莊偉霞 鄭冰 王謀鋒

隨著醫(yī)學(xué)信息學(xué)的發(fā)展，其分支生物信息學(xué)在臨床各種疾病尤其是腫瘤方面的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)日益凸顯。利用各類基因數(shù)據(jù)庫資源和各種計(jì)算機(jī)分析技術(shù)從微觀層面幫助解決臨床醫(yī)療問題已成為普遍趨勢(shì)。癌癥的治療及預(yù)后是臨床最關(guān)注的問題。而肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球癌癥死亡的第二大原因，且由于HCC 早期缺乏典型臨床癥狀和有效的診斷方法，大多數(shù)HCC 患者被診斷時(shí)已為晚期，再加上HCC 遺傳異質(zhì)性強(qiáng)、疾病發(fā)展迅速等，常導(dǎo)致患者治療效果不佳，預(yù)后較差[1]。目前已有研究關(guān)注與HCC 預(yù)后相關(guān)的基因。盡管基因芯片數(shù)量龐大、數(shù)據(jù)面廣，但信息混雜、實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)有限，精準(zhǔn)性有待驗(yàn)證。本研究在此背景下通過生物信息技術(shù)對(duì)HCC 基因芯片篩選得出差異表達(dá)基因，通過各種分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與HCC 預(yù)后相關(guān)的樞紐基因，以期為HCC 的精準(zhǔn)治療提供有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 篩選差異表達(dá)基因從GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中獲得GSE101685 和GSE 14520 的基因表達(dá)譜，GSE101685 基因表達(dá)譜納入24 份HCC 樣本和16 份正常肝組織，GSE14520 基因表達(dá)譜納入22 份HCC 樣本和14 份正常肝組織，以校正后的P<0.05 和|log2FC|>1 為依據(jù)，使用limma R包（http：//www.bioconductor.org/）識(shí)別每個(gè)數(shù)據(jù)集中的差異表達(dá)基因。然后，利用Venn 在線工具獲取兩個(gè)數(shù)據(jù)集之間的重疊基因。

1.2 通過GO 和KEGG 進(jìn)行功能和通路富集分析使用聚類分析器R 包對(duì)DEGs 進(jìn)行GO 的功能分析和KEGG 的通路分析。它們參與生物過程（BP）、分子功能（MF）、細(xì)胞成分（CC）和通路的相關(guān)信息可以通過P<0.05 來識(shí)別。

1.3 DEGs 的蛋白質(zhì)相互作用分析與樞紐基因的鑒定為研究DEGs 在蛋白質(zhì)水平上的相互作用，使用STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了DEGs（https：//string-db.org/）的PPI 網(wǎng)絡(luò)。只有與置信度評(píng)分>0.4 的交互作用被認(rèn)為是顯著性的。Cytoscape 軟件可將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化，節(jié)點(diǎn)間的程度是使用Cytoscape 的插件Cytohubba 來確定的。采用3 種拓?fù)浞椒êY選Cytoscape 的細(xì)胞插件中的重疊基因，即為樞紐基因。最后通過Venn 在線工具確定重疊的樞紐基因。

1.4 樞紐基因與HCC 預(yù)后相關(guān)的分析GEPEA 在線工具（http：//gepia.cancer-pku.cn/）可以檢測(cè)樞紐基因的mRNA 水平及其與疾病分期的關(guān)系；HPA（https：//www.proteinatlas.org/）可以評(píng)估HCC 和正常肝組織中樞紐基因的蛋白水平，Kaplan-Meier 繪圖儀數(shù)據(jù)庫（https：//kmplot.com/analysis/）可以分析樞紐基因與HCC 預(yù)后的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 GSE101685 與GSE14520 的DEGs 的鑒定從GEO 數(shù)據(jù)庫中獲得了2 個(gè)HCC 基因表達(dá)譜（GSE101685、GSE14520）。然后，將基因表達(dá)數(shù)據(jù)歸一化，用limmaR 包（調(diào)整后的P<0.05 和|log2FC|>1）。GSE101685 和GSE14520 的結(jié)果分別顯示在火山圖中（圖1A、1B）。分別從GSE101685 和GSE14520 中篩選出了994 個(gè)和826 個(gè)DEGs。兩個(gè)數(shù)據(jù)集之間重疊的DEGs 包含443 個(gè)基因，如Venn 圖（圖1C）所示。

圖1 GSE101685 和GSE14520 的火山圖及韋恩圖

2.2 GO 和KEGG 分析結(jié)果為進(jìn)一步闡明DEGs的功能及其與通路的關(guān)系，使用聚類分析器R 包對(duì)443 個(gè)DEGs 進(jìn)行了GO 功能分析和KEGG 通路分析。結(jié)果表明，進(jìn)行富集分析后的DEGs 在參與生物工程中與小分子分解代謝過程、羧酸分解代謝過程、有機(jī)酸代謝過程、脂肪酸代謝過程等顯著相關(guān)（圖2A）。在基因分子功能上DEGs 與輔助因子結(jié)合、輔酶結(jié)合、單加氧酶活性和雙吡咯結(jié)合顯著相關(guān)（圖2B）。除CC 外，DEGs 還特別富集于含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)、紡錘體、血液微粒和MCM 復(fù)合物中（圖2C）。此外，KEGG 通路分析結(jié)果顯示，DEGs 在細(xì)胞周期、化學(xué)致癌、脂肪酸降解、藥物代謝-細(xì)胞色素P450 和DNA 復(fù)制等方面富集（圖2D）。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及樞紐基因的鑒定利用STRING 數(shù)據(jù)庫，通過構(gòu)建組合評(píng)分>0.4 的PPI 網(wǎng)絡(luò)，在蛋白質(zhì)水平上分析重疊的DEGs 之間的相互作用。利用Cytoscape 軟件構(gòu)建DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)，包括408 個(gè)節(jié)點(diǎn)和3 586 條邊（圖3A）。根據(jù)最大團(tuán)中心性、程度和中間性3 種拓?fù)浞治龇椒?，利用上述PPI 網(wǎng)絡(luò)中的 Cytoscape 插件鑒定了樞紐基因。用不同方法列出了前30 個(gè)樞紐基因的排序，見表1。通過在線Venn 工具檢測(cè)4 個(gè)重疊的樞紐基因CCNB1、CDK1、MAD2L1 和NCD80 并進(jìn)一步分析（圖3B）。

表1 前30 個(gè)樞紐基因的排序

圖3 共同DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖

2.4 對(duì)選定的4 個(gè)樞紐基因進(jìn)行再分析使用GEPIA 在線工具進(jìn)一步驗(yàn)證4 個(gè)樞紐基因的表達(dá)。HCC 樣本中CCNB1、CDK1、MAD2L1 和NCD80 的表達(dá)水平顯著高于正常組織（圖4A）。此外，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)樞紐基因在不同的HCC 階段均存在顯著差異（圖4B），說 明CCNB1、CDK1、MAD2L1 和NCD80可能具有作為HCC 治療生物靶點(diǎn)的潛力。此外，在HPA 數(shù)據(jù)庫中驗(yàn)證了除NCD80 外的4 個(gè)樞紐基因中的3 個(gè)。免疫組化結(jié)果顯示，HCC 樣本中CCNB1、CDK1 和MAD2L1 蛋白水平高于正常組織（圖5）。利用Kaplan-Meier 在線繪圖儀工具，發(fā)現(xiàn)選定的樞紐基因與HCC 患者的預(yù)后相關(guān)。CCNB1、CDK1、MAD2L1 和NCD80 的高表達(dá)水平與較差的總生存期顯著相關(guān)（圖6）。

圖4 樞紐基因mRNA 表達(dá)水平及不同臨床階段表達(dá)分析圖

圖5 HPA 在線工具驗(yàn)證樞紐基因的蛋白表達(dá)水平圖

圖6 4 個(gè)樞紐基因在患者中的預(yù)后分析圖

3 討論

HCC 是一種常見的惡性腫瘤，但由于存在診斷較晚、易復(fù)發(fā)和治療耐藥性高等復(fù)雜問題，HCC 患者的無進(jìn)展生存率、總生存率仍不理想。因此，迫切需要探索有效的HCC 診斷生物標(biāo)志物和其治療靶點(diǎn)。生物信息學(xué)的發(fā)展為從數(shù)千個(gè)基因中篩選出參與HCC 發(fā)生和發(fā)展的幾個(gè)關(guān)鍵基因提供了一種有效途徑。這些基因可能作為HCC 潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

本研究選擇GSE101685 和GSE14520 來鑒定HCC 與正常肝組織之間的DEGs。依據(jù)P<0.05 和|logF2C|>1 共鑒定出443 個(gè)DEGs，GO 功能分析和KEGG 富集分析結(jié)果表明，DEGs 與MCM 復(fù)合物、脂肪酸降解、細(xì)胞周期和DNA 復(fù)制有關(guān)。先前的研究表明，脂肪酸降解的紊亂與腫瘤的發(fā)生或進(jìn)展有關(guān)。游離脂肪酸的代謝重編程可以加速腫瘤的轉(zhuǎn)移[2，3]。細(xì)胞周期和DNA 復(fù)制與細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)，它們的失調(diào)與包括HCC 在內(nèi)的多種癌癥有關(guān)[4，5]。

利用PPI 網(wǎng)絡(luò)對(duì)DEGs 進(jìn)一步分析，篩選出4 個(gè)重疊的樞紐基因CCNB1、CDK1、MAD2L1 和NDC80，這些基因與正常肝組織相比，在HCC 組織中均明顯不受調(diào)控。此外，我們還應(yīng)用GEPIA 進(jìn)一步驗(yàn)證了這些關(guān)鍵基因在HCC 中的表達(dá)水平。GEPIA 數(shù)據(jù)庫的結(jié)果表明，這些樞紐基因不僅具有與生物信息學(xué)分析相同的表達(dá)趨勢(shì)，而且與HCC分期相關(guān)。此外，我們注意到，KM 法顯示CCNB1、CDK1、MAD2L1 和NDC80 高表達(dá)的HCC 患者的生存結(jié)果更差。這些結(jié)果提示這4 個(gè)樞紐基因可能在HCC 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

參與有絲分裂的CCNB1 是細(xì)胞周期G2/M 過渡階段的一個(gè)轉(zhuǎn)換器。敲除CCNB1 可抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[6]，而CCNB1 的激活促進(jìn)了HCC 的增殖[7]。細(xì)胞周期和物質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的失調(diào)有助于HCC 的發(fā)生[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，HCC 中CCNB1 的上調(diào)預(yù)示著更差的總生存期和無病生存期[9]。Lnc00312 可以通過靶向CCNB1 誘導(dǎo)G2/M 細(xì)胞周期阻滯來抑制HCC 細(xì)胞的增殖，說明CCNB1 具有作為HCC 治療靶點(diǎn)的潛力。其他一些研究也證實(shí)，CCNB1 可能是術(shù)后HBV 相關(guān)HCC 復(fù)發(fā)的候選生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)[10]。因此，靶向CCNB1 可能是HCC 治療的另一種選擇。

CDK1 作為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的一員，在細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用，并已被報(bào)道與包括HCC 在內(nèi)的多種癌癥的起始和進(jìn)展有關(guān)[11]。既往文獻(xiàn)顯示，與正常肝組織相比，CDK1 在HCC 中顯著上調(diào)，且CDK1 的高表達(dá)與HCC 的不良預(yù)后相關(guān)[10，12]。乙肝病毒X 蛋白[13]和熱休克蛋白90 的抑制[14]可通過cdk1 介導(dǎo)的G2/M 細(xì)胞周期阻滯和凋亡來抑制HCC 的生長。通過miR378 下調(diào)CDK1可以通過誘導(dǎo)G2/M 細(xì)胞周期阻滯來抑制HCC 的增殖[15]，提示CDK1 可能是HCC 的潛在治療靶點(diǎn)。此外，一些研究人員證實(shí)，CDK1 抑制劑RO3306 可以提高索拉非尼治療在肝癌臨床前模型中的療效[16]。

MAD2L1 作為有絲分裂紡錘體組裝檢查點(diǎn)的一個(gè)組成部分，維持染色體的穩(wěn)定性并參與細(xì)胞周期。MAD2L1 的失調(diào)導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，從而可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生和發(fā)展[17]。根據(jù)以往的報(bào)道，MAD2L1 在包括胃癌在內(nèi)的多種癌癥中均高表達(dá)，并與腫瘤分期有關(guān)[18]。MAD2L1 對(duì)部分腫瘤具有重要的預(yù)后價(jià)值，而MAD2L1 的高表達(dá)提示預(yù)后較差。MAD2L1 的異常表達(dá)與HCC 的腫瘤分期、鄰近器官浸潤及預(yù)后相關(guān)。過表達(dá)miR-200c-5p 通過抑制HCC 的增殖和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抗腫瘤作用，過表達(dá)MAD2L1 可以抵消miR-200c-5p 過表達(dá)的抗腫瘤作用，這意味著miR-200c-5p 通過靶向MAD2L1發(fā)揮抗腫瘤作用[19，20]，而MAD2L1 可能是治療HCC的關(guān)鍵靶基因。

NDC80 是外著絲點(diǎn)的核心組成部分，是有絲分裂調(diào)節(jié)因子，介導(dǎo)染色體對(duì)齊，是染色體分離所必需的[21]。既往文獻(xiàn)報(bào)道，NDC80 在包括腎細(xì)胞癌在內(nèi)的多種類型的癌組織中均表達(dá)上調(diào)[22]，惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[23]、小細(xì)胞肺癌[24]、腎上腺皮質(zhì)癌[25]和HCC[26]NDC80 的高表達(dá)預(yù)示著包括HCC 在內(nèi)的不良預(yù)后。Liu 等[24]研究表明，NDC80 在HBV 相關(guān)的HCC 組織中的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而NDC80 的高表達(dá)水平預(yù)示著不良預(yù)后。NDC80 通過減少細(xì)胞凋亡和克服細(xì)胞周期的阻滯來促進(jìn)HCC 的進(jìn)展，敲除NDC80 可以抑制HCC 的增殖[25]。因此，NDC80也可能成為一種新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

以往的研究也確定了參與HCC 的DEGs，并通過生物信息學(xué)分析篩選出了一些樞紐基因作為候選的生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。然而，由于選擇的數(shù)據(jù)集和生物信息學(xué)分析方法不同，不同的組篩選出了不同的樞紐基因。本研究篩選出了CCNB1、CDK1、MAD2L1 和NDC80 這4 個(gè)樞紐基因，并進(jìn)一步證實(shí)了這些樞紐基因可能作為HCC 的新的診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。然而，這項(xiàng)研究仍存在一些局限性，例如，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)，這4 個(gè)樞紐基因如何影響HCC 發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制有待進(jìn)一步探索。盡管存在這些缺陷，我們篩選出的樞紐基因仍可能是HCC 診斷和HCC 治療靶點(diǎn)的潛在生物標(biāo)志物。