李雋永,謝金利,邱瓊?cè)A,毛桂福,張新林,韋 倩,梁學(xué)政*

(1.柳州市中醫(yī)醫(yī)院/柳州市壯醫(yī)醫(yī)院 藥學(xué)部,廣西 柳州 545001;2.柳州市中藥(壯瑤藥)制劑研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 柳州 545001;3.柳州市中藥(壯瑤藥)制劑開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心,廣西 柳州 545001;4.柳州市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心,廣西 柳州 545001)

外感止咳露是我院常用的醫(yī)院制劑,由防風(fēng)、前胡、桔梗、苦杏仁、甘草、荊芥、薄荷等多味藥材組成,具有疏風(fēng)清熱、止咳化痰的功效,臨床上常用于風(fēng)熱咳嗽、咳痰、頭痛、咽痛等,療效較好,廣泛用于本院及醫(yī)聯(lián)體單位,使用量大。由于該制劑已有20多年歷史,初申報(bào)時(shí)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單,鑒別項(xiàng)為簡(jiǎn)單的理化鑒別,缺乏專屬性,同時(shí)也缺乏含量測(cè)定項(xiàng)目,難以滿足當(dāng)下日益嚴(yán)格的藥品監(jiān)管和生產(chǎn)質(zhì)量監(jiān)控要求。為保證患者用藥的安全、有效,使產(chǎn)品質(zhì)量有據(jù)可依,需要對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提升。本研究通過(guò)對(duì)外感止咳露中防風(fēng)、前胡、薄荷進(jìn)行薄層色譜(TLC)鑒別;以甘草酸為參照,建立了5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷和甘草酸含量測(cè)定的HPLC“一測(cè)多評(píng)”法[1-3],旨在達(dá)到全面控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的,為提高外感止咳露的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

紫外分析儀(齊威儀器有限公司)、超聲清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)、高效液相色譜儀(日本島津,LC-20AT[SPD-M20A])、高效液相色譜儀(日本島津,LC-20AT[SPD-20A])、e2695高效液相色譜儀(Waters)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津,UV-2450)、電子分析天平(瑞士梅特勒,XS205DU)、電子分析天平(瑞士梅特勒,AE200)、超純水器(普析,GWB-2E)。

1.2 藥品與試劑

薄荷腦(批號(hào)110728-201707)、白花前胡甲素(批號(hào)200113),購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;升麻素苷(批號(hào)MUST-20022711,含量:98.42%)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號(hào)MUST-20050410,含量99.91%)、甘草酸(批號(hào)MUST-20042407,含量:99.50%),購(gòu)于成都曼斯特有限公司;薄層板(青島海洋化工有限公司);乙腈、甲醇為色譜純(弗頓);外感止咳露(每瓶裝250mL,批號(hào)20200201、20201101、20201201、20210102、20210103、20210201),由柳州市中醫(yī)醫(yī)院(柳州市壯醫(yī)醫(yī)院)制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 防風(fēng) 取外感止咳露50mL濃縮至20mL,加正丁醇20mL萃取2次。正丁醇液合并蒸干,加乙醇1mL制成供試品溶液[4-5]。用乙醇溶解升麻素苷對(duì)照品,制成1mg·mL-1的對(duì)照品溶液。按外感止咳露處方工藝,制備成缺防風(fēng)的陰性試樣,按上述樣品處理方法同法處理制成陰性對(duì)照溶液。取供試品溶液4μL、升麻素苷對(duì)照品溶液2μL、陰性對(duì)照溶液4μL點(diǎn)于硅膠薄層板GF254,展開(kāi)劑為三氯甲烷-甲醇(8∶2),最后在紫外燈254nm下檢視。供試品色譜與對(duì)照品色譜在相同位置上顯同樣的藍(lán)紫色熒光斑點(diǎn),陰性未見(jiàn)干擾。見(jiàn)圖1。

注:1.外感止咳露(20200201);2.外感止咳露(20201101);3.外感止咳露(20201201);4.升麻素苷對(duì)照品(批號(hào)MUST-20022711);5.缺防風(fēng)陰性樣品。

2.1.2 前胡 取外感止咳露30mL以乙酸乙酯50mL萃取,萃取液蒸干后加甲醇1mL制成供試品溶液[6]。用甲醇溶解白花前胡甲素對(duì)照品,制成1mg·mL-1的對(duì)照品溶液。按外感止咳露處方工藝,制備成缺前胡的陰性試樣,按上述樣品處理方法同法處理,制成陰性對(duì)照溶液。取供試品溶液10μL、對(duì)照品溶液2μL、陰性對(duì)照溶液10μL點(diǎn)于硅膠G薄層板,展開(kāi)劑為三氯甲烷-乙酸乙酯-丙酮(10∶1∶1),最后噴以20%高氯酸乙醇溶液,熱風(fēng)吹干后在紫外燈365nm下檢視。供試品色譜與對(duì)照品色譜在相同位置上顯同樣的熒光斑點(diǎn),陰性未見(jiàn)干擾。見(jiàn)圖2。

注:1.外感止咳露(20200201);2.外感止咳露(20201101);3.外感止咳露(20201201);4.白花前胡甲素對(duì)照品(批號(hào)200113);5.缺前胡陰性樣品。

2.1.3 薄荷 取外感止咳露250mL,提取揮發(fā)油,取提取出的油水混合物,用石油醚(60～90℃)20mL萃取2次,石油醚液合并自然揮干至1mL,制成供試品溶液[7]。用石油醚(60～90℃)溶解薄荷腦對(duì)照品,制成2mg·mL-1的對(duì)照品溶液。按外感止咳露處方工藝,制備成缺薄荷的陰性試樣,按上述樣品處理方法同法處理,制成陰性對(duì)照溶液。取供試品溶液5μL、對(duì)照品溶液8μL、陰性對(duì)照溶液5μL點(diǎn)于硅膠G薄層板,展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(10∶3),最后噴以1%香草醛硫酸溶液-乙醇(1∶4)的混合液,在105℃加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品色譜與對(duì)照品色譜在相同的位置上顯同樣顏色的斑點(diǎn),陰性未見(jiàn)干擾。見(jiàn)圖3。

注:1.外感止咳露(20200201);2.外感止咳露(20201101);3.外感止咳露(20201201);4.薄荷腦對(duì)照品(批號(hào)110728-201707);5.缺薄荷陰性樣品。

2.2 HPLC一測(cè)多評(píng)法測(cè)定升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸的含量

2.2.1 色譜條件 Welch Ultimate AQ-C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-0.05%磷酸水(B),梯度洗脫:0～15min,15%(A);15～20min,15%～20%(A);20～30min,20%～30%(A);30～35min,25%～30%(A);35～40min,30%～42%(A);40～50min,42%(A);50～55min,42%～15%(A);55～60min,15%(A);體積流量1mL·min-1;測(cè)定波長(zhǎng)為254nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量10μL。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸對(duì)照品適量,以甲醇溶解并定容,即得混合對(duì)照溶液(5-O-甲基維斯阿米醇苷107.0μg·mL-1、升麻素苷123.5μg·mL-1、甘草酸263.4μg·mL-1)。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取供試品溶液5mL至50mL量瓶中,加水稀釋至刻度,過(guò)濾即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液制備 按外感止咳露處方工藝制成缺防風(fēng)和缺甘草的陰性試樣;按“2.1.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性與專屬性考察 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10μL,進(jìn)樣分析,結(jié)果見(jiàn)圖4。5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸的分離度均>1.5,各色譜峰的理論塔板數(shù)均在10 000以上。陰性對(duì)照無(wú)干擾,說(shuō)明所用方法專屬性良好。

注:1.升麻素苷;2.5-O-甲基維斯阿米醇苷;3.甘草酸。1.prim-O-glucosylcimifugin;2.5-O-methylvisammioside;3.glycyrrhizic acid。

2.2.6 線性關(guān)系、檢測(cè)限與定量限考察 將混合對(duì)照品溶液制成6個(gè)不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液,進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),對(duì)照品質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X),進(jìn)行線性回歸。分別取3種對(duì)照品溶液逐步稀釋進(jìn)樣,以S/N=3時(shí)的濃度為檢測(cè)限,以S/N=10時(shí)的濃度作為定量限。見(jiàn)表1。

表1 3種成分的線性關(guān)系

2.2.7 精密度試驗(yàn) 吸取供試品溶液(批號(hào)20210201),進(jìn)樣6次,記錄峰面積。5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸峰面積的RSD分別為0.96%、0.46%、1.31%,表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取供試品溶液(批號(hào)20210201),間隔0、4、8、12、24、36h 進(jìn)樣,記錄峰面積。5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸峰面積的RSD分別為0.11%、0.10%、0.19%,表明穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)20210201),分別制成6份供試品溶液,進(jìn)樣。5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸含量的RSD分別為1.26%、1.67%、0.29%。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取樣品(批號(hào)20210201)溶液9份,每份2.5mL,分成3組,每組3份,分別添加5-O-甲基維斯阿米醇苷70.62μg·mL-1、升麻素苷148.20μg·mL-1、甘草酸237.20μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液2.0、2.5、3.0mL,按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,并分別計(jì)算回收率。5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸的回收率分別為100.7%、97.3%、103.2%,RSD分別為2.68%、2.63%、1.37%,表明試驗(yàn)回收率良好。

2.2.11 相對(duì)校正因子(fk/s)的計(jì)算 采用多點(diǎn)校正法,最終fk/s以6個(gè)不同質(zhì)量濃度點(diǎn)的fk/s平均值確定。

計(jì)算公式為fk/s=(Cs×Ak)/(Ck×As)

Ck′=(Cs×Ak′)/(fk/s×As)

Cs:參照物質(zhì)量濃度

As:參照物峰面積

Ck:其他對(duì)照成分質(zhì)量濃度

Ak:其他對(duì)照成分峰面積

Ak′:待測(cè)成分峰面積

得出甘草酸與5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷相對(duì)的fk/s。結(jié)果見(jiàn)表2。升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的fk/s分別為3.229、3.286,RSD分別為0.18%、0.09%。

表2 以甘草酸為參照的fk/s(多點(diǎn)校正法)

2.2.12fk/s的重現(xiàn)性考察 本研究考察了3套色譜系統(tǒng)(LC-20AT(SPD-M20A)、LC-20AT(SPD-20A)、Waters e2695)和4根不同色譜柱(Welch Ultimate AQ-C18、Orca C8、Welchrom-C18、Agilent-C18)對(duì)fk/s的影響,結(jié)果見(jiàn)表3。顯示不同儀器和不同色譜柱對(duì)升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的fk/s影響較小,說(shuō)明該fk/s有良好的重現(xiàn)性。

表3 不同儀器和不同色譜柱下的fk/s

2.2.13 待測(cè)組分色譜峰的定位 以甘草酸為基準(zhǔn)峰,計(jì)算5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷在不同色譜柱和不同儀器下的相對(duì)保留時(shí)間,結(jié)果見(jiàn)表4。表4顯示不同色譜柱和不同儀器下的各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間變化較小,RSD均<3.0%,表明本方法利用甘草酸來(lái)定位升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的色譜峰,具有可行性。

表4 不同色譜柱和不同儀器下的各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間

2.2.14 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較 分別用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算其含量,結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果顯示,使用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法測(cè)定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量,其結(jié)果差異較小,RSD均<2.0%,即以甘草酸為參照,使用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的方法,具有可行性,且準(zhǔn)確度較高。

表5 外感止咳露中3種成分不同方法定量測(cè)定結(jié)果 (RSD<3%)

3 討論

3.1 TLC鑒別

外感止咳露配制工藝中,對(duì)薄荷、荊芥的揮發(fā)油進(jìn)行了單獨(dú)提取,揮發(fā)油是外感止咳露疏散風(fēng)熱、利咽止咳的重要起效物質(zhì)[8-9],其含有的薄荷腦能發(fā)揮清涼鎮(zhèn)咳、抗病毒等作用。通過(guò)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn),薄荷和荊芥之間并不存在陰性干擾[10],因此選擇薄荷中的薄荷腦作為一個(gè)鑒別指標(biāo)。防風(fēng)具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎作用[11];前胡具有祛痰、鎮(zhèn)咳、平喘等作用[12],兩者均為外感止咳露中的君藥,故選擇薄荷、防風(fēng)、前胡作為TLC鑒別項(xiàng),具有代表性。

本研究對(duì)各TLC鑒別均進(jìn)行了系統(tǒng)耐用性考察,考察了不同廠家的薄層板(自制薄層板、青島海洋薄層板)、不同點(diǎn)樣量、不同點(diǎn)樣方式(圓點(diǎn)狀、條狀)、不同溫度(4℃、25℃)、不同濕度(32%、60%、88%)。結(jié)果顯示,各TLC鑒別在各條件下斑點(diǎn)清晰,各陰性對(duì)照均未出現(xiàn)干擾。

3.2 含量測(cè)定

本研究采用HPLC一測(cè)多評(píng)法測(cè)定5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷、甘草酸的含量,將水、甲醇、乙醇、三氯甲烷、乙醚作為提取溶劑進(jìn)行考察。結(jié)果顯示,三氯甲烷、乙醚提取效率最差,水、甲醇和乙醇提取效果差異不大,為節(jié)約成本,故選擇以水為溶劑。采用190～400nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,結(jié)果顯示,5-O-甲基維斯阿米醇苷和升麻素苷在254nm處有最大吸收峰,甘草酸在254nm處吸收峰也較大,故選定254nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。在流動(dòng)相的選擇上,考察了乙腈-水體系和甲醇-水體系等不同流動(dòng)相對(duì)供試品的分離效果,結(jié)果顯示,使用乙腈-0.05%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫,各成分分離效果好,且洗脫出的成分多。

本研究選取君藥防風(fēng)中的5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷作為指標(biāo)成分,這是因?yàn)楝F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示,防風(fēng)中的5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷具有顯著的解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、調(diào)節(jié)身體免疫功能等作用[13-14],是本制劑發(fā)揮療效的主要成分,而甘草中的甘草酸具有的抗炎、抗病毒[15-16]等作用,也與制劑功效息息相關(guān),故選擇此三者作為該制劑的指標(biāo)成分。一測(cè)多評(píng)法的使用,使多個(gè)成分檢測(cè)化繁為簡(jiǎn),節(jié)約了檢驗(yàn)成本。本研究以甘草酸作為參照物,建立一測(cè)多評(píng)法測(cè)定各成分含量,所測(cè)結(jié)果與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果具有較高的一致性,可信度高,說(shuō)明可以運(yùn)用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定該制劑中3個(gè)有效成分的含量。

本研究通過(guò)TLC法和HPLC一測(cè)多評(píng)法建立了外感止咳露的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),有助于較全面地監(jiān)控制劑質(zhì)量。