戈雅倩，謝和兵,4，尼瑪次仁，白瑪?shù)┰?/p>

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.南通市海門(mén)長(zhǎng)三角藥物高等研究院，江蘇 南通 226133；3.江蘇神猴醫(yī)藥研究有限公司，江蘇 南通 226133；4.西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司，西藏 日喀則 857000）

三味檀香湯散，藏藥名為贊旦松湯，記載于《四部醫(yī)典》和《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥：第一冊(cè)》[1-2]。三味檀香湯散由檀香、肉豆蔻、廣棗組成，是藏醫(yī)治療心熱病的常用驗(yàn)方，具有清熱、寧心、安神的功效，可用于治療“寧彩”病及心臟病引起的心慌、胸悶、氣促、口干舌燥、目赤、胸背疼痛、心前區(qū)灼痛等，臨床療效顯著。研究表明其治療心血管疾病具有較好療效[3-8]。三味檀香湯散采用傳統(tǒng)的藏藥散劑生產(chǎn)工藝，將藥材生藥粉碎后直接入藥，存在微生物無(wú)法控制的不足。目前藏藥生產(chǎn)企業(yè)常用的濕熱、干熱滅菌方式，會(huì)導(dǎo)致檀香、肉豆蔻藥材中的揮發(fā)性活性成分損失，影響療效，不適用于本品的滅菌。本研究將電子束輻照用于藏藥的滅菌工藝，對(duì)自制三味檀香湯散進(jìn)行不同劑量的電子束輻照，通過(guò)比較輻照前后三味檀香湯散的性狀、顯微特征、指紋圖譜、有效成分含量變化及其微生物含量變化，考察電子束輻照技術(shù)對(duì)藏藥三味檀香湯散主要有效成分和滅菌效果的影響，旨在為藏藥三味檀香湯散的滅菌方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為含生藥材及揮發(fā)性藥材的中藥制劑的滅菌提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器 Essentia LC-16型高效液相色譜儀（配有SPD-16紫外檢測(cè)器）、UV-1900i型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；XSR205DU/AC型十萬(wàn)分之一天平（美國(guó)梅特勒托利多科技有限公司）；WMS-1037型生物光學(xué)顯微鏡（上海無(wú)陌光學(xué)儀器有限公司）；UC-250DE型超聲清洗儀（上海精其儀器有限公司）；TGL-16B型臺(tái)式高速離心機(jī)（常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）；DZ-10/20型電子直線加速器（安徽戈瑞電子科技股份有限公司）。

1.2 藥物與試劑 去氫二異丁香酚對(duì)照品（批號(hào)：17838-201804，純度：98.6%）、沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)：110831-201906，純度：91.5%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇（批號(hào)：20220221，色譜純）、磷酸（批號(hào)：20220321，優(yōu)級(jí)純）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為娃哈哈純凈水；肉豆蔻（批號(hào)：210501）、檀香（批號(hào)：210801）藥材均購(gòu)自安徽援康中藥飲片股份有限公司；廣棗（批號(hào)：20200301）購(gòu)自西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司。肉豆蔻、檀香、廣棗經(jīng)江蘇神猴醫(yī)藥研究有限公司研發(fā)部檢測(cè)為正品，符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典）》標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣本制備與輻照處理 分別取廣棗、肉豆蔻、檀香藥材粉碎，過(guò)二號(hào)篩，少量多次等比例混合均勻，分裝于鋁箔袋密封儲(chǔ)存，12 g/袋，即得自制三味檀香湯散樣品。所有樣品均由中廣核戈瑞科技有限公司采用電子束輻照滅菌處理，輻照劑量分別為2、4、6、8、10 kGy。

2.2 性狀比較 通過(guò)日光下目視、手觸、鼻嗅、口嘗的方式對(duì)三味檀香湯散粉末樣本外觀、色澤、氣味、味道等進(jìn)行考察。以未輻照樣本即0 kGy樣品為參照，所有粉末呈現(xiàn)棕色，質(zhì)柔軟，氣香濃烈，味辛辣、微苦。（見(jiàn)圖1）經(jīng)比較，輻照前后的樣品粉末在外觀、色澤、氣味上無(wú)明顯變化。

圖1 樣品性狀圖

2.3 顯微特征 分別取不同輻照劑量下的樣品少量置于載玻片上，滴加甘油醋酸試液，蓋上蓋玻片，置生物光學(xué)顯微鏡下觀察，所有樣品均可見(jiàn)大量晶纖維、淀粉粒，臍點(diǎn)明顯，導(dǎo)管碎片、內(nèi)果皮石細(xì)胞清晰可見(jiàn)，內(nèi)果皮石細(xì)胞內(nèi)含黃棕色物質(zhì)。（見(jiàn)圖2）說(shuō)明電子加速器輻照對(duì)三味檀香湯散的顯微鑒別無(wú)影響。

圖2 樣品顯微特征

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Ultimate XB-C18液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.05%磷酸（A）-甲醇（B），梯度運(yùn)行程序如下：0~60 min，10%B→100%B；60~65 min，100%B→10%B，65~70 min，10%B；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.4.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱定沒(méi)食子酸對(duì)照品10.01 mg、去氫二異丁香酚對(duì)照品10.02 mg，分別用甲醇溶解于10 mL量瓶中，定容、搖勻，制得質(zhì)量濃度分別為1.001 mg/mL、1.002 mg/mL的沒(méi)食子酸、去氫二異丁香酚對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取沒(méi)食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備液3.0 mL、去氫二異丁香酚對(duì)照品儲(chǔ)備液8.0 mL于同一25 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到?jīng)]食子酸、去氫二異丁香酚質(zhì)量濃度分別為0.120、0.321 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取三味檀香湯散約1 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入10 mL的70%甲醇溶液，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心5 min，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 將提取溶劑、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。（見(jiàn)圖3）提取溶劑作為空白，所得色譜圖在沒(méi)食子酸、去氫二異丁香酚保留時(shí)間處無(wú)干擾峰出現(xiàn)。沒(méi)食子酸、去氫二異丁香酚分別與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之間，理論塔板數(shù)按沒(méi)食子酸峰和去氫二異丁香酚峰大于3 000計(jì)。色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)符合含量測(cè)定要求。

圖3 HPLC 圖

2.4.5 線性關(guān)系考察 精密吸取沒(méi)食子酸和去氫二異丁香酚的混合對(duì)照品溶液0.10、0.50、1.50、3.00、4.50、6.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配成不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。分別以兩種成分的質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)X，色譜峰面積積分值為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸分析計(jì)算。結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸在0.001 20～0.072 00 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=3.83×107X－1.47×105（r=0.999 9）；去氫二異丁香酚在0.003 20～0.192 00 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=4.02×107X＋1.24×105（r=0.999 9）。（見(jiàn)圖4）

圖4 線性關(guān)系圖

2.4.6 精密度試驗(yàn) 按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備均勻供試品溶液。按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得沒(méi)食子酸成分峰面積的RSD（n=6）為0.65%，去氫二異丁香酚峰面積的RSD（n=6）為0.43%，表明儀器精密度良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取三味檀香湯散樣品，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在常溫放置0、2、4、9、14、24 h，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，沒(méi)食子酸峰面積的RSD（n=6）為1.02%，去氫二異丁香酚峰面積的RSD（n=6）為1.07%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取三味檀香湯散樣品，按“2.4.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得沒(méi)食子酸含量的RSD（n=6）為1.17%，去氫二異丁香酚含量的RSD（n=6）為0.76%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的三味檀香湯散樣品6份，每份約0.5 g，精密稱定。分別精密加入已知含量的混合對(duì)照品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算沒(méi)食子酸和去氫二異丁香酚的平均加樣回收率和RSD值。（見(jiàn)表1）

表1 加樣回收率結(jié)果 （n=2）

2.4.10 樣品測(cè)定 取不同劑量輻照后的三味檀香湯散樣品，按“2.4.3”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。外標(biāo)法計(jì)算沒(méi)食子酸和去氫二異丁香酚含量，運(yùn)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，不同劑量輻照后的三味檀香湯散的主要有效成分沒(méi)食子酸和去氫二異丁香酚含量與未輻照樣本（0 kGy輻照）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（見(jiàn)表2）

表2 樣品的含量測(cè)定結(jié)果 （n=3）

2.5 指紋圖譜相似度考察 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”對(duì)所得色譜圖進(jìn)行處理，以0 kGy供試品色譜圖為參照，經(jīng)過(guò)多點(diǎn)校正、全譜峰匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜R。（見(jiàn)圖5）樣品相似度結(jié)果均≥0.996。（見(jiàn)表3）

表3 樣品指紋圖譜相似度

圖5 樣品的指紋圖譜

2.6 微生物限度檢測(cè) 參照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則1105微生物計(jì)數(shù)法、1106控制菌檢查法和1107非無(wú)菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（需氧菌總數(shù)≤2×103cfu/g，霉菌、酵母菌總數(shù)≤200 cfu/g，控制菌大腸埃希菌不得檢出），對(duì)三味檀香湯散樣品粉末的細(xì)菌菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)及大腸菌群進(jìn)行隨機(jī)抽樣檢查。（見(jiàn)表4）結(jié)果顯示，三味檀香湯散樣品經(jīng)過(guò)輻照后細(xì)菌菌落數(shù)、霉菌和酵母菌菌落總數(shù)均降低（P<0.05），大腸菌群在輻照前后均未檢出；當(dāng)輻照劑量為4 kGy時(shí)，微生物限度已滿足規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)達(dá)到6 kGy及以上時(shí)微生物均未檢出。

表4 樣本的微生物限度檢測(cè)結(jié)果 （n=2）

3 討論

3.1 電子束輻照應(yīng)用于藏藥滅菌的優(yōu)勢(shì) 藏醫(yī)藥是祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)璀璨的一脈，更是傳統(tǒng)文化的重要組成部分，傳承發(fā)展意義重大，但受高原地區(qū)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展等因素的制約，藏藥存在劑型單一、質(zhì)控水平低等不足。傳統(tǒng)藏藥制劑多以生品藥粉直接入藥制成丸劑、散劑[9]，導(dǎo)致產(chǎn)品微生物限度很難符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定。

電子束輻照滅菌可利用電子加速器產(chǎn)生的高能電子束照射物料達(dá)到殺滅微生物的目的[10]。與傳統(tǒng)的鈷-60輻照比較，電子束輻照滅菌具有輻照束流定向、能量利用充分、不產(chǎn)生核廢料、無(wú)環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)。隨著國(guó)內(nèi)電子加速器制造技術(shù)的不斷進(jìn)步，電子束輻照在中藥、醫(yī)療器械、食品、衛(wèi)生材料滅菌領(lǐng)域廣泛使用[11-15]，但對(duì)藏藥的輻照滅菌研究較少[16]。此外，電子束輻照滅菌與目前常規(guī)使用的濕熱、干熱、紫外線、環(huán)氧乙烷滅菌等比較，最大的優(yōu)勢(shì)在于電子束輻照屬于冷滅菌技術(shù)，不改變物料的溫度，并且穿透性高，滅菌效率高，尤其適用于含生藥材粉末及揮發(fā)性成分較多的藏藥滅菌[17]。

3.2 主要有效成分的選擇 現(xiàn)代藥理研究表明，沒(méi)食子酸是廣棗藥材的主要有效成分之一，具有保護(hù)心血管、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗炎、抗氧化等作用[18-22]。去氫二異丁香酚是肉豆蔻藥材的主要有效成分之一，具有較強(qiáng)的抑菌、抗炎、抑制肝內(nèi)脂質(zhì)氧化等作用[23-25]。同時(shí)，二者也是2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的藥材含量測(cè)定指標(biāo)成分[26]，因此，本研究選擇去氫二異丁香酚和沒(méi)食子酸作為本品的主要有效成分。

3.3 含量測(cè)定方法學(xué)研究 本研究采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)（190～700 nm）掃描，結(jié)果顯示沒(méi)食子酸在270 nm處有最大吸收；去氫二異丁香酚在274nm處有最大吸收，在270 nm處也有較大吸收。綜合二者吸收峰走勢(shì)與分別在270 nm和274 nm處的吸收值測(cè)定結(jié)果變化情況，本研究選擇270 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。本研究在流動(dòng)相優(yōu)選時(shí)分別考察了磷酸-甲醇溶液和醋酸-甲醇溶液的分離效果，前者所得樣品峰分離度明顯優(yōu)于后者，故選擇磷酸-甲醇溶液作為流動(dòng)相。主要指標(biāo)成分沒(méi)食子酸與去氫二異丁香酚的極性差異較大，采用單一流動(dòng)相無(wú)法將兩者分離，并呈現(xiàn)于同一張色譜圖，故本研究采用梯度洗脫的方式，同時(shí)對(duì)兩種成分進(jìn)行定量測(cè)定。

3.4 輻照劑量的選擇 本研究遵循2015年國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》，設(shè)置2、4、6、8、10 kGy的輻照劑量梯度，以確保中藥的安全、有效、質(zhì)量穩(wěn)定。通過(guò)與未輻照樣品比較，當(dāng)輻照劑量為2 kGy時(shí)，微生物含量明顯下降。當(dāng)輻照劑量為4 kGy時(shí)，微生物含量即可滿足《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，殺菌效果顯著，且該劑量對(duì)主要有效成分含量無(wú)明顯影響，指紋圖譜相似度≥0.996。

4 結(jié)論

不同劑量的電子束輻照對(duì)藏藥三味檀香湯散的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯影響，且可明顯降低藥材的微生物水平。輻照劑量為4 kGy時(shí)可達(dá)到良好的滅菌效果。因此，電子束輻照滅菌是一種有效控制藏藥三味檀香湯散微生物水平的方法，并對(duì)藥品質(zhì)量無(wú)明顯的影響。本研究可為藏藥三味檀香湯散的輻照滅菌工藝提供參考，同時(shí)也為含有生藥的藏成藥制劑的滅菌提供新思路。此外，本研究建立了高效液相色譜梯度洗脫法同時(shí)對(duì)三味檀香湯散中的指標(biāo)成分沒(méi)食子酸、去氫二異丁香酚進(jìn)行定量測(cè)定，可用于三味檀香湯散的質(zhì)量評(píng)價(jià)，并為本品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。