徐夢(mèng)月，白 娟，王 強(qiáng)

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712000；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710061）

高血壓是全球最常見的慢性心血管疾病，嚴(yán)重危害人類健康。充分的證據(jù)表明，針灸降壓療效確切、真實(shí)、可靠，且能在降壓的同時(shí)減少藥物所帶來的毒副反應(yīng)，是一種值得在臨床上推廣應(yīng)用的治療方法[1-4]。但針灸降壓的具體機(jī)制至今尚未明確，一定程度上限制了該項(xiàng)療法的推廣應(yīng)用，因此明確針灸降壓的機(jī)制顯得尤為重要。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，針灸以人體經(jīng)絡(luò)理論為基礎(chǔ)，通過對(duì)人體臟腑氣血陰陽之失衡進(jìn)行良性調(diào)節(jié)，從而促使人體恢復(fù)陰平陽秘的正常生理狀態(tài)。針灸治療效應(yīng)是機(jī)體多靶點(diǎn)共同作用的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，針灸可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群的結(jié)構(gòu)和組成，增加有益菌豐度而降低致病菌豐度，從而改善肥胖、糖尿病及結(jié)腸炎等疾病[5-7]。腸道菌群是定植在人類胃腸道內(nèi)數(shù)以萬計(jì)的微生物的總稱，其組成變化在誘導(dǎo)和促進(jìn)高血壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[8]。研究顯示，腸道菌群可通過調(diào)節(jié)迷走神經(jīng)、分泌神經(jīng)遞質(zhì)、免疫調(diào)節(jié)、產(chǎn)生微生物代謝物及影響腸神經(jīng)系統(tǒng)參與血壓的調(diào)控[9-10]。因此，本研究擬采用16S rDNA測(cè)序分析自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertension rats，SHR）與Wistar京都種（Wistar-Kyoto，WKY）大鼠大腸內(nèi)容物菌群變化，探索電針干預(yù)對(duì)SHR腸道菌群的影響，進(jìn)一步豐富電針降壓的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12周齡SPF級(jí)雄性SHR大鼠20只，同周齡SPF級(jí)雄性WKY大鼠10只，兩種大鼠體質(zhì)量均為240~260 g，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（京）2021-0006。大鼠飼養(yǎng)在西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫（22±2）℃，濕度55%~65%，12 h光照/12 h黑暗交替，所有大鼠均可自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物均在麻醉狀態(tài)下（10%水合氯醛腹腔注射）進(jìn)行處死，以盡可能減少痛苦。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案和程序均經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2020-286）。

1.3 主要儀器 BP-100A型全自動(dòng)大小鼠無創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；SDZ-Ⅱ型華佗牌電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；環(huán)球無菌針灸針（蘇州針灸用品有限公司，規(guī)格：0.25 mm×13 mm）；Bio-rad T100型梯度PCR儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；Qubit@ 2.0Fluorometer（美國(guó)Thermo Scientific公司）。

1.4 分組與干預(yù) 將20只雄性SHR隨機(jī)分成模型組和電針組，每組10只；10只雄性WKY大鼠作為對(duì)照組。3組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始電針干預(yù)。電針組大鼠周一至周五09：00：00—12：00：00用自制鼠袋捆綁固定上半身后，取仰臥位，選取雙側(cè)足三里（位于后膝關(guān)節(jié)外下方，腓骨小頭下5~7 mm）進(jìn)行干預(yù)，穴位定位和具體針刺方法參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》，連接電針治療儀的輸出端，給予電針刺激（疏密波，3 Hz/15 Hz，強(qiáng)度為1 mA，每次30 min，1次/d，連續(xù)5 d，休息2 d），共持續(xù)6周。對(duì)照組、模型組大鼠采用和電針組相同的固定方法，但不進(jìn)行干預(yù)。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 大鼠血壓測(cè)量 于電針的前1天（T1）及電針第2、4、6周的周六（T2、T3、T4）09:00:00—12:00:00，在大鼠清醒狀態(tài)下應(yīng)用無創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x測(cè)量尾動(dòng)脈收縮壓，所有大鼠連續(xù)測(cè)3次，取平均值。

1.5.2 大鼠腸道菌群變化檢測(cè) 于電針結(jié)束前1天，收集大鼠糞便至無菌EP管中，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。每組隨機(jī)抽取7只大鼠的糞菌送至武漢邁特維爾生物科技有限公司，由該公司對(duì)其進(jìn)行基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的混樣和純化、文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序及生物信息分析檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1.6.1 生物信息分析 使用Illumina NovaSeq測(cè)序得到下機(jī)數(shù)據(jù)（Raw PE），再進(jìn)行拼接、質(zhì)控及嵌合體過濾，得到后續(xù)可用于分析的有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。以97%的一致性（Identity），對(duì)每個(gè)樣本的Effective Tags進(jìn)行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類，之后對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋。選擇QIIME 1.9.1軟件和R軟件分析和處理測(cè)序結(jié)果，通過Alpha多樣性指數(shù)（Chao1、Shannon和Simpson）分析與基于加權(quán)Unifrac距離（weighted Unifrac）的主坐標(biāo)分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCoA），確定各組大鼠腸道菌群的特征。

1.6.2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料服從正態(tài)分布以（x±s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)兩兩比較用LSD法，方差不齊時(shí)用Tamhane's T2法；血壓數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測(cè)量資料方差分析，符合球形檢驗(yàn)時(shí)用主體內(nèi)效應(yīng)檢驗(yàn)（假設(shè)球形度），不符合球形檢驗(yàn)時(shí)用多變量檢驗(yàn)（比萊軌跡）。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠收縮壓比較 所有大鼠不同時(shí)間點(diǎn)收縮壓比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=56.115，P=0.000），即存在時(shí)間效應(yīng)。對(duì)照組大鼠收縮壓隨時(shí)間推進(jìn)變化不明顯（F=0.811，P=0.499），模型組大鼠收縮壓隨時(shí)間推進(jìn)呈現(xiàn)明顯升高趨勢(shì)（F=545.691，P=0.000），電針組大鼠收縮壓隨時(shí)間推進(jìn)呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)（F=43.200，P=0.000）。3組大鼠收縮壓總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2 358.157，P=0.000），即存在分組效應(yīng)。干預(yù)前1天電針組大鼠收縮壓與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其余各時(shí)間點(diǎn)電針組大鼠收縮壓均明顯低于模型組（P<0.05），且電針組和模型組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)的收縮壓均明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。時(shí)間因素與分組因素之間存在交互效應(yīng)（F=27.468，P=0.000），即各組大鼠干預(yù)前后收縮壓變化幅度不一致。上述結(jié)果提示電針干預(yù)可以降低大鼠血壓。（見表1、圖1）

圖1 各組大鼠收縮壓交互效應(yīng)輪廓圖

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)收縮壓比較 （±s，mm Hg）

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)收縮壓比較 （±s，mm Hg）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與電針組比較，cP<0.05；與干預(yù)前1天比較，dP<0.05。

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2.2 物種注釋及測(cè)序質(zhì)量分析 由3組樣本聚類得到的OTUs韋恩圖（見圖2）可知，3組共有1 733個(gè)相同OTUs，對(duì)照組有225個(gè)特征OTUs，模型組有511個(gè)特征OTUs，電針組出現(xiàn)378個(gè)特征OTUs并有491個(gè)OTUs發(fā)生了改變。3組樣本的稀釋曲線均趨向平坦，說明實(shí)驗(yàn)測(cè)序深度足夠，當(dāng)序列接近50 000時(shí)再增加序列只會(huì)產(chǎn)生少量新的物種。（見圖3）當(dāng)箱形圖位置隨著樣本量的增加而趨于平緩時(shí)，表示此實(shí)驗(yàn)中的物種不會(huì)再隨樣本量的增加而明顯增多，提示樣本量充分。（見圖4）

圖2 OTUs 韋恩圖

圖3 稀釋曲線圖

圖4 物種累積箱圖

2.3 腸道菌群多樣性分析 本實(shí)驗(yàn)采用Alpha多樣性中的ACE、Shannon和Simpson指數(shù)來分析菌群的豐富度和多樣性。其中，ACE指數(shù)用于估計(jì)群落中OTU數(shù)目，該指數(shù)越大，菌群豐富度越高。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量群落的多樣性和均勻度，群落多樣性越高，物種分布越均勻，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)也越大。由表2知，模型組大鼠菌群ACE指數(shù)高于對(duì)照組和電針組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。對(duì)照組和電針組大鼠菌群Shannon指數(shù)與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。對(duì)照組和電針組大鼠菌群Simpson指數(shù)高于模型組（P<0.05）。采用基于weighted Unifrac距離的PCoA法，進(jìn)一步比較3組樣本腸道菌群物種構(gòu)成差異程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與模型組距離較遠(yuǎn)，提示與對(duì)照組比較，模型組大鼠菌群組成結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著改變（Amova，P=0.002）；電針組與模型組距離較遠(yuǎn)，但與對(duì)照組距離較近，提示與模型組比較，電針干預(yù)后的菌群物種構(gòu)成發(fā)生了明顯變化（Amova，P=0.003）。（見圖5、表3）

圖5 基于weighted unifrac 距離PCoA 分析

表2 3 組大鼠菌群Alpha 多樣性指數(shù)比較 （±s）

表2 3 組大鼠菌群Alpha 多樣性指數(shù)比較 （±s）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

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表3 Amova 組間差異分析

2.4 腸道菌群結(jié)構(gòu)組成分析 統(tǒng)計(jì)3組大鼠在門水平和屬水平豐度排名前10的物種并繪制成豐度柱狀圖。（見圖6~7）在門水平上，3組大鼠優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。其中，與對(duì)照組比較，模型組大鼠厚壁菌門相對(duì)豐度升高，擬桿菌門相對(duì)豐度降低，F(xiàn)/B值明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，電針組大鼠厚壁菌門相對(duì)豐度降低，擬桿菌門相對(duì)豐度升高，F(xiàn)/B值顯著降低（P<0.05）。（見表4）在屬水平上，與對(duì)照組比較，模型組大鼠Lactobacillus、Treponema、Clostridium_sensu_stricto_1、Blautia、Turicibacter相對(duì)豐度明顯升高（P<0.05），Ruminococcus、Prevotellaceae_Ga6A1_group、Anaerostipes相對(duì)豐度明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，電針組大鼠以上菌屬均得到改善，Lactobacillus、Treponema、Clostridium_sensu_stricto_1、Blautia、Turicibacter相對(duì)豐度均明顯降低（P<0.05），Ruminococcus和Anaerostipes相對(duì)豐度均明顯升高（P<0.05）。（見表5）

圖6 3 組大鼠前10 門水平菌群豐度構(gòu)成圖

圖7 3 組大鼠前10 屬水平菌群豐度構(gòu)成圖

表4 3 組大鼠F/B 值比較 （±s）

表4 3 組大鼠F/B 值比較 （±s）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

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表5 3 組大鼠前10 屬水平組間差異物種比較 （±s）

表5 3 組大鼠前10 屬水平組間差異物種比較 （±s）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

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3 討論

中醫(yī)學(xué)多將高血壓歸屬于“頭痛”“眩暈”等范疇，主要由脾虛痰濕、肝氣不舒、氣血瘀滯引起。足三里穴屬足陽明胃經(jīng)穴，具有健脾和胃、補(bǔ)中益氣、通腑化痰之功效。足陽明胃經(jīng)為多氣多血之經(jīng)，因此針刺足三里能夠刺激整條經(jīng)脈，可通經(jīng)活絡(luò)，調(diào)和氣血，調(diào)理經(jīng)脈，最終達(dá)到平衡血壓的目的。另外，足陽明胃經(jīng)于頭面部分布密集，且經(jīng)脈循行不僅屬胃，散脾，還上通于心，而心又主血脈，故針刺足三里穴能調(diào)節(jié)機(jī)體血液運(yùn)行，繼而改善由血壓升高引起的頭痛、眩暈等高血壓癥狀[11]。本研究結(jié)果表明，電針雙側(cè)足三里能夠有效降低SHR的血壓，這和王珊珊[12]的研究結(jié)果類似。以往研究顯示，針刺降壓是多靶點(diǎn)的效應(yīng)，但具體機(jī)制不明。近年來，腸道菌群在調(diào)節(jié)血壓方面發(fā)揮重要作用，并鑒于足三里穴具有調(diào)節(jié)腸道的作用，因此我們研究了電針雙側(cè)足三里對(duì)腸道菌群的影響，以此探索與電針降壓可能相關(guān)的菌群機(jī)制。

腸道菌群被認(rèn)為是維持血壓穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素[13-14]。且越來越多的證據(jù)表明，腸道微生物在高血壓患者和高血壓動(dòng)物模型中發(fā)揮了重要作用[15-17]。有研究[15-16]顯示，與健康對(duì)照組比較，高血壓患者及高血壓動(dòng)物模型的腸道微生物豐度和多樣性均明顯降低。F/B值為評(píng)估腸道生理穩(wěn)態(tài)的生物標(biāo)志物。在自發(fā)性高血壓大鼠和血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓模型中，F(xiàn)/B值呈現(xiàn)顯著的升高趨勢(shì)，而F/B值增加被廣泛認(rèn)為是腸道穩(wěn)態(tài)失調(diào)的特征[16,18]。此外，糞菌移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將WKY的糞便移植給SHR后，SHR的腸道菌群顯著改善，血壓下降；而將SHR的糞便移植給WKY后，WKY的收縮壓和F/B值明顯增加。這進(jìn)一步證實(shí)了腸道菌群失調(diào)是造成高血壓的重要原因[19]。本研究顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠菌群多樣性降低，F(xiàn)/B值顯著升高，而通過電針干預(yù)后菌群多樣性有所增加，F(xiàn)/B值明顯降低，并與對(duì)照組水平趨于一致，結(jié)合PCoA分析中3組大鼠的物種構(gòu)成差異，表明電針在一定程度上能夠調(diào)節(jié)腸道菌群的結(jié)構(gòu)和組成，改善高血壓大鼠的腸道菌群紊亂。

進(jìn)一步分析顯示，模型組大鼠腸道微生物中乳酸產(chǎn)生菌（Lactobacillus、Turicibacter）豐度增加，這與以往報(bào)道結(jié)果一致[16,20]。在高血壓動(dòng)物模型中，乳酸產(chǎn)生菌顯著增加，且血漿乳酸水平與血壓升高有關(guān)[21-22]，經(jīng)電針干預(yù)后，乳酸產(chǎn)生菌明顯降低。此外，本研究顯示模型組大鼠Ruminococcus、Anaerostipes及Prevotellaceae_Ga6A1_group的豐度顯著降低，經(jīng)電針干預(yù)后豐度增加。研究表明，Ruminococcus可通過產(chǎn)生羥基類固醇脫氫酶，促進(jìn)次級(jí)膽汁酸石膽酸（Lithocholic acid，LCA）和脫氧膽酸（Deoxycholic acid，DCA）的生成[23]，而血漿LCA和DCA水平的增加有助于降低血壓[24-25]。Ruminococcus還能夠產(chǎn)生具有抗炎作用的丁酸鹽，為腸道上皮細(xì)胞提供能量，并通過各種機(jī)制維持腸道健康[26-27]。Anaerostipes亦可產(chǎn)生丁酸鹽，并能通過保護(hù)腸道屏障功能及發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用來維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，從而改善高血壓[28]。Prevotellaceae_Ga6A1_group能夠產(chǎn)生乙酸鹽。后者可抑制心肌肥大，改善心功能，減少心臟和腎臟纖維化，繼而緩解高血壓[29-30]。

綜上所述，本研究通過對(duì)SHR雙側(cè)足三里進(jìn)行電針干預(yù)，發(fā)現(xiàn)電針可能是通過改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)及組成，重塑腸道的動(dòng)態(tài)平衡，增加Ruminococcus、Anaerostipes、Prevotellaceae_Ga6A1_group等降壓相關(guān)的短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌的豐度，降低Lactobacillus、Turicibacter等乳酸產(chǎn)生菌的豐度，發(fā)揮降壓作用。后期還需對(duì)篩選出的可能與降壓相關(guān)的Ruminococcus、Anaerostipes、Prevotellaceae_Ga6A1_group靶菌進(jìn)行研究，并開展相關(guān)糞菌移植實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證電針改善后的腸道菌群和高血壓之間的因果關(guān)系，為電針降低血壓的腸道菌群機(jī)制提供依據(jù)。