房小鈺，葛廷雨，劉 森，常文莉，黃 鵬，黃和平，徐國兵，2，汪電雷

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230031；2.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051）

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，其病因是胰島素分泌不足或機(jī)體對胰島素抵抗。血管病變是糖尿病患者可能出現(xiàn)的最嚴(yán)重疾病之一，其起因是高糖誘導(dǎo)使血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷[1]。糖尿病的發(fā)病時間較長，而長時間處于高血糖狀態(tài)會給身體的各種組織和器官造成慢性損害，從而導(dǎo)致身體功能性損害[2-4]。糖尿病的發(fā)病率和氧化應(yīng)激有著密切的關(guān)聯(lián)。若機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，微循環(huán)就會遭到損壞，繼而累及人體內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，而且長時間處于高血糖狀態(tài)將會對血管內(nèi)皮細(xì)胞造成嚴(yán)重的損傷[5]。

前胡始載于《名醫(yī)別錄》中，主要采集于傘形科白花前胡（Peucedanum praeruptorumDunn）的干燥根，具有降氣化痰、疏散風(fēng)熱等功效[6]。前胡主要成分為香豆素類化合物。目前有研究發(fā)現(xiàn)香豆素類化合物具有保護(hù)血管、抗氧化、抗HIV、抗腫瘤等藥理作用[7-9]，而且香豆素類化合物有著多靶點調(diào)節(jié)，療效溫和、持久，以及副作用較小等優(yōu)點。韓瑩等[10]研究發(fā)現(xiàn)3-溴-4,7-二甲基-6-磺酰脲香豆素可明顯降低小鼠血糖。前胡總香豆素能降低2型糖尿病大鼠血糖[11]。為了進(jìn)一步探究其降糖作用機(jī)制，本研究采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞建立高糖誘導(dǎo)的HUVECs損傷模型，觀察前胡總香豆素對氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響，以期為前胡總香豆素降糖效果研究提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 HUVECs（批號：CRL-1730）由安徽省食品藥品檢驗研究院提供。

1.2 藥物與試劑 前胡總香豆素（批號：20201206）由安徽省食品藥品檢驗研究院提供；胎牛血清（批號：42Q0682K）購自美國Gibco公司；DMEM低糖培養(yǎng)基（批號：AG29694193）購自美國HyClone公司；CCK-8（批號：71011000）購自Biosharp；GSH-Px檢測試劑盒（批號：S0056）、SOD活性檢測試劑盒（批號：S0101S）、NO檢測試劑盒（批號：S0021S）、LDH毒性檢測試劑盒（批號：C0016）、Hoechst 33258染色試劑盒（批號：C003）均購自碧云天生物技術(shù)研究所；MDA檢測試劑盒（批號：BL904A）購自Biosharp；人TNF-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒（批號：202110）、人IL-1β酶聯(lián)免疫分析試劑盒（批號：202110）均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；Bcl-2抗體（批號：AF6139）、Bax抗體（批號：AF0120）均購自Affinity Biosciences；cleaved Caspase-3抗體（批號：R23727）購自Zenbio；GAPDH抗體（批號：210040421）、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（批號：216790201）、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（批號：210830419）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 CLM-170B-8-CN型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（新加坡藝思高科技有限公司）；SW-CJ-1D型超凈工作臺（蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司）；SC-3610型低速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；IX71型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；MS-1500型酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；AI-600型超靈敏多功能成像儀（美國CE Amersham Imager公司）。

2 方法

2.1 HUVECs培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞置于10%胎牛血清DMEM低糖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，條件為37 ℃，5%CO2。2 d換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長到80%左右，加入胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

2.2 前胡總香豆素對高糖誘導(dǎo)HUVECs損傷模型的濃度篩選將細(xì)胞以密度為5×104個/mL接種在96孔板內(nèi)，100 μL/孔，在培養(yǎng)箱放置過夜使之貼壁，然后吸盡培養(yǎng)液，隨機(jī)分成8組。正常對照組加入新的培養(yǎng)液；高糖模型組及給藥組分別加入100 μL高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，高糖模型組加入完全培養(yǎng)基，給藥組分別加入不同濃度的前胡總香豆素（5、10、20、40、80、160 μg/mL），放入培養(yǎng)箱孵育，24 h后向培養(yǎng)板加入CCK-8試劑，10 μL/孔，繼續(xù)放培養(yǎng)箱內(nèi)孵育45 min，酶標(biāo)儀檢測450 nm處的OD值，計算細(xì)胞增殖活力。

2.3 細(xì)胞分組與給藥 將HUVECs隨機(jī)分成正常對照組、高糖模型組、前胡總香豆素低劑量組、前胡總香豆素中劑量組、前胡總香豆素高劑量組。正常對照組：加入5.5 mmol/L葡萄糖；高糖模型組：加入35 mmol/L葡萄糖；前胡總香豆素低劑量組：先加入35 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)48 h，再加入10 μg/mL的前胡總香豆素；前胡總香豆素中劑量組：先加入35 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)48 h，再加入20 μg/mL的前胡總香豆素；前胡總香豆素高劑量組：先加入35 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)48 h，再加入40 μg/mL的前胡總香豆素。然后各組放培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以備后續(xù)指標(biāo)檢測。

2.4 倒置顯微鏡觀察HUVECs形態(tài) 將細(xì)胞以密度為8×103個/mL接種在6孔板內(nèi)，按“2.3”項下分組分別給藥培養(yǎng)后，使用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化并拍照。

2.5 GSH-Px、SOD活性及MDA含量檢測

2.5.1 GSH-Px活性檢測 依照操作說明往96孔板中按順序加入各種試劑溶液，輕緩搖晃使之混勻。即刻使用酶標(biāo)儀測各孔在340 nm處的OD值，此時記錄為0 min數(shù)值。待酶標(biāo)儀溫度達(dá)到25 ℃時再測定OD340值，此后每隔1 min記錄一次，連續(xù)5次，可獲得6個點的數(shù)據(jù)，計算GSH-Px活性。

2.5.2 SOD活性檢測 依照說明書配制所需溶液，設(shè)置待測樣品組、空白對照組1、空白對照組2，按順序放待測樣品及其余各種溶液，最后放反應(yīng)啟動工作液并使之充分混勻，37 ℃靜置30 min，使用酶標(biāo)儀測450 nm處的OD值，計算SOD活性。

2.5.3 MDA含量測定 按照說明書配制所需溶液，設(shè)置空白對照組、標(biāo)準(zhǔn)品組、待測樣品組。并按照說明書操作步驟依次加樣，最后酶標(biāo)儀上測定532 nm波長下的吸光度。對應(yīng)的試樣濃度由標(biāo)準(zhǔn)曲線和吸光度進(jìn)行計算，再根據(jù)用BCA試劑盒檢測出的蛋白濃度計算各組細(xì)胞的MDA含量。

2.6 HUVECs培養(yǎng)上清液中NO、LDH含量檢測 將細(xì)胞以密度為8×103/mL接種在6孔板內(nèi)，按“2.3”項下分組分別給藥培養(yǎng)后，取上清液，嚴(yán)格依照各說明書進(jìn)行操作，檢測其上清液中NO、LDH含量。

2.7 Hoechst染色檢測HUVECs凋亡 將細(xì)胞以密度為8×103個/mL接種在6孔板內(nèi)，按“2.3”項下分組分別給藥培養(yǎng)后，棄培養(yǎng)液，用PBS清洗3次。滴加4%多聚甲醛，1 mL/孔，固定20 min，棄去，PBS沖洗3次。每孔加Hoechst 33258染色液1 mL，染色10 min（搖床），棄去，PBS沖洗3次。每孔加0.5 mL抗熒光淬滅劑，使用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。

2.8 ELISA法檢測各組細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-1β水平 收集各組干預(yù)后的細(xì)胞培養(yǎng)液，3 000 r/min（4 ℃）離心10 min，取上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作步驟，進(jìn)行樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋、加樣、孵育抗體、加顯色劑等操作，酶標(biāo)儀450 nm波長下測OD值。將標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，各孔OD值作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)曲。再根據(jù)標(biāo)曲線計算樣品濃度。

2.9 Western blotting法檢測Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量 收集5組細(xì)胞提取總蛋白，用BCA法測定各組細(xì)胞蛋白濃度，然后在每組中加入5倍上樣緩沖液用100 ℃沸水煮13 min，之后蛋白上樣、凝膠電泳（115 V，1.5 h）、轉(zhuǎn)膜（100 V，45 min），用5%脫脂奶粉對其密封2 h，用TBST洗膜3次，10 min/次。加入一抗，4 ℃下靜置一夜，搖床孵育30 min，保持4 ℃恒溫下靜置一夜，再用TBST洗膜3次，每次清洗10 min，換二抗再孵育2 h，在使用TBST洗膜3次，10 min/次，涂抹ECL，使用超靈敏多功能成像儀檢測樣品灰度值，該實驗需要獨立并重復(fù)3次。

2.10 統(tǒng)計學(xué)方法 使用GraphPad Prism 8進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 前胡總香豆素對高糖誘導(dǎo)HUVECs損傷模型的有效濃度篩選 高糖模型組細(xì)胞存活率明顯低于正常對照組（P<0.05）；前胡總香豆素各濃度組（5、10、20、40、80 μg/mL）均可提高細(xì)胞存活率（P<0.05或P<0.01）。160 μg/mL組細(xì)胞存活率低于高糖模型組。綜合結(jié)果，選擇10、20、40 μg/mL的前胡總香豆素濃度作為給藥的低、中、高劑量。（見圖1）

圖1 各組細(xì)胞存活率比較 （±s，n=6）

3.2 各組HUVECs形態(tài)學(xué)比較 正常對照組細(xì)胞生長及其貼壁情況良好，細(xì)胞間連接十分緊密，界線清晰；高糖模型組細(xì)胞生長情況差，形態(tài)各異，細(xì)胞的兩端增長或拉絲，界線模糊；前胡總香豆素低、中、高劑量組細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)。（見圖2）

圖2 各組HUVECs 形態(tài)學(xué)比較 （×200）

3.3 各組HUVECs的GSH-Px、SOD活性及MDA、NO含量比較 高糖模型組HUVECs的GSH-Px、SOD活性及NO含量均明顯低于正常對照組（P<0.01）；前胡總香豆素低、中、高劑量組HUVECs的GSH-Px、SOD活性及NO含量均高于高糖模型組（P<0.05或P<0.01）。高糖模型組HUVECs的MDA含量明顯高于正常對照組（P<0.01）；前胡總香豆素低、中、高劑量組HUVECs的MDA含量均低于高糖模型組（P<0.05或P<0.01）。表明前胡總香豆素能降低高糖誘發(fā)的HUVECs氧化應(yīng)激水平。（見圖3）

圖3 各組HUVECs 的GSH-Px、SOD 活性及MDA、NO含量比較 （±s，n=3）

3.4 各組HUVECs的LDH釋放量比較 高糖模型組HUVECs的LDH的釋放量明顯高于正常對照組（P<0.01）；前胡總香豆素低、中、高劑量組HUVECs的LDH釋放量明顯低于高糖模型組（P<0.05或P<0.01）。（見圖4）

圖4 各組HUVECs 的LDH 釋放量比較 （±s，n=3）

3.5 各組HUVECs凋亡情況 正常對照組HUVECs細(xì)胞核呈現(xiàn)均一藍(lán)色，且細(xì)胞核形狀完整；高糖模型組HUVECs細(xì)胞核呈致密濃染，顏色發(fā)白；前胡總香豆素低、中、高劑量組HUVECs細(xì)胞凋亡情況改善明顯。（見圖5）

圖5 各組HUVECs 凋亡情況 （×200）

3.6 各組HUVECs的TNF-α、IL-1β水平比較 高糖模型組HUVECs的TNF-α和IL-1β水平均明顯高于正常對照組（P<0.01）；前胡總香豆素低、中、高劑量組HUVECs的TNF-α和IL-1β水平均明顯低于高糖模型組（P<0.05或P<0.01）。（見圖6）

圖6 各組HUVECs 的TNF-α、IL-1β 水平比較 （±s，n=3）

3.7 各組HUVECs的Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量比較 高糖模型組HUVECs的Bcl-2蛋白相對表達(dá)量低于正常對照組（P<0.01）；前胡總香豆素低、中、高劑量組HUVECs的Bcl-2蛋白相對表達(dá)量高于高糖模型組（P<0.05或P<0.01），并且呈劑量依賴性。高糖模型組HUVECs的Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量及Bax/Bcl-2明顯高于正常對照組（P<0.01）；前胡總香豆素低、中、高劑量組HUVECs的Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量及Bax/Bcl-2均低于高糖模型組（P<0.05或P<0.01），并且呈劑量依賴性。（見圖7~8）

圖7 各組HUVECs 中Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量及Bax/Bcl-2 比較 （±s，n=3）

圖8 各組HUVECs 中Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

4 討論

高糖會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞增加活性氧的生成量，進(jìn)而產(chǎn)生氧化應(yīng)激。應(yīng)激會產(chǎn)生多種炎癥因子，從而損壞血管內(nèi)皮細(xì)胞，造成其功能障礙[12]。高糖刺激后，細(xì)胞發(fā)生的氧化損傷和炎癥損傷是引發(fā)糖尿病的重要機(jī)制[13]。內(nèi)皮細(xì)胞本身就擁有氧化及抗氧化系統(tǒng)，且一般情況下兩者維持著動態(tài)平衡。內(nèi)皮細(xì)胞受到病理刺激后，其動態(tài)平衡會遭到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞組織損傷。GSH-Px、SOD及過氧化氫酶（CAT）作為酶系統(tǒng)主要的酶，屬于抗氧化系統(tǒng)；SOD是人體中最常見的一種抗細(xì)胞損害的酶，能催化超氧自由基生成雙氧水和分子氧[14-15]。研究表明，提高SOD的活性能夠提高血管的內(nèi)皮機(jī)能[16]，因此將SOD、GSH-Px的活力值作為人體氧化應(yīng)激水平高低的判斷條件，具有重要的意義。MDA是膜脂過氧化后的分解產(chǎn)物，其含量可以反映細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和作用受傷害程度[17-18]。同時血管內(nèi)皮還可以分泌NO，維持血液的動態(tài)均衡。此外，氧化應(yīng)激往往伴隨有炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞能夠產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和IL-6等一系列炎癥因子[19]。上述炎癥因子能夠進(jìn)一步加劇內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂，從而誘發(fā)細(xì)胞炎癥損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，前胡總香豆素低、中、高劑量組HUVECs的GSH-Px、SOD活性及NO含量明顯上升，MDA、LDH含量下降，TNF-α和IL-1β水平降低，說明前胡總香豆素可能通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)來保護(hù)高糖造成的HUVECs損傷。

細(xì)胞凋亡即細(xì)胞程序性死亡，可清除有害細(xì)胞，而異常的細(xì)胞凋亡則會導(dǎo)致一系列疾病[20]。Bcl-2和Bax是細(xì)胞凋亡中重要的調(diào)節(jié)蛋白；Bcl-2能夠降低或者阻斷DNA裂解、細(xì)胞皺縮及染色質(zhì)濃縮，在凋亡早期作用重大[21]；Bax的促細(xì)胞凋亡作用則是通過其本身形成的Bax同源二聚體造成的，它還可以與Bcl-2形成Bax-Bcl-2異源二聚體從而抑制細(xì)胞凋亡[22]。正常情況下Bcl-2與Bax結(jié)合后可阻斷Bax、Bax異源二聚體的形成。Bax/Bcl-2表達(dá)比率對于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡至關(guān)重要，該比率對細(xì)胞凋亡速度有一定決定性作用[23]。Bax/Bcl-2比率太高將會導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體快速進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而激活Caspase-3。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行因子，通常作為酶原出現(xiàn)；Caspase-3一旦被活化則以其切割形式cleaved Caspase-3存在，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24-25]。研究表明，高滲環(huán)境損傷和氧化損傷可以激發(fā)線粒體的凋亡途徑，調(diào)節(jié)Bc1-2家族成員活性，并通過活化胞質(zhì)中促凋亡蛋白Bax或Bax二聚體，抑制抗凋亡蛋白Bc1-2表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，前胡總香豆素低、中、高劑量組HUVECs的Bcl-2蛋白相對表達(dá)量升高，Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量及Bax/Bcl-2顯著降低，說明前胡總香豆素能通過抑制細(xì)胞凋亡對高糖損傷HUVECs產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，且低、中、高劑量前胡總香豆素對HUVECs的保護(hù)作用存在一定的劑量依賴性，即劑量越高對HUVECs的保護(hù)作用越明顯。

綜上所述，前胡總香豆素能夠通過降低細(xì)胞內(nèi)MDA、LDH含量及提高GSH-Px、SOD、NO活性，改善高糖導(dǎo)致的HUVECs氧化應(yīng)激損傷；前胡總香豆素能有效控制TNF-α和IL-1β等炎癥因子，抑制炎癥反應(yīng)；同時前胡總香豆素可以增強(qiáng)抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表達(dá)，下調(diào)凋亡因子Bax、cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)，降低Bax/Bcl-2，從而控制細(xì)胞凋亡。本研究驗證了前胡總香豆素能夠通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡兩條途徑共同達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的功效，為后續(xù)進(jìn)一步探討前胡總香豆素對高糖導(dǎo)致HUVECs的保護(hù)機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。