羅海玲 夏順超 盧琴 李海銀

摘 要：?草地貪夜蛾是一種重要的農業(yè)害蟲，其遷飛性強、寄主廣、繁殖力高，給我國農業(yè)經濟帶來了嚴重損失。從分子水平探究草地貪夜蛾生長、發(fā)育、繁殖、抗藥性形成的內在分子機理，能為蟲害的防治、防控提供重要參考。 β-Actin作為一種高度保守的看家蛋白常在分子生物學中用作內參去定量目標蛋白的表達水平，因而獲得高質量的β-Actin抗體是從事相關分子研究的基本前提。因此，本研究克隆了草地貪夜蛾β-Actin基因部分編碼序列，長度為579 bp。利用原核表達系統誘導獲得了約37 kD的β-Actin重組蛋白，將純化后的重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備得到β-Actin多克隆抗體血清。經ELISA檢測，獲得的抗血清效價達1∶ 256000。利用制備的β-Actin抗血清進行Western blot試驗，結果顯示在42 kD處出現強且單一的蛋白條帶， 說明制備的β-Actin抗血清能有效識別草地貪夜蛾β-Actin蛋白。綜上，本研究制備的β-Actin多克隆抗體效價高、特異性較強，能為草地貪夜蛾后續(xù)相關分子研究提供基本條件。

關鍵詞：草地貪夜蛾；β-Actin；原核表達；多克隆抗體

中圖分類號：Q965

文獻標識碼：A

文章編號：1008－0457（2023）02－0081－05

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2023.02.012

草地貪夜蛾 ?Spodoptera frugiperda ，屬鱗翅目Lepidoptera，夜蛾科Noctuidae，是一種重要的雜食性農業(yè)害蟲，其幼蟲可危害玉米、水稻、高粱等禾本科作物［1］。草地貪夜蛾原產于美洲大陸［2］，2018年底從緬甸入侵我國云南地區(qū)，隨后在貴州各地陸續(xù)發(fā)現草地貪夜蛾［3］，并逐漸向我國其他地區(qū)擴散［4］。草地貪夜蛾具有遷飛擴散性、寄主廣泛性、高繁殖性、暴食為害性等特點，嚴重損害了我國農業(yè)經濟［5-6］。目前，草地貪夜蛾的防治主要使用化學防治、農業(yè)防治、生物防治等，其中化學防治方法見效快，使用方法也比較簡單方便［7］，但隨著化學藥劑的大量使用和草地貪夜蛾的快速演進，草地貪夜蛾的抗藥性也逐漸增強，急需開發(fā)更新型的綠色殺蟲藥物用以防治。伴隨著分子生物學技術的發(fā)展，從分子水平探究草地貪夜蛾生長、發(fā)育、繁殖、抗藥性形成的內在分子機制，以此為理論基礎挖掘防治草地貪夜蛾的潛在分子靶標，開發(fā)新型綠色農藥，能為草地貪夜蛾的防治提供新思路［8-9］。

在分子生物學技術中，蛋白質印跡（Western blot）是蛋白層面研究的一種基礎且重要的技術，具有高敏感性和特異性的特點，可以從混合蛋白質中利用抗體檢測出目的蛋白，并能進行定性或定量分析［10］。然而，該技術需要一個穩(wěn)定表達的蛋白作為參考，以減少試驗誤差， 使結果更為信服。Actin，即肌動蛋白，幾乎存在于所有真核細胞中，是許多真核細胞中含量最為豐富的蛋白質［11］，作為細胞骨架的重要組分，參與細胞分裂、運動、生長等重要的生理活動［12-14］。根據Actin蛋白等電點的不同可以將其分為α、β、γ三種，其中β-Actin由于其高表達量和高穩(wěn)定性，常被用作內參來比較不同來源目的蛋白的表達差異［15］。而在試驗中檢測β-Actin蛋白則需要抗體的特異性識別，因此一個高效、穩(wěn)定的β-Actin抗體在蛋白分子研究中不可或缺。

本研究對草地貪夜蛾β-Actin基因部分編碼序列進行克隆，通過體外重組表達、純化得到草地貪夜蛾β-Actin重組蛋白，免疫新西蘭大白兔獲得草地貪夜蛾β-Actin多克隆抗體血清，并對抗體進行了效價檢測，Western blot結果顯示制備的抗體能特異性識別草地貪夜蛾β-Actin蛋白。 本研究制備的抗體能為草地貪夜蛾后續(xù)相關分子生物學研究提供必要條件。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料及主要試劑儀器

1.1.1 ?供試材料

試驗中使用的草地貪夜蛾采自貴州省黔西南望謨縣（N 25°10′28.53″，E 106°05′40.64″），并經實驗室人工飼養(yǎng)8代，飼養(yǎng)條件：溫度：25 ℃，濕度：75%，光照：2000 lux，L∶ D=14∶ 10。

1.1.2 ?主要試劑

總RNA提取試劑盒（碧云天）；反轉錄試劑盒 （Thermo）；T4DNA連接酶（Thermo）、限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ（Takara）、Taq DNA聚合酶（Takara）； DNA膠回收試劑盒（上海生工）、質粒提取試劑盒（上海生工）；His-tag蛋白純化試劑盒（碧云天）。

1.1.3 ?主要儀器

低溫超速離心機（Sigma）、PCR儀（Bio-Rad）、垂直蛋白電泳儀（Bio-Rad）、超聲破碎儀（新芝）、超低溫冰箱（捷盛）、酶標儀（Thermo）、超微量分光光度計（Thermo）。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?總RNA提取及cDNA合成

取草地貪夜蛾3齡幼蟲整蟲液氮研磨，使用RNA抽提試劑盒提取草地貪夜蛾的總RNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證草地貪夜蛾總RNA的完整性，經分光光度計檢測總RNA濃度。取1 μg總RNA作為模板，Oligo d（T）18為引物，參照反轉錄試劑盒步驟進行逆轉錄合成cDNA。

1.2.2 ?PCR擴增與產物回收純化

參照NCBI網站中草地貪夜蛾的β-Actin基因序列（登錄號：HQ008727.1）設計原核表達引物（表1），以草地貪夜蛾cDNA為模板，利用原核表達引物進行PCR擴增。PCR程序：98 ℃變性2 min； 98 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，并利用試劑盒切膠回收純化PCR產物。

1.2.3 ?原核表達載體的構建與鑒定

將純化后的PCR產物和表達質粒pET-32a用內切酶EcoRⅠ和HindⅢ分別進行雙酶切，純化雙酶切產物。在T4 DNA連接酶作用下將純化后的基因片段連入pET-32a質粒，轉化DH5α感受態(tài)細胞，并涂布于含有氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)14～16 h。PCR鑒定陽性菌落，并測序驗證序列正確性。挑選測序正確的陽性菌擴大培養(yǎng)，并抽提重組質粒。

1.2.4 ?重組蛋白誘導表達及純化

將鑒定正確的重組質粒轉化BL21感受態(tài)細胞，挑選單菌落入5 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至對數期（OD600值0.6～0.8），加入IPTG誘導表達6 h，同時設置不加IPTG誘導的菌液作為對照。用SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達情況。 將生長旺盛的種子菌接種到500 mL的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數期后，根據小規(guī)模表達的條件，加IPTG誘導6 h。收集大規(guī)模表達的菌液，利用裂解液和超聲破碎細胞，參照碧云天His-tag蛋白純化試劑盒進行蛋白純化。測定純化后蛋白濃度，并進行SDS-PAGE電泳檢測蛋白純度。-20 ℃保存純化后蛋白。

1.2.5 ?抗體的制備及效價檢測

采用皮下免疫法，將純化后的β-Actin重組蛋白免疫新西蘭大白兔獲得抗體血清，該部分由武漢金開瑞生物公司完成。

將獲得的抗體血清進行ELISA抗體效價檢測。用包被液稀釋抗原到2 μg/mL，以100 μL/孔加入96孔酶標反應板中，4 ℃過夜包被；洗滌液洗滌4次，加入封閉液，37 ℃溫育2 h；洗滌液洗滌4次，用PBS按1∶ 2000，1∶ 4000，1∶ 8000，1∶ 16000等比例稀釋血清，免疫前血清同比稀釋做為陰性對照，每孔加入100 μL，37 ℃孵育1 h；洗滌液洗滌4次，加入HRP標記的羊抗兔IgG抗體，100 μL/孔，37 ℃孵育40 min；洗滌5次后拍干，加新鮮配制的底物溶液100 μL/孔，37 ℃遮光放置10～20 min；加50 μL/孔終止液，拍照并用酶標儀測定OD450。將抗體血清OD450/免疫前血清OD450的比值≥2.1的最高稀釋度作為該抗血清的效價。

1.2.6 ?Western blot

提取草地貪夜蛾六齡幼蟲總蛋白，Brandford法測定蛋白濃度，并制備蛋白樣品。以3 μg、5 μg、8 μg總蛋白為濃度梯度進行SDS-PAGE電泳；濕轉法在100 V，1 h條件下將蛋白轉印到PVDF膜上；封閉液37 ℃孵育1 h；一抗（1∶ 3000）37 ℃孵育1 h；TBST洗4次，加入二抗（1∶ 10000）37 ℃孵育1.5 h；洗膜4次，ECL顯影曝光，掃描光密度信號。

2 ?結果與分析

2.1 ?原核表達載體的構建

根據草地貪夜蛾基因組推定的β-Actin蛋白序列（登錄號：AEK82131.1），選擇184～376位氨基酸序列作為免疫原（圖1），根據免疫原對應的編碼序列設計引物進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，在500～750 bp之間出現一條與理論長度（579 bp）大小一致的陽性條帶（圖2-a）。將所得的目的片段雙酶切連入pET-32a表達載體，并轉化DH5α感受態(tài)細胞。挑選單菌落進行PCR檢測（圖2-b），測序鑒定。

2.2 ?重組蛋白的誘導表達及純化

將構建正確的pET-32a-β-Actin重組質粒轉化BL21感受態(tài)細胞，陽性菌株用終濃度為0.2 mM IPTG誘導重組蛋白表達。SDS-PAGE電泳結果表明，誘導表達后在37 kD處有一條明顯增強蛋白條帶，與預期重組蛋白（含載體自帶硫氧還原蛋白和His標簽）大小一致（圖3），說明目的蛋白誘導表達成功。 將小規(guī)模誘導表達成功的菌液進行大規(guī)模誘導，收集誘導后的菌液，利用His-tag蛋白純化試劑盒進行蛋白純化，SDS-PAGE 電泳結果顯示經高濃度咪唑洗脫的重組蛋白純度較高（圖4），符合免疫要求，將洗脫的重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備抗體。

2.3 ?ELISA檢測抗體效價

將采集獲得的抗體血清進行ELISA抗體效價檢測。結果表明，隨著血清稀釋倍數的增加，OD450依次降低，β-Actin抗血清以1∶ 256000稀釋后OD450值是陰性對照免疫前血清OD450的2.65倍（＞2.1），由此判定制備的β-Actin抗血清效價為1∶ 256000（圖5）。

2.4 ?Western blot檢測草地貪夜蛾β-Actin蛋白

從草地貪夜蛾幼蟲中提取總蛋白進行Western blot試驗，結果顯示在42 kD左右檢測到一條明顯的特異性蛋白條帶，大小與預測的草地貪夜蛾β-Actin蛋白大小一致（圖6），表明制備的多克隆抗體可以特異性識別草地貪夜蛾β-Actin蛋白。

3 ?結論與討論

近半個世紀以來，分子生物學高速發(fā)展，從微觀分子水平探尋生物體的發(fā)生機制已成為當前研究的主體［16］，其中蛋白表達分析在發(fā)現新的調控分子機制方面發(fā)揮著重要的作用［17］。比較生命體不同細胞或組織的蛋白表達差異是研究其生物學現象和功能的重要基礎，要準確判斷蛋白表達的水平，就需要一個穩(wěn)定表達的內參，使定性定量分析達到標準化［18］。β-Actin是生物進化過程中最保守的蛋白之一，在蛋白水平具有95%的一級結構保守性［19］。此外，β-Actin蛋白幾乎在所有真核細胞中穩(wěn)定高量表達，因此常被用作內參來標定其他蛋白的表達情況。在昆蟲的分子生物學相關研究中，β-Actin是最常用的內參之一［20-22］，但β-Actin蛋白的檢測需要相應特異性抗體，目前市面上大多 數商品化的抗體主要針對哺乳動物細胞及組織，在昆蟲（如草地貪夜蛾）體內特異性不強，且商品化內參抗體價格也較為昂貴［23］，因而制備草地貪夜蛾β-Actin多克隆抗體是檢測其他蛋白表達情況的前提條件。

本研究選用大腸桿菌原核表達系統進行β-Actin重組蛋白表達，該表達系統具有條件需求簡單、使用安全、試驗周期短、重組蛋白表達量高等優(yōu)點［24-25］。本研究使用的表達載體質粒為pET-32a（+），該質粒自帶硫氧還原蛋白，與目的蛋白融合表達可增加重組蛋白的水溶性，有利于提高蛋白表達量。此外，pET-32a（+）攜帶了6×His標簽，在不影響目的蛋白結構和功能前提下，可與Ni+穩(wěn)定螯合，為純化目的蛋白提供了有利的條件。鑒于以上優(yōu)勢，本研究成功誘導表達并純化了草地貪夜蛾β-Actin重組蛋白，并以此為抗原免疫新西蘭大白兔，制備得到了β-Actin多克隆抗體。

抗體可分為多克隆抗體和單克隆抗體。相較于單克隆抗體，多克隆抗體的制備程序簡單，效價更高，但與其他非靶標蛋白發(fā)生交叉反應的風險也較高［26］。本研究制備的β-Actin多克隆抗體經ELISA檢測抗體效價達到1∶ 256000，而Western blot結果證明制備的β-Actin多克隆抗體能有效識別草地貪夜蛾β-Actin蛋白，且未見有其他明顯雜交條帶，說明制備的多克隆抗體特異性強，與其他蛋白并不發(fā)生強的交叉反應。因此，本研究制備的草地貪夜蛾β-Actin多克隆抗體不僅可以作為內參在Western blot中來標定其他蛋白的表達情況，還能應用于對抗體要求較高的免疫組化、免疫熒光、免疫共沉淀等多種研究。

綜上所述，本研究通過重組表達草地貪夜蛾β-Actin蛋白，并免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗體血清，經效價測定和Western blot檢測證明制備的β-Actin抗體效價高、特異性好，可用于后續(xù)試驗，能為草地貪夜蛾的深入研究提供良好基礎。

（責任編輯：段麗麗）

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Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of the β-Actin in Spodoptera frugiperda

Luo Hailing，Xia Shunchao，Lu Qin，Li Haiyin*

（Institute of Entomology，Guizhou University/The Provincial Key Laboratory for Agricultural Pest Management of Mountainous Region of Guizhou，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：

Spodoptera frugiperda is an important agricultural pest.This pest has wide range of hosts，high reproduction，and strong immigration，which cause serious losses to the agricultural economy in China.The exploring of molecular mechanism of the growth，development，reproduction，and drug resistance of S.frugiperda，which could provide important information for the control of S.frugiperda.β-Actin，a highly conservative housekeeper protein，is often used as an internal reference to quantify the target protein expression frequently.Therefore，a high-quality β-Actin antibody is a prerequisite for protein research.In this study，we cloned the partial coding sequences of the β-Actin gene （579 bp） from S.frugiperda.A prokaryotic expression system was used to induce the β-Actin recombinant protein of about 37 kD.And then purified β-Actin recombinant proteins were used to immunize New Zealand white rabbit for preparing the antiserum β-Actin.ELISA analysis showed that the titer of the β-Actin antiserum was 1∶ 256000.Western blot showed that the β-Actin antibody could specifically recognize β-Actin protein （the band was about 42 kD）.In conclusion，the β-Actin polyclonal antibody with high potency and specificity was generated successfully in this study，which will provide the basic conditions for further molecular research in S.frugiperda.

Keywords：

Spodoptera frugiperda; β-Actin; prokaryotic expression; polyclonal antibody