王艾琳，謝 瑜，王 青，聶孝平，譚文波，劉益智

（1.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005；2.湖南新匯醫(yī)藥有限公司，湖南 長沙 410203）

防風為傘形科防風Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根，最早由《神農(nóng)本草經(jīng)》收載。防風被稱為“療風之要藥”[1]，具有祛風解表、勝濕止痛、止痙的功效[2]?！侗静菥V目》記載“防風炙赤研末”[3]，治療崩中漏下?！堕L沙藥解》中描述防風炭具有“斷漏下，崩中”之效，多用于治療崩漏、腸風便血[4]，與防風炭善于止血[5]功效一致。我院臨床常用制劑品種復方芩柏顆粒（湘藥制備字Z20210444000）中防風炭為臣藥，年使用量較大，其炮制工藝對該特色制劑的質(zhì)量具有重要影響。目前防風炭被廣東等4省市的中藥飲片炮制規(guī)范所收載[6]，除性狀鑒別外，無其他檢測指標，難以保證“炒炭存性”[7]的質(zhì)量要求。防風中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷等成分具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗凝血作用[8-9]，其炒炭后的藥效物質(zhì)變化有待研究。本研究采用正交設計結(jié)合層次分析，以升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷和升麻素的含量，以及浸出物含量、外觀性狀進行加權(quán)評分，優(yōu)選防風炭的炒制溫度、炒制時間及砂用量，為企業(yè)大生產(chǎn)提供技術(shù)參考，為制定防風炭質(zhì)量標準及保證我院制劑品種臨床療效提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥與試劑 防風飲片購自安徽省亳州市，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院王青主任藥師鑒定為傘形科防風Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根。升麻素苷對照品（批號：MUST-22022704，純度：98.42%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品（批號：MUST-22072610，純度：99.66%）、升麻素對照品（批號：MUST-22062117，純度：99.33%）、亥茅酚苷對照品（批號：MUST-220071618，純度：98.69%）均購自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇為色譜純；實驗用水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器 Agilent-1260型高效液相色譜儀（安捷倫儀器設備有限公司）；AG-285型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler公司）；B23ZH水分測定儀[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇中大儀器科技有限公司）；KQ-100B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HA640非接觸式紅外測溫儀（武漢優(yōu)信科技有限公司）；FW177中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；JYDC/50電磁炒藥機（石家莊佳月機械制造有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：依利特C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：甲醇-水，梯度洗脫（見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫條件

2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取亥茅酚苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素和升麻素苷對照品適量，依次置于25 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，制成亥茅酚苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素和升麻素苷質(zhì)量濃度分別為0.776、0.825、0.850、0.811 mg/mL的單一成分對照品儲備液。精密吸取各成分對照品儲備液適量，用甲醇稀釋成每毫升含亥茅酚苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素和升麻素苷分別為11.634、24.756、29.764、64.864 μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 防風炭供試品溶液的制備 取防風炭細粉約0.5 g，精密稱定，置25 mL具塞錐形瓶中，加入80%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（250 W，50 kHz）45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，收集續(xù)濾液，即得。

2.3.2 防風供試品溶液的制備 取防風約0.5 g，參照“2.3.1”防風炭供試品溶液的制備方法進行制備。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液、防風供試品溶液、防風炭供試品溶液各10 μL，按照“2.1”項色譜條件，注入高效液相色譜儀，測定并記錄色譜圖。結(jié)果顯示，防風及防風炭供試品與對照品相應保留時間處有一相同的色譜峰，且其他雜質(zhì)無干擾，與相鄰色譜峰分離度大于1.5，理論板數(shù)不少于4 000。（見圖1）

圖1 HPLC 圖譜

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 分別吸取“2.2”項下對照品儲備液，加適量甲醇逐級稀釋到不同濃度。升麻素苷質(zhì)量濃度依次為16.216、48.648、64.864、81.080、121.620、162.160μg/mL；5-O-甲基維斯阿米醇苷質(zhì)量濃度依次為8.252、16.504、24.756、41.260、66.016、82.520 μg/mL；亥茅酚苷質(zhì)量濃度依次為3.878、7.756、11.634、23.268、31.024、38.780 μg/mL；升麻素質(zhì)量濃度依次為8.504、17.008、29.764、42.520、68.032、85.040 μg/mL。分別精密吸取10 μL進樣，按照“2.1”項下色譜條件，測定峰面積，以對照品濃度（X，μg/mL）為橫坐標，以峰面積（Y）為縱坐標，分別繪制標準曲線。得升麻素苷的線性回歸方程為Y=17.708X+3.475 1（r=0.999 9）；5-O-甲基維斯阿米醇苷的線性回歸方程為X=19.829X+2.272 6（r=0.999 9）；亥茅酚苷的線性回歸方程為X=24.725X+0.401 1（r=0.999 9）；升麻素的線性回歸方程為Y=27.961X-3.976 7（r=0.999 9）。

2.5.2 精密度試驗 精密吸取防風炭供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定并記錄峰面積。結(jié)果升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、升麻素的峰面積RSD分別為0.43%、0.49%、0.50%、0.46%。表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取防風炭供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，常溫條件下分別在0、2、4、8、12、24 h后依次進樣，測定并記錄峰面積。結(jié)果升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、升麻素的峰面積RSD分別為0.85%、0.18%、1.07%、0.29%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復性試驗 精密稱取防風炭細粉6份，按“2.3”項下方法制成供試品溶液，按“2.1”項色譜條件分別測定。結(jié)果升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、升麻素的平均含量分別為0.276%、0.129%、0.054%、0.054%；RSD分別為0.94%、0.99%、0.53%、1.03%。表明該測定方法重復性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 稱取防風炭細粉約0.25 g，精密稱定，共6份，分別加入各成分對照品儲備液，即升麻素苷0.9 mL、5-O-甲基維斯阿米醇苷0.4 mL、亥茅酚苷0.15 mL和升麻素0.15 mL，按“2.3”項下方法制備樣品，按“2.1”項色譜條件進行含量測定，計算加樣回收率。升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、升麻素的平均加樣回收率分別為98.17%、98.00%、98.14%、98.21%，RSD分別為0.73%、1.10%、1.03%、1.04%。結(jié)果表明該方法的準確度良好。（見表2）

表2 防風炭中4 種化學成分的加樣回收率試驗結(jié)果

2.6 炮制工藝優(yōu)化

2.6.1 不同炮制工藝對比 取4份防風飲片，各200 g，分別將200 g防風以230 ℃清炒6.0 min，260 ℃清炒4.0 min，230 ℃砂炒4.0 min，260 ℃砂炒3.5 min 4種方法進行炒制，性狀符合《廣東省中藥炮制規(guī)范》（2011年版）“外表面焦黑色，切面焦褐色，氣焦香”[5]的標準。按“2.3”項下方法制成供試品溶液，按“2.1”項色譜條件分別測定升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷和升麻素的含量。結(jié)果顯示，與清炒法比較，砂炒法各有效成分含量均較高，且所需時間少，故進一步優(yōu)選砂炒法工藝參數(shù)。（見表3）

表3 清炒法與砂炒法指標成分含量比較

2.6.2 多指標綜合加權(quán)評分法 根據(jù)層次分析法的原理[10-11]，利用Spss Statistics 27應用軟件，將綜合OD值設為決策目標，將外觀性狀和浸出物、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、升麻素的含量賦值權(quán)重系數(shù)，設定方案層。通過“判斷矩陣”，在6個備選方案中，評價兩兩方案的重要程度，分析結(jié)果符合一致性，數(shù)據(jù)無邏輯矛盾，最終確定升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、升麻素、浸出物的含量和外觀性狀的權(quán)重系數(shù)分別為11.396%、11.947%、5.032%、29.933%、4.445%、37.247%，加權(quán)綜合評分，計算綜合OD值。

2.6.3 正交實驗設計 依據(jù)單因素試驗，篩選出砂炒溫度（A）、時間（B）、砂用量（C）為主要考察指標，設計L9（34）正交試驗，因素水平見表4。

表4 因素與水平表

2.6.3.1 防風炭的制備 取9份防風飲片，各200 g，按照L9（34）正交試驗表安排砂炒防風炭。取凈砂于炒制容器內(nèi)，用武火炒制滑利狀態(tài)，測定中心砂表面溫度達到規(guī)定溫度后，加入防風，翻炒至規(guī)定時間，出鍋，去砂，冷卻。

2.6.3.2 防風炭的性狀與收率 對“2.6.3.1”項下炮制的9批防風炭，依據(jù)《廣東省中藥炮制規(guī)范》（2011年版）性狀描述：“外表面焦黑色……切面焦褐色，有放射狀紋理，氣焦香”[5]進行評分，評分標準。（見表5）防風炭得率=防風炭質(zhì)量/防風質(zhì)量×100%。（見表6）

表5 防風炭外觀性狀評分表

表6 防風炭炮制結(jié)果

2.6.3.3 防風炭水分和浸出物含量測定 取“2.6.3.1”項下制備的防風炭樣品，分別依據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》第四部通則中醇溶性浸出物測定法和水分測定（烘干法）[12]，測定防風炭浸出物含量和水分。炮制結(jié)果見表6。

2.6.3.4 防風炭含量測定 取“2.6.3.1”項下制備的防風炭樣品，按“2.3”項下方法制成防風炭供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別測定升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷和升麻素的含量。（見表7）

表7 防風炭含量測定結(jié)果 （n=3）

2.6.4 數(shù)據(jù)處理與分析 外觀性狀評價是判斷中藥飲片質(zhì)量的直觀標準，但難以保證飲片質(zhì)量的均一性及穩(wěn)定性。根據(jù)“2.6.2”項確定的各指標權(quán)重系數(shù)，計算綜合OD值。綜合OD值=（11.396%×mAi/mAmax＋29.933%×mBi/mBmax+11.947%×mCi/mCmax＋5.032%×mDi×mDmax+4.445%i×mE/mEmax+37.247%×mFi/mFmax）×100，其中A~F分別為升麻素苷含量、升麻素含量、5-O-甲基維斯阿米醇苷含量、亥茅酚苷含量、浸出物含量及外觀評分。結(jié)果表明，各因素對炒炭結(jié)果的影響程度為A＞C＞B；方差結(jié)果分析得到，溫度對炒炭工藝有顯著影響。（見表8~9）通過最大綜合OD值與正交試驗結(jié)果雙重評價，得到最佳工藝參數(shù)為A1B2C3，即待2.4 kg凈砂炒至中心砂表面溫度為230 ℃，投入防風飲片200 g，翻炒3.5 min，篩去砂，放涼。

表8 正交試驗設計與結(jié)果

表9 方差分析表

2.7 工藝驗證試驗 按照最佳工藝進行3批防風炭砂炒工藝的驗證試驗，將12倍量（即60 kg）凈砂加入炒藥機，用武火炒制滑利狀態(tài)，待砂中心表面溫度達230 ℃，投入防風5 kg，翻炒3.5 min，篩去砂、放涼。測得升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、升麻素的平均含量分別為0.327%、0.124%、0.053%、0.065%，RSD值分別為1.03%、1.22%、0.98%、1.56%。所得3批防風炭外觀性狀均符合要求，表明該防風炭的炮制工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

本研究通過對比在230、260 ℃的炮制溫度下，砂炒法所需時間較清炒法少0.5～2 min，且升麻素苷、升麻素成分的含量分別高出清炒法15.07%、7.41%以上。本研究確定了防風炭砂炒工藝，突破傳統(tǒng)清炒[13-14]制炭的壁壘，以河砂作為傳熱介質(zhì)，具有增加受熱面積、縮短炒制時間、保證受熱均勻的優(yōu)勢[15]，解決了清炒時間長造成含量減少的問題。選用直徑2 mm左右的河砂，可減少河砂進入防風炭斷面皮部裂隙。防風于230 ℃砂炒，其升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷逐步分解或轉(zhuǎn)化；其中升麻素苷及升麻素隨溫度升高分解速率加快，在290 ℃時含量降低幅度超過40%，難以控制炒制時間，容易灰化，故不宜在較高溫度下進行防風炭炮制。

防風炭具備“炭藥”與“存性”的雙重要求：在外形上保留防風“外表面縱皺紋及點狀細根痕，斷面裂隙”，并具備炭類藥的“外表面焦黑色，斷面焦褐色，具焦香味”[5]。防風中5-O-甲基維斯阿米醇苷和升麻素苷，發(fā)揮解熱作用，并具有抗血小板聚集和抗凝作用[8,16]。炒炭，使升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷成分減少，故走氣分（解表和抗凝作用）減弱，而偏于入血分（止血）。升麻素為體內(nèi)的主要代謝形式[17-18]，可能與產(chǎn)生止血作用有一定聯(lián)系，故在層次分析法中將升麻素評分權(quán)重加大。研究表明，亥茅酚苷的鎮(zhèn)痛等作用，與藥效呈正相關[19-20]。因此，建議將升麻素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷作為防風炭質(zhì)量評價指標。

本研究考察回流提取和超聲提取2種方式，發(fā)現(xiàn)超聲45 min的條件下操作便捷，有效成分溶出率較大；對不同濃度甲醇（50%、80%、100%）進行考察，結(jié)果表明80%甲醇提取的樣品中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷等成分含量較高；以甲醇-水為流動相進行梯度洗脫，各色譜峰的分離度較好。

本研究利用層次分析法合理設定各指標評價系數(shù)，在性狀特征符合標準的基礎上，結(jié)合含量檢測，優(yōu)選炒制方法，優(yōu)化砂炒工藝，最終確定防風飲片砂炒制炭的可行性及優(yōu)勢，并為企業(yè)生產(chǎn)提供工藝參考。建立HPLC法同時測定防風炭中4種色原酮類成分含量，該方法易操作，各成分分離度、穩(wěn)定性、準確性良好，體現(xiàn)了中藥多成分、多層次、多通路的作用特點，可為防風炭質(zhì)量標準的建立提供實驗依據(jù)。