低濃度對(duì)橡膠樹(shù)“兩病”防治未有明顯增效作用。

表5 復(fù)配劑對(duì)防治橡膠樹(shù)炭疽病和白粉病的增效作用Table 5 Synergistic effect of compound on control of anthracnose and powdery mildew of rubber tree

3 討論

橡膠樹(shù)是典型的熱帶雨林多年生喬木，其所產(chǎn)天然橡膠是我國(guó)重要的戰(zhàn)略物質(zhì)資源，然而天然橡膠的生產(chǎn)因受炭疽病和白粉病嚴(yán)重危害導(dǎo)致膠樹(shù)落葉、枝條枯死，推遲開(kāi)割時(shí)間2~3 個(gè)月，嚴(yán)重影響了天然橡膠的產(chǎn)量和質(zhì)量，有效防治以上兩種橡膠樹(shù)重要病害具有重大意義。目前，盡管利用化學(xué)防治的方法可對(duì)橡膠樹(shù)“兩病”進(jìn)行有效的控制，但化學(xué)防治易造成病原菌產(chǎn)生抗藥性、殺菌劑用藥量大及生態(tài)環(huán)境污染等問(wèn)題。近年來(lái)，利用生防菌與化學(xué)殺菌劑聯(lián)合防治植物病害的研究成為熱點(diǎn)[21-24]，但對(duì)橡膠樹(shù)病害進(jìn)行菌藥協(xié)同防治的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究中的枯草芽孢桿菌Czk1 是由本實(shí)驗(yàn)室從橡膠樹(shù)根部分離獲得[25]，其抑菌活性物質(zhì)能較好抑制橡膠樹(shù)的炭疽病、白粉病和根病病原菌生長(zhǎng)[26-28]，謝立等[15]研究化學(xué)殺菌劑與枯草芽孢桿菌Czk1 復(fù)配對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病菌的抑制活性結(jié)果表明，Czk1 與化學(xué)殺菌劑25%丙環(huán)唑 戊唑醇、25%咪鮮胺均具有較好的相容性，并且兩兩復(fù)配對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病菌的抑菌活性具有明顯增效作用，但Czk1 與化學(xué)殺菌劑對(duì)橡膠樹(shù)病害的田間防治效果尚不明確，阻礙了其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。因此，研究菌藥聯(lián)合對(duì)橡膠樹(shù)“兩病”田間作用的效果及機(jī)制，對(duì)于進(jìn)一步推動(dòng)生防菌與化學(xué)藥劑協(xié)同防治橡膠樹(shù)病害的應(yīng)用具有較大意義?；谇捌谘芯拷Y(jié)果，本研究在田間評(píng)價(jià)了生防枯草芽孢桿菌Czk1 與化學(xué)殺菌劑協(xié)同對(duì)橡膠樹(shù)“兩病”防效的影響及其增效作用。菌藥協(xié)同對(duì)橡膠樹(shù)“兩病”田間防治試驗(yàn)結(jié)果表明，與常規(guī)熱霧劑16%百菌清 咪鮮胺 三唑酮的防效相比，兩種菌藥復(fù)配劑（Czk1+25%咪鮮胺和Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇）對(duì)橡膠樹(shù)“兩病”的防效均有較大提高，其中Czk1+25%咪鮮胺復(fù)配劑的中濃度對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病的防效達(dá)75.18%，比對(duì)照藥劑提高了49.61%；Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復(fù)配劑的中濃度對(duì)橡膠樹(shù)白粉病的防效為71.34%，比對(duì)照藥劑16%百菌清 咪鮮胺 三唑酮提高了20.16%。生防細(xì)菌和殺菌劑聯(lián)合作用，為化學(xué)殺菌劑的減量施用提供了很好的途徑。Kondoh 等[29]報(bào)道利用枯草芽孢桿菌與減半化學(xué)殺菌劑復(fù)配，對(duì)西紅柿立枯病和梨果病害的防效比使用單劑高；姚克兵等[30]利用枯草芽孢桿菌與減半用量化學(xué)殺菌劑對(duì)草莓病害的防效優(yōu)于二者單用；謝立[31]研究表明枯草芽孢桿菌Czk1與25%咪鮮胺和25%丙環(huán)唑 戊唑醇復(fù)配對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病菌抑菌作用明顯優(yōu)于單劑，但未進(jìn)一步進(jìn)行田間試驗(yàn)驗(yàn)證。在本研究中，田間試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于橡膠樹(shù)炭疽病，枯草芽孢桿菌Czk1 與25%咪鮮胺、25%丙環(huán)唑 戊唑醇分別復(fù)配防治炭疽病的效果優(yōu)于兩種化學(xué)殺菌劑單用，與謝立[31]的研究結(jié)果相似；而對(duì)于橡膠樹(shù)白粉病，菌藥復(fù)配劑防治白粉病的效果略低于二者單用的中低濃度，與上述學(xué)者的研究結(jié)論不一致，可能與田間復(fù)雜的環(huán)境狀況、病害發(fā)生流行等多種因素有關(guān)。在Czk1+25%咪鮮胺復(fù)配劑和Czk1+25%丙環(huán)唑 戊唑醇復(fù)配劑中25%咪鮮胺和25%丙環(huán)唑 戊唑醇的占比分別為20%和30%，這意味著在25%咪鮮胺減量80%和25%丙環(huán)唑 戊唑醇減量70%的條件下，菌藥復(fù)配劑仍然有很好的防效，與韓麗等[32]的研究結(jié)論相似，說(shuō)明本研究中的兩種菌藥復(fù)配劑具有很好開(kāi)發(fā)成為新型藥劑的潛力，研究結(jié)果對(duì)當(dāng)前橡膠樹(shù)“兩病”綠色防控具有重大指導(dǎo)作用。

通過(guò)Czk1 和25%咪鮮胺、25%丙環(huán)唑 戊唑醇分別復(fù)配后的田間防效測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在防治橡膠樹(shù)“兩病”時(shí)出現(xiàn)了較強(qiáng)增效作用?？赡苁怯捎?5%咪鮮胺、25%丙環(huán)唑 戊唑醇的存在抑制或減少了其他病原微生物的競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致葉圍上營(yíng)養(yǎng)供給相對(duì)增加，提高了Czk1在橡膠樹(shù)體內(nèi)存活率和定殖能力?？莶菅挎邨U菌Czk1是橡膠樹(shù)的內(nèi)生菌[25]，其發(fā)酵液、抗菌提取物和揮發(fā)性物質(zhì)都具有較強(qiáng)的抑菌活性，而且還能誘導(dǎo)橡膠樹(shù)產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性，其定殖能力的增強(qiáng)有利于增加其發(fā)揮抗菌和防病促生能力[33]，這與邱雪迎等[34]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，枯草芽孢桿菌Czk1 可分別與25%丙環(huán)唑 戊唑醇、25%咪鮮胺復(fù)配，能有效地防治橡膠樹(shù)炭疽病和白粉病，而且菌藥復(fù)配對(duì)橡膠樹(shù)“兩病”防治具有明顯的增效作用，因此，Czk1 與25%丙環(huán)唑 戊唑醇、25%咪鮮胺菌藥復(fù)配具備開(kāi)發(fā)成為有效防治橡膠樹(shù)“兩病”的新型藥物的潛能。本研究為橡膠樹(shù)“兩病”綠色防控技術(shù)應(yīng)用提供了參考依據(jù)，但關(guān)于Czk1與25%丙環(huán)唑 戊唑醇、25%咪鮮胺復(fù)配對(duì)橡膠樹(shù)“兩病”防治的增效機(jī)理還需進(jìn)行深入的研究。