劉萬杰，翟偉林，劉文斐，鄒家輝，張秋靈，黃各寧，梁艷坤

（1.廣州市從化區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州 510999；2.廣州開發(fā)區(qū)醫(yī)院，廣東 廣州 510730；3.南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510999；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510045）

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（gouty arthritis，GA）的發(fā)病率逐年上升，其以尿酸鹽和壞死組織為中心的痛風(fēng)結(jié)節(jié)和纖維性血管翳造成受累組織炎癥反應(yīng)及肉芽組織形成等[1-2]。隨著社會的發(fā)展，GA發(fā)病率逐年攀升，全球GA發(fā)病率為1%～15%[3]，GA帶來的慢性疼痛、殘疾及沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)可導(dǎo)致焦慮、抑郁和自殺情緒。然而，長期服用非甾體抗炎藥物及秋水仙堿的GA患者常出現(xiàn)胃腸道和心血管副作用[4-5]。晚期GA主要接受關(guān)節(jié)鏡或關(guān)節(jié)置換手術(shù)，但手術(shù)費(fèi)用高昂且術(shù)后并發(fā)癥多[6]。目前，GA的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確且治療方式尚未達(dá)成共識。因此，有必要深入挖掘GA的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，并為GA的精準(zhǔn)治療提供新的理論依據(jù)及診療指南。

竹葉石膏湯目前主要用于治療各種熱證、小兒疾病、GA等疾病[7]。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，竹葉石膏湯具有抗炎、解熱、抗菌等功效[8]。此外，CHOI S等[9]研究發(fā)現(xiàn)，竹葉提取物可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制TNF-α誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)，從而發(fā)揮抗血管性炎癥的作用。石膏主要成分為含水硫酸鈣，能抑制骨骼肌的興奮性，經(jīng)胃酸消化后成為可溶性鈣鹽，可減少血管滲透性，抑制滲出液的形成[10-11]。ZHAO J W等[12]研究發(fā)現(xiàn)，麥冬提取物4-O-去甲基麥冬苷元E可通過抑制絲裂原活化蛋白激酶信號傳導(dǎo)，降低一氧化氮和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)來發(fā)揮抗炎作用。YU T等[13]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rc有顯著的抗炎活性，可以通過靶向結(jié)合p38/激活轉(zhuǎn)錄因子-2（ATF-2）途徑抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生。另外，有研究[14-15]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rc還能抑制白介素-1β（IL-1β）處理的人軟骨細(xì)胞中MMP-13的表達(dá)，從而起到保護(hù)軟骨細(xì)胞的作用。而GA通過多種信號傳導(dǎo)途徑將胞外信號傳遞到胞內(nèi)，進(jìn)一步釋放炎癥因子、趨化因子介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)[16]。因此，竹葉石膏湯可能具有較強(qiáng)的抗GA作用。故本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測竹葉石膏湯的潛在藥理作用機(jī)制及其與GA相關(guān)靶點(diǎn)和通路的相互作用，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1 竹葉石膏湯有效活性成分及篩選鑒定 將竹葉石膏湯的組成藥物“竹葉”“生石膏”“半夏”“麥門冬”“人參”“甘草”“粳米”輸入中藥藥理學(xué)系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫（TCMSP）[17]及BATMANTCM[18]進(jìn)行搜索。生物利用度（oral bioavailability，OB）表示口服藥物被吸收進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)的速度和程度（包括藥物的生物利用度及利用速度）。類藥性（drug-likeness，DL）是一個(gè)基于現(xiàn)有藥物的理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)的概念，用于評價(jià)某一化合物與已知藥物的相似性。根據(jù)TCMSP/BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫常見的篩選標(biāo)準(zhǔn)及結(jié)合以往文獻(xiàn)結(jié)果[19-20]，選擇OB≥30%和DL≥0.18，或Score cutoff≥20，校正P＜0.05的活性成分進(jìn)行后續(xù)分析研究。

1.1.2 靶標(biāo)蛋白篩選及藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用TCMSP/BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫對篩選得到的藥物活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)查詢，并將篩選所得所有靶蛋白名稱導(dǎo)入DrugBank數(shù)據(jù)庫（https:∥www.drugbank.ca/）及UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）。設(shè)置物種為人類（Homo sapiens），對得到靶蛋白進(jìn)行比對和基因名校正，轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)的基因名，并刪除無對應(yīng)基因名的靶蛋白。得到的藥物活性成分并與活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)建立對應(yīng)關(guān)系。通過Cytoscape 3.7.2軟件得到藥物-活性成分-靶點(diǎn)交互作用網(wǎng)絡(luò)模型[19-20]。利用Cytoscape 3.7.2軟件中的“Network Analyze”功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析[21]，篩選得出核心活性成分及潛在靶基因。

1.1.3 GA基因表達(dá)譜獲取 在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）及OMIM數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/）中下載與GA相關(guān)的基因，篩選條件：（1）痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎；（2）人類；得到符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的與GA相關(guān)的基因集。

1.1.4 藥物活性成分-痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)交集及交互網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用在線韋恩圖制作網(wǎng)站Interacti Venn[22]（http://www.interactivenn.net/）對藥物活性成分靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)中共同的靶基因進(jìn)行韋恩圖展示，將得到的共同靶基因?qū)朐诰€分析網(wǎng)站STRING構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)[23]（protein-protein interaction，PPI）。利用Cytoscape 3.7.2軟件中的BisoGenet插件[23]分別構(gòu)建藥物活性成分靶點(diǎn)PPI及GA相關(guān)PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 3.7.2軟件中的“Network Analyze”功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，將藥物活性成分PPI和GA相關(guān)基因PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行合并，得到藥物活性成分和GA相關(guān)基因共有PPI網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.7.2軟件中的CytoNCA插件對藥物活性成分靶點(diǎn)與GA相關(guān)基因共有PPI進(jìn)行多中心網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)計(jì)算，并根據(jù)Degree、中介中心性（betweenness centrality，BC）、緊密中心度（closeness centrality，CC）、局部平均連通度中心性（local average connectivity-based，LAC）、鄰域連通性（neighborhood connectivity，NC）值的中位數(shù)值進(jìn)行篩選，得出竹葉石膏湯活性成分作用于GA的潛在核心靶基因。

1.1.5 靶基因GO/KEGG富集分析 為進(jìn)一步探討竹葉石膏湯活性成分對GA的潛在作用機(jī)制及共同靶基因的功能，利用R語言中的Bioconductor包、clusterProfiler包對上一步得到的靶基因進(jìn)行基因本體論（GO）和KEGG信號通路分析[24]。其中GO分析主要包括潛在靶基因的細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物學(xué)過程（biological process，BP）。同時(shí)利用pathview包繪制相應(yīng)的信號通路圖。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡SPF級雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量（257.1±10.01）g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)三元里校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2018-0034。飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動(dòng)物房，溫度為25 ℃，相對濕度為37%。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案及倫理審查獲廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會批準(zhǔn)（編號：20211212008）。

1.2.2 藥物與試劑 竹葉石膏湯，方藥組成：竹葉6 g，生石膏50 g，半夏9 g，麥門冬20 g，人參6 g，粳米10 g，甘草6 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供并經(jīng)唐洪梅主任中藥師鑒定為正品；秋水仙堿片（批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20113208）購于廣東彼迪藥業(yè)有限公司；戊巴比妥鈉（批號：811B025）購于北京索萊寶生物科技有限公司；尿酸鈉溶液（批號：CW2567）購于廣州市信洪貿(mào)易有限公司；熒光定量PCR試劑盒（批號：QP002）購于廣州復(fù)能基因有限公司；TRIzol試劑（批號：DP424）、cDNA合成試劑盒（批號：KR202-02）購于北京天根生化科技有限公司。

1.2.3 主要儀器 ST16型離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司）；SpectraMax iD5型多功能酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；Veriti Dx型熱循環(huán)儀（上海艾研生物科技有限公司）；StepOneTM熒光定量PCR儀（賽默飛世爾科技有限公司）；K5600型核酸微量分析儀（北京凱奧科技發(fā)展有限公司）。

1.2.4 造模與分組 通過簡單隨機(jī)分配法將36只大鼠分為空白組、模型組、秋水仙堿組、竹葉石膏湯組，每組9只；GA的急性動(dòng)物模型參考改良的Coderre法[25]。除空白組外，其他組大鼠在0.3%戊巴比妥鈉麻醉狀態(tài)下消毒后，在大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.1 mL尿酸鈉溶液（50 mg/mL）；空白組大鼠在相同的條件下注射0.1 mL生理鹽水。造模大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度、疼痛水平明顯高于空白組，并出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎的各種癥狀，則提示模型成功[25]。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)給藥 造模成功后6 h進(jìn)行灌胃給藥，按照《中藥藥理研究方法學(xué)》大鼠用藥為成人（60 kg體質(zhì)量）6.3倍進(jìn)行換算，竹葉石膏湯組大鼠灌胃給予竹葉石膏湯（0.5 g/kg）；秋水仙堿組大鼠灌胃給予秋水仙堿片懸濁液（0.3 mg/kg)；空白組及模型組大鼠灌胃給予等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)給藥14 d。

1.2.6 觀察指標(biāo)

1.2.6.1 踝關(guān)節(jié)直徑測量 使用游標(biāo)卡尺測量并記錄大鼠治療前后右側(cè)踝關(guān)節(jié)直徑。

1.2.6.2 血清尿酸檢測 給藥結(jié)束后，0.3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹正中切開，逐層鈍性分離至腹主動(dòng)脈清晰可見，采用一次性采血針采血，靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，收集血清，采用血生化儀檢測大鼠血清中尿酸含量。

1.2.6.3 踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA相對表達(dá)量 取大鼠右踝關(guān)節(jié)滑膜組織，按TRIzol試劑盒操作方法提前總RNA，隨后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒擴(kuò)充，嚴(yán)格按試劑盒操作步驟執(zhí)行，上機(jī)進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性5 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對表達(dá)情況，引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料通過Shapiro-Wilk進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，方差齊采用Bonferroi進(jìn)行兩兩比較。組內(nèi)治療前后比較采用配對t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 竹葉石膏湯的主要成分及潛在靶點(diǎn)獲取 篩選出竹葉石膏湯的主要化學(xué)成分147種。（見表2）去除重復(fù)并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)基因名轉(zhuǎn)換后，共得到584個(gè)作用人類的基因靶點(diǎn)。通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫共檢索到與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因223個(gè)，相匹配映射得到竹葉石膏湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)共40個(gè)。（見圖1）

圖1 竹葉石膏湯靶點(diǎn)與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)匹配韋恩圖

表2 竹葉石膏湯中部分活性化合物基本信息

2.2 構(gòu)建藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 利用Cytoscape 3.7.1，構(gòu)建竹葉石膏湯中藥物-活性化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)包含737節(jié)點(diǎn)，其中藥物節(jié)點(diǎn)7個(gè)、活性化合物節(jié)點(diǎn)147個(gè)和靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)584個(gè)，2 485條邊。圖中不同顏色及形狀代表不同含義：淺藍(lán)色四邊形代表竹葉石膏湯，彩色六邊形代表活性化合物，紫色菱形代表靶點(diǎn)基因。網(wǎng)絡(luò)中的每條邊代表藥物所含有的活性化合物及活性化合物與靶點(diǎn)基因之間的相互作用關(guān)系。（見圖2）

圖2 “竹葉石膏湯-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 “竹葉石膏湯-活性成分-基因靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過Cytoscape軟件，把上述獲得的竹葉石膏湯活性成分、靶點(diǎn)基因、疾病導(dǎo)進(jìn)軟件中，進(jìn)一步構(gòu)建“竹葉石膏湯-活性成分-靶點(diǎn)基因-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)。（見圖3）

圖3 “竹葉石膏湯-活性成分-靶點(diǎn)基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI及Hub蛋白確定 利用String在線數(shù)據(jù)庫，把痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)基因?qū)肫渲?，將未連接的靶點(diǎn)隱藏，進(jìn)一步獲得PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖4）。通過“Network Analyzer”工具，進(jìn)一步計(jì)算得出各作用靶標(biāo)的連接度。連接度最高的5個(gè)靶標(biāo)分別為白細(xì)胞介素受體相關(guān)激酶4（IRAK4）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、CXC基序趨化因子配體8（CXCL8）、CC基序趨化因子配體2（CCL2）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）。（見圖5）由此可知，上述5個(gè)靶標(biāo)在竹葉石膏湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮了重要作用，為潛在核心靶標(biāo)。進(jìn)一步證實(shí)了竹葉石膏湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是通過作用于多個(gè)靶標(biāo)而發(fā)揮多種效果。

圖4 蛋白相互作用PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖5 中藥-疾病核心靶標(biāo)的條圖

2.5 GO功能富集分析 GO功能富集分析結(jié)果顯示，竹葉石膏湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的核心基因的BP功能主要包括炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)等，CC的靶點(diǎn)主要富集在細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、囊泡腔、質(zhì)膜筏等，MF功能主要涉及細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性等。（見圖6）

圖6 GO 功能富集分析柱狀圖

2.6 KEGG通路富集分析 竹葉石膏湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎核心基因的KEGG通路主要涉及IL-17信號通路、TNF信號通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎信號通路、NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路、低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號通路等。（見圖7）

圖7 KEGG 通路富集分析氣泡圖（前20 的通路）

2.7 各組大鼠踝關(guān)節(jié)直徑比較 治療前，模型組、秋水仙堿組及竹葉石膏湯組大鼠踝關(guān)節(jié)直徑明顯大于空白組（P＜0.05），表明痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型造模成功。治療后，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)直徑與治療前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；秋水仙堿組及竹葉石膏湯組大鼠踝關(guān)節(jié)直徑明顯小于治療前（P＜0.05）；治療后，秋水仙堿組和竹葉石膏湯組大鼠踝關(guān)節(jié)直徑明顯小于模型組（P＜0.05）。表明秋水仙堿及竹葉石膏湯均可緩解GA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度。（見表3）

表3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)直徑比較 （±s，cm）

表3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)直徑比較 （±s，cm）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

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2.8 各組大鼠血清尿酸含量比較 與空白組比較，模型組大鼠血清尿酸含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，秋水仙堿組和竹葉石膏湯組大鼠血清尿酸含量均明顯降低（P＜0.05），且竹葉石膏湯組大鼠血清尿酸含量低于秋水仙堿組（P＜0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠血清尿酸比較 （±s，μmol/L）

表4 各組大鼠血清尿酸比較 （±s，μmol/L）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與秋水仙堿組比較，cP＜0.05。

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2.9 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA相對表達(dá)量比較 與空白組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA相對表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，秋水仙堿組和竹葉石膏湯組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA相對表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05），且竹葉石膏湯組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IRAK4 mRNA相對表達(dá)量低于秋水仙堿組（P＜0.05），而竹葉石膏湯組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-6 mRNA相對表達(dá)量與秋水仙堿組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表5）

表5 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA 相對表達(dá)量比較 （±s）

表5 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA 相對表達(dá)量比較 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與秋水仙堿組比較，cP＜0.05。

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3 討論

隨著生活水平的提高，且大眾的運(yùn)動(dòng)時(shí)間逐漸減少，GA的發(fā)病率逐年升高。然而，GA治療尚未達(dá)成共識，本研究基于生物信息學(xué)分析挖掘探索竹葉石膏湯治療GA的潛在有效活性成分、分子靶點(diǎn)及作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)竹葉石膏湯治療GA的潛在作用機(jī)制是“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的。同時(shí)本研究進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證竹葉石膏湯可以有效緩解GA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹，降低血清尿酸含量，并能抑制IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA的表達(dá)，為竹葉石膏湯治療GA提供了理論依據(jù)。

本研究通過構(gòu)建竹葉石膏湯-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析發(fā)現(xiàn)，竹葉石膏湯治療GA的潛在活性成分主要包括豆甾醇、山奈酚和維生素C等。FERRAZ-FILHA Z S等[26]研究發(fā)現(xiàn)，豆甾醇能夠通過抑制肝臟黃嘌呤氧化酶的活性來降低高尿酸血癥小鼠的血清尿酸水平，并能明顯降低尿酸單鈉鹽結(jié)晶引起的足部水腫，具有明顯的抗氧化活性。MISRA A等[27]發(fā)現(xiàn)山奈酚與秋水仙堿均具有抗痛風(fēng)活性，能抑制MSU激活NLRP3炎癥小體，從而抑制IL-1β釋放。此外，維生素C作為抗氧化劑可抑制TXNIP蛋白激活，從而減輕MSU引起的GA[28-29]。因此，竹葉石膏湯中的有效活性成分可能通過降低血清尿酸水平，并抑制NF-κB途徑減少炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而發(fā)揮減緩GA進(jìn)展的協(xié)同作用。

本研究通過將竹葉石膏湯靶點(diǎn)與GA的差異表達(dá)基因進(jìn)行相互映射得出40個(gè)潛在分子靶點(diǎn)，進(jìn)一步利用Cytoscape軟件中的Cytohubba、BisoGenet及CytoNCA插件得出竹葉石膏湯治療GA的潛在治療靶點(diǎn)。潛在靶點(diǎn)分別是IL-6、CXCL8、CCL2、IRAK4、IL-10。研究[30-31]發(fā)現(xiàn)，IL-6在GA患者關(guān)節(jié)滑膜及血清中表達(dá)升高，并能參與多種疾病的炎癥反應(yīng)，可促進(jìn)IL-1β及TNF-α等炎癥因子釋放，從而加速GA病變過程。SO A K等[32]研究發(fā)現(xiàn)，CXCL8是一種巨噬細(xì)胞分泌的趨化因子，主要作用于中性粒細(xì)胞募集與活化，從而激活炎癥反應(yīng)的發(fā)生。GRAINGER R等[33]研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥患者血清CCL2水平升高，從而導(dǎo)致循環(huán)中CD14+單核細(xì)胞增加，而CD14+單核細(xì)胞是GA發(fā)作期間最早遷移到炎癥部位的白細(xì)胞之一。研究發(fā)現(xiàn)，IL-10可作為抗炎因子抑制MSU誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞源性TNF-α和炎癥蛋白（MIP-1α和MIP-1β）的表達(dá)[34]。痛風(fēng)發(fā)作時(shí)，Toll樣受體4會被尿酸鹽結(jié)晶激活，進(jìn)一步逐漸活化下游的各級激酶，如IRAK4等進(jìn)行自身的磷酸化，最終活化核轉(zhuǎn)錄因子-κB，釋放IL-6等炎癥細(xì)胞因子，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[34]。本研究通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物驗(yàn)證了竹葉石膏湯可以有效抑制GA大鼠滑膜組織IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA的表達(dá)，減緩GA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹，降低GA大鼠血清尿酸。

本研究靶基因KEGG富集分析結(jié)果提示，炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對脂多糖、細(xì)菌侵襲及生物刺激的反應(yīng)、IL-17信號通路和TNF信號通路等可能是竹葉石膏湯治療GA的潛在作用途徑。研究[36-37]表明，GA是由先天免疫系統(tǒng)激活驅(qū)動(dòng)的典型炎癥性疾病，是MSU誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)引起的，主要由巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞介導(dǎo)，特別是NLRP3炎癥小體的激活，從而導(dǎo)致IL-1β和其他炎癥細(xì)胞因子的釋放。因此，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)是治療GA的關(guān)鍵。另外，RAUCCI F等[38]研究發(fā)現(xiàn)IL-17可能在MSU誘發(fā)的急性GA晚期階段起關(guān)鍵作用。此外，MSU可介導(dǎo)炎癥因子的釋放，激活NF-κB啟動(dòng)和調(diào)節(jié)TNF-α與炎性免疫反應(yīng)有關(guān)的炎癥介質(zhì)、黏附分子等相關(guān)基因的表達(dá)，從而加速GA的炎癥反應(yīng)。同時(shí)，竹葉石膏湯中的有效活性成分具有降低血清尿酸水平、減少M(fèi)SU堆積的作用，并能抑制NF-κB途徑減少炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，因此，推測竹葉石膏湯能發(fā)揮抑制尿酸鹽結(jié)晶形成、抗炎等作用機(jī)理起到治療或延緩GA病變過程。秋水仙堿能通過降低白細(xì)胞活動(dòng)、吞噬作用及減少乳酸形成，從而減少尿酸結(jié)晶的沉積，減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮止痛作用[39-40]。因此，本研究選擇秋水仙堿作為陽性對照藥物。本研究仍然存在局限性：（1）本研究GA動(dòng)物模型僅挑選核心靶點(diǎn)IRAK4及IL-6進(jìn)行驗(yàn)證，其他核心靶點(diǎn)及通路有待進(jìn)一步研究；（2）竹葉石膏湯有效成分復(fù)雜，具體何種成分起到治療GA的關(guān)鍵，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。

綜上所述，竹葉石膏湯可通過“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”有效抑制GA大鼠滑膜組織IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA的表達(dá)，減緩踝關(guān)節(jié)腫脹，降低血清尿酸，從而發(fā)揮對GA的治療作用。