閆強 胡亞群 薛冬 周琰琰 丁佩 韋雅雯 袁星星 陳新

摘要：由于缺乏有效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，導致基因編輯技術在綠豆中的應用受到極大限制，也使綠豆基因功能研究受到極大阻礙。因此，建立一套基于發(fā)根農(nóng)桿菌的操作簡便、快速且高效的綠豆嵌合植株轉(zhuǎn)化技術，可以為綠豆基因功能研究提供技術支撐。首先在CRISPR/Cas9載體骨架中插入1個綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）表達框用于陽性發(fā)狀根的快速篩選，然后將含有靶標基因gRNA的CRISPR/Cas9質(zhì)粒導入發(fā)根農(nóng)桿菌K599。菌液注射侵染綠豆幼苗植株下胚軸，評價K599在綠豆中誘導發(fā)狀根發(fā)生及CRISPR/Cas9系統(tǒng)在綠豆轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根組織中的效率。結(jié)果顯示，K599菌液侵染種植7d的綠豆幼苗植株并在保濕條件下培養(yǎng)3周可在侵染點誘導發(fā)狀根產(chǎn)生，此嵌合植株在切除原生根后可在霍格蘭培養(yǎng)液中正常生長且培養(yǎng)1周后即可用于后續(xù)檢測。用GFP篩選的結(jié)果顯示，陽性發(fā)狀根占比約為（57.8±10.0）%。隨機選擇15個熒光檢測陽性的轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根組織，利用測序檢測靶位點的編輯效果，結(jié)果顯示有10個靶位點的序列發(fā)生了突變，突變比例達到67%，其中堿基缺失突變9個，堿基轉(zhuǎn)換突變1個。由本研究結(jié)果可知，利用該方法可以在無菌組織培養(yǎng)的條件下于4周內(nèi)獲得目的基因編輯的轉(zhuǎn)基因組織，極大地便利了綠豆分子水平上的功能研究，也為其他尚缺乏穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系的作物進行基因功能研究提供了參考。

關鍵詞：綠豆；CRISPR/Cas9；基因編輯；發(fā)狀根轉(zhuǎn)化；遺傳轉(zhuǎn)化；綠色熒光蛋白

中圖分類號：S522.01文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）10-0048-06

綠豆是我國傳統(tǒng)的雜糧作物，其種子含有豐富的人體易消化蛋白、纖維、維生素B和多種礦物微量元素等營養(yǎng)成分，同時還具有清熱解毒、消炎殺菌等藥理作用，是一種備受消費者喜歡的藥食同源類食用豆類作物［1-2］。綠豆由于其生育期短（60～75d）、抗逆性強及共生固氮的能力，是輪作和救災備荒的優(yōu)良作物。近年來，隨著我國農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和人民生活水平的不斷提高，綠豆在滿足人們?nèi)找嬖鲩L的健康多元化飲食的需求及精準扶貧、產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮著重要作用。

基于序列特異性核酸酶的基因組編輯技術在過去10年內(nèi)發(fā)展迅速，并徹底改變了生命科學研究的各個領域［3］。與早期開發(fā)的鋅指核酸酶（ZFNs）技術和類轉(zhuǎn)錄因子效應物核酸酶（TALENs）技術相比，規(guī)律成簇的間隔短回文重復相關蛋白技術（CRISPR/Cas9）利用1個向?qū)NA（gRNA）對靶基因位點進行特異性識別，并在Cas9蛋白作用下對靶點DNA進行切割，斷裂的DNA雙鏈通過非同源末端連接、同源重組方式進行修飾，在此過程中實現(xiàn)對靶點序列的編輯［4］。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由于載體構(gòu)建簡單、編輯效率高等優(yōu)點，已被作為一種便捷有效的工具而廣泛應用，目前在幾十種模式植物和作物中的應用均有相關報道［5-7］。在豆科植物中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功用于百脈根、大豆、苜蓿、豇豆的基因編輯［8-11］。但在綠豆中，CRISPR/Cas9介導的基因編輯目前尚沒有相關報道。

目前，主流方案是利用農(nóng)桿菌將包含CRISPR/Cas9元件的質(zhì)粒通過遺傳轉(zhuǎn)化的方法導入宿主細胞［3］。雖然已有研究發(fā)現(xiàn)，用綠豆的初生葉片、下胚軸等作為外植體成功獲得了轉(zhuǎn)基因株系，并對侵染條件、培養(yǎng)基激素配方進行了積極探索［12-14］，但是這些報道的方法仍存在效率低、可重復性差的問題，綠豆的遺傳轉(zhuǎn)化在國內(nèi)尚沒有成功的報道。由此可見，缺乏成熟高效的遺傳轉(zhuǎn)化方法是限制CRISPR/Cas9基因編輯技術在綠豆中應用的關鍵限制因素。

為了建立一套快速便捷的綠豆基因編輯技術體系，本研究擬探索發(fā)根農(nóng)桿菌介導的嵌合植株轉(zhuǎn)化技術在綠豆中的適用性，并對CRISPR/Cas9系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根組織中的編輯效率進行評價，從而為綠豆基因功能研究提供技術支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料

蘇綠1號綠豆種植在裝有蛭石和營養(yǎng)土混合物（體積比為2∶1）的小花盆中，澆水后放置在溫室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設置為光—暗周期16h—8h，溫度為26℃。種植第3天澆水，培養(yǎng)7d待真葉剛剛展開時用于農(nóng)桿菌侵染。

本氏煙草（Nicotianabenthamiana）育苗后移栽到上述同樣營養(yǎng)土中，并在相同條件下培養(yǎng)5～6周用于外源基因的瞬時表達。試驗材料在2021年3—7月分批播種于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物智能生長室內(nèi)。

1.2載體構(gòu)建

利用在線軟件CRISPR（http：//crispor.tefor.net/crispor.py）在Vradi03g01240基因第1個外顯子區(qū)域選擇gRNA。首先將gRNA及其反向互補序列分別融合在引物U6-gRNA-F、U6-gRNA-R的5′端，并在引物pSCM-U6-F、pSCM-U6-R的5′端分別融合質(zhì)粒pSCNcoⅠ上游、XbaⅠ下游同源序列。然后以pGmU6質(zhì)粒為模板，用pSC-U6-F/U6-gRNA-R、U6-gRNA-F/pSC-U6-R2對引物搭配擴增，獲得大小分別為500、200bp的片段，最后利用諾維贊多片段重組試劑盒將片段與NcoⅠ、XbaⅠ雙酶切線性化的pSC質(zhì)粒重組，獲得載體pSC-gRNA。為便于陽性發(fā)狀根的篩選，以pBIN-GFP4載體為模板，用引物GFP-F/GFP-R擴增包含CaMV35S啟動子、綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）閱讀框、終止子的完整表達框，并通過同源重組的方法分別插入pSC-gRNA的BstEⅡ位點處，至此完成載體pSC-GFP-gRNA、pSC-GFP的構(gòu)建，其中pSC-GFP作為空載體對照。載體構(gòu)建過程中所用的引物序列見表1。

1.3綠豆發(fā)狀根的轉(zhuǎn)化

將質(zhì)粒pSC-GFP-gRNA、pSC-GFP通過凍融法轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599感受態(tài)細胞中，利用引物pSC-seq-F/RPCR擴增驗證陽性克隆。將陽性克隆在含有50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中于28℃、200r/min培養(yǎng)36h；待菌液渾濁后，吸取200μL菌液均勻涂布在加有卡那霉素的LB平板上并在28℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；第2天用涂布棒收集菌體至10mmol/LMgCl2溶液（含有40mg/L乙酰丁香酮）中，并調(diào)節(jié)D600nm至0.5～0.6。

綠豆幼苗培養(yǎng)7d時，待真葉完全展開后用于發(fā)根農(nóng)桿菌侵染。首先用手術刀在子葉節(jié)處往下劃1個長約1cm的傷口，然后用移液器往傷口處滴加適量侵染菌液。將侵染處理完畢的植株放置于用透明塑料布做成的密封罩中，并保持罩內(nèi)濕度在90%以上。每日檢查罩內(nèi)濕度情況直至發(fā)狀根長出2～5cm，從侵染傷口處往下約1cm處用剪刀將植株莖剪斷，將剪下的植株放置于霍格蘭營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。此時得到的嵌合植株由非轉(zhuǎn)基因的莖、葉片及含有部分轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根組織組成。待根長至5～7cm時，在宏觀熒光變倍顯微鏡下進行熒光篩選，并用鑷子小心去除無GFP的根，然后將此嵌合植株放回培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)試驗。

1.4DNA的提取和編輯位點的序列分析

利用基因組提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取轉(zhuǎn)pSC-GFP-gRNA質(zhì)粒發(fā)狀根組織的基因組。用特異性引物Test-F/R擴增包含gRNA在內(nèi)的附近基因組片段，將獲得的片段電泳驗證后送擎科生物技術有限公司進行測序。獲得相應序列后利用ClustalX軟件進行多序列比對并利用GeneDoc進行可視化處理。

1.5煙草葉片的瞬時表達和熒光觀察

將質(zhì)粒pSC-GFP-gRNA、pSC-GFP通過凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞中，經(jīng)菌落PCR驗證后在含有50mg/L卡那霉素、30mg/L利福平的液體LB培養(yǎng)基中于28℃、200r/min條件下培養(yǎng)48h；在4000r/min離心5min收集菌體，用10mmol/LMgCl2溶液（含有40mg/L乙酰丁香酮）清洗3遍后調(diào)節(jié)D600nm至0.5～0.6。用1mL注射器將侵染液注射進煙草葉片中，將處理過的植物放回培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)48h后用于熒光觀察。切取注射區(qū)域煙草葉片置于共聚焦顯微鏡下，在488nm波長激發(fā)光下觀察熒光并拍照。

2結(jié)果與分析

2.1GFP標記的綠豆基因CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建

用在線軟件CRISPR在Vradi03g01240基因第1個外顯子區(qū)域49～68個核苷酸處設計gRNA（圖1-A），將gRNA片段插入載體pSC-IAA14上并進一步完成pSC-GFP-IAA14載體的構(gòu)建，此載體由大豆GmU6啟動子驅(qū)動gRNA表達，同時含有1個由大豆GmUbi3啟動子驅(qū)動的dpCas9表達框及用于熒光篩選的CaMV-35S驅(qū)動的GFP表達框（圖1-B）。

為了驗證插入CRISPR載體中的GFP表達框是否能夠正常表達，用煙草瞬時表達系統(tǒng)對GFP信號進行檢測。結(jié)果顯示，將pSC-GFP-gRNA、pSC-GFP在煙草葉片中瞬時表達后，均能夠觀察到強烈的熒光信號（圖2），說明改造的載體中的GFP能夠在植物體內(nèi)正常表達。

2.2綠豆嵌合植株的獲得

從圖3-A至圖3-I可以看出，用含有pSC-GFP-gRNA載體的發(fā)根農(nóng)桿菌K599在綠豆幼苗子葉節(jié)處進行侵染，結(jié)果顯示，誘導產(chǎn)生了發(fā)狀根組織。保濕處理1周后，侵染點組織變得明顯膨大（圖3-E）；保濕處理2周后，侵染位點繼續(xù)膨大并形成瘤狀的愈傷組織（圖3-F）；保濕處理3周后，侵染點處陸續(xù)有發(fā)整根形成（圖3-G）；待大部分根長至2～5cm時，從侵染傷口處往下約1cm處用剪刀將植株莖剪斷，剪下的植株置于霍格蘭營養(yǎng)液

中繼續(xù)培養(yǎng)（圖3-H）。待根長至5～7cm時（圖3-I），在宏觀熒光變倍顯微鏡下進行熒光篩選，并用鑷子小心去除無GFP的根（圖4）。經(jīng)統(tǒng)計，發(fā)出綠色熒光的發(fā)狀根比例約為（57.8±10.0）%，然后將處理完畢的植株放回培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，進行進一步的檢測，此植株具有野生型的莖、葉器官，發(fā)狀根組織為轉(zhuǎn)基因部分。

2.3轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根組織基因編輯效果檢測

為了檢測獲得的嵌合植株發(fā)狀根組織中Vradi03g01240基因是否被成功編輯。隨機選擇15個熒光檢測陽性的轉(zhuǎn)化pSC-GFP-gRNA發(fā)狀根組織提取基因組DNA。用特異性引物Test-F/R擴增gRNA附近序列，結(jié)果顯示，對照和敲除的轉(zhuǎn)基因組織均擴增出了符合預期大小為706bp的條帶（圖5）。對條帶進行測序的結(jié)果顯示，15個獨立的轉(zhuǎn)基因事件中，有10個gRNA附近序列發(fā)生了突變，突變比例約為67%（圖6）。突變類型表現(xiàn)如下：小片段的堿基缺失9個，占突變總數(shù)的90%；堿基轉(zhuǎn)換突變1個，占突變總數(shù)的10%。以上結(jié)果表明，本研究中使用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以對綠豆基因進行有效的編輯，創(chuàng)制多樣性的突變類型。

3討論與結(jié)論

CRISPR/Cas9基因編輯技術是目前應用廣泛的基因編輯技術，為基因功能研究和作物改良提供了大量突變材料［15-17］。本研究在前人基礎上，將應用于大豆基因編輯的遺傳轉(zhuǎn)化載體進行了進一步優(yōu)化［18］，添加了GFP篩選標記，以便后續(xù)的陽性轉(zhuǎn)基因材料篩選鑒定。本研究以綠豆Vradi03g01240基因為目的基因進行基因編輯載體的構(gòu)建，通過對熒光篩選過的發(fā)狀根組織進行測序分析，發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9基因編輯的效率達到67%，其中90%的靶標基因gRNA區(qū)域發(fā)生了缺失突變。本研究結(jié)果充分證明了該CRISPR/Cas9系統(tǒng)在綠豆發(fā)狀根

系統(tǒng)中的適用性。

基于發(fā)根農(nóng)桿菌介導的根毛轉(zhuǎn)化體系目前已被廣泛用于難以轉(zhuǎn)化或尚缺乏有效穩(wěn)定轉(zhuǎn)化技術手段的植物進行基因功能驗證［19］。發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導的發(fā)狀根轉(zhuǎn)化技術在豆科作物大豆、菜豆、豇豆中都得到了成功的利用［11，20-21］。發(fā)狀根瞬時轉(zhuǎn)化技術能夠?qū)蜻x基因進行快速的功能驗證，本系統(tǒng)在4周內(nèi)即可獲得用于試驗的轉(zhuǎn)基因材料，而且熒光篩選結(jié)果表明陽性轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根比例達到50%以上。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化雖然具有更加穩(wěn)定的遺傳背景和一致的表型，但往往需要一年甚至更久才能拿到轉(zhuǎn)基因材料，尤其目前綠豆尚缺乏行之有效的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化技術體系。本研究證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠在綠豆體內(nèi)進行有效的基因編輯，創(chuàng)制大量的目的基因突變類型，發(fā)狀根轉(zhuǎn)化技術目前可作為研究綠豆基因功能的一個優(yōu)異替代方案。本研究的方案能夠大大提高綠豆根系發(fā)育、根瘤形成、鹽堿非生物脅迫以及根部病蟲害等相關分子機制研究的速度和質(zhì)量。

致謝：感謝南京農(nóng)業(yè)大學喻徳躍教授惠贈pGmU6、pSC基因編輯載體，南京農(nóng)業(yè)大學竇道龍教授惠贈pBIN-GFP4載體。

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