陳永智 朱丹

腦梗死又稱(chēng)缺血性腦卒中，是指各種腦血管病變所致腦部血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致局部組織缺血、缺氧性壞死，而迅速出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)功能缺損的一類(lèi)臨床綜合征。腦卒中是目前導(dǎo)致人類(lèi)死亡的第二位原因，腦梗死是卒中最常見(jiàn)的類(lèi)型，約占70%～80%[1]。腦卒中具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)。我國(guó)腦卒中現(xiàn)患人數(shù)高居世界首位，已成為導(dǎo)致成年居民死亡和殘疾的首位病因，疾病負(fù)擔(dān)沉重[2]。缺血性腦損傷的病理過(guò)程極為復(fù)雜，涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及外周循環(huán)系統(tǒng)的多種細(xì)胞毒性因子和炎癥細(xì)胞[3]。氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥是腦缺血再灌注損傷的關(guān)鍵病理過(guò)程，他們之間的密切互動(dòng)介導(dǎo)了缺血性腦卒中期間的神經(jīng)元損傷、血腦屏障損傷等[4]。急性腦缺血和腦損傷是由神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的興奮性升高引起的，隨后是復(fù)氧依賴(lài)的氧化應(yīng)激、代謝衰竭和細(xì)胞死亡[5]。在細(xì)胞急性死亡中，過(guò)量的細(xì)胞內(nèi)鈣激活有害的磷脂酶、內(nèi)切酶和鈣蛋白酶，導(dǎo)致細(xì)胞器和細(xì)胞膜破裂，主要導(dǎo)致壞死性細(xì)胞死亡。而在細(xì)胞延遲性死亡中，最開(kāi)始或較溫和的興奮性毒性可引發(fā)一系列細(xì)胞功能紊亂，如氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)合成或折疊障礙、線(xiàn)粒體功能障礙和細(xì)胞信號(hào)改變。這些紊亂的積累最終可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子的二次升高和細(xì)胞死亡途徑的激活（細(xì)胞凋亡、壞死、自噬和壞死性凋亡），最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡[6]。海馬鈣蛋白（HPCA）是一種緩沖細(xì)胞內(nèi)Ca2+和防止Ca2+引起細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)，其與細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的Ca2+結(jié)合，在神經(jīng)元的Ca2+排出中起著重要作用，進(jìn)而幫助保護(hù)神經(jīng)元免受興奮性毒素?fù)p傷[7]。此外，HPCA 通過(guò)與神經(jīng)細(xì)胞凋亡抑制蛋白（NAIP）相互作用，對(duì)Ca2+誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有保護(hù)作用，從而保護(hù)受到缺血性損傷的大腦[8]。

1 谷氨酸興奮性毒性與鈣超載

細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度在腦內(nèi)起著復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。Ca2+跨膜以及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和細(xì)胞間質(zhì)的流動(dòng)整合了不同的細(xì)胞功能[9]。在缺血性腦損傷過(guò)程中，大腦的血液供應(yīng)中斷會(huì)導(dǎo)致氧氣和葡萄糖缺乏，從而減少可用于支持腦細(xì)胞的能量[10]。這會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元過(guò)度去極化，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)（谷氨酸）的釋放，谷氨酸蓄積導(dǎo)致突觸后膜谷氨酸受體過(guò)度興奮[11]。研究表明，谷氨酸受體家族的幾乎所有成員都參與介導(dǎo)興奮性毒性[12]，親離子受體，如N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸受體（AMPAR）等被認(rèn)為是特別重要的。由于興奮性神經(jīng)遞質(zhì)從細(xì)胞外間隙的重新攝取減少，大量Ca2+通過(guò)這些受體及其他方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載[13]。胞漿內(nèi)Ca2+濃度的升高可引發(fā)一系列下游神經(jīng)毒性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括線(xiàn)粒體從ATP 合成過(guò)程中的電子傳遞解偶聯(lián)，以及鈣調(diào)蛋白酶和其他蛋白酶、蛋白激酶、一氧化氮合酶（NOS）、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和核酸內(nèi)切酶等酶的激活和過(guò)度刺激，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡和壞死[14]。

2 缺血性損傷與細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種類(lèi)型，當(dāng)細(xì)胞處于壓力或遭受不可逆的損傷時(shí)，涉及分解代謝酶的激活，信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)破壞細(xì)胞成分[15]。在缺血性損傷發(fā)生時(shí)，細(xì)胞收到死亡信號(hào)，促凋亡蛋白移位到線(xiàn)粒體膜上，與其他促凋亡蛋白Bax、Bak、Bad 和BCL-XS 相互作用。最終可以改變線(xiàn)粒體的通透性，觸發(fā)細(xì)胞色素c 的釋放，并與凋亡蛋白激活因子-1（APAF-1）結(jié)合形成凋亡體。細(xì)胞凋亡體的形成激活了半胱天冬酶原-9（proCaspase-9），使其激活成為半胱天冬酶-9（Caspase-9），最終觸發(fā)核DNA 降解，從而引起細(xì)胞凋亡[16]。此外，配體（如FasL/TNF-α/TRAIL）與死亡受體結(jié)合，募集胞質(zhì)適配蛋白分子，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（DISC），催化proCaspase-8 的分解和自催化激活，從而觸發(fā)下游Caspase-3 的裂解，最終也導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17]。

3 HPCA 在缺血性損傷中的作用機(jī)制

3.1 HPCA 定義HPCA 是一種鈣離子結(jié)合蛋白，屬于神經(jīng)元鈣感受器家族，其參與了廣泛的鈣離子依賴(lài)的信號(hào)傳遞過(guò)程，包括離子通道的調(diào)制和運(yùn)輸、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸可塑性、細(xì)胞凋亡和基因表達(dá)的控制[18]。HPCA 具有3 個(gè)EF-Hand 結(jié)構(gòu)（氨基酸序列折疊成一個(gè)螺旋-環(huán)形-螺旋模式）和1 個(gè)位于N 端的肉豆蔻酰化位點(diǎn)，主要在海馬錐體層表達(dá)。該序列由195 個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量約為23kDa，與黏蛋白、恢復(fù)素、S-調(diào)制素、神經(jīng)鈣蛋白和神經(jīng)黏蛋白樣蛋白具有顯著的同源性[19]。HPCA 在亞微摩爾濃度Ca2+水平上1mol 蛋白質(zhì)結(jié)合3mol 的Ca2+，并以鈣依賴(lài)的方式與質(zhì)膜結(jié)合。HPCA 在其N(xiāo)H2 端的甘氨酸殘基上發(fā)生肉豆蔻?；?，這種修飾是其膜結(jié)合特性的關(guān)鍵事件[20]。

3.2 HPCA 與興奮性毒性損傷海馬是大腦中最容易受到短暫性缺血和癲癇發(fā)作影響的區(qū)域，當(dāng)其受到上述損傷時(shí)，細(xì)胞外興奮性氨基酸（谷氨酸）水平會(huì)急劇升高[21]。持續(xù)暴露在興奮性毒性損傷中，大量Ca2+通過(guò)谷氨酸受體等方式進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞中。一項(xiàng)在海馬內(nèi)注射喹啉酸對(duì)小鼠體內(nèi)海馬神經(jīng)元影響的實(shí)驗(yàn)表明，HPCA 通過(guò)增加神經(jīng)元中Ca2+的排出來(lái)保護(hù)海馬神經(jīng)元免受鈣依賴(lài)性損傷[7]。也有研究表明，HPCA 可能以不同的方式解碼谷氨酸受體的激活，將其轉(zhuǎn)化為對(duì)其目標(biāo)的特定位點(diǎn)和時(shí)間的修飾，以保護(hù)其免受興奮性毒性損傷[22]。

3.3 HPCA 與細(xì)胞凋亡NAIP 通過(guò)第三個(gè)桿狀病毒抑制重復(fù)結(jié)構(gòu)域（BIR3）在Ca2+促進(jìn)的相互作用中與HPCA 結(jié)合，可以在Caspase-3 激活和非激活途徑中保護(hù)神經(jīng)元免受鈣誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。兩者在神經(jīng)細(xì)胞中的共同表達(dá)具有顯著協(xié)同作用[23]。此外也有研究表明，HPCA 參與控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Caspase-12 以及由其切割激活的下游通路。Caspase-12 在缺乏HPCA 的神經(jīng)元中被激活，導(dǎo)致這些細(xì)胞抵抗細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高的脆弱性增加。同樣Caspase-9 被發(fā)現(xiàn)在缺乏海馬鈣素的神經(jīng)元中被加工[24]，而這些Caspase 在細(xì)胞凋亡中起重要作用。

4 HPCA 與相關(guān)藥物研究進(jìn)展

目前為止，許多藥物被證明可以通過(guò)影響HPCA 的表達(dá)，從而在大腦受到缺血性損傷時(shí)保護(hù)神經(jīng)元。首先，褪黑素是一種強(qiáng)大的自由基清除劑和抗氧化劑[25]，由松果體中的L-色氨酸產(chǎn)生[26]。褪黑素可防止氧化應(yīng)激引起的鈣超載和線(xiàn)粒體膜去極化，阻斷Caspase-3 的激活，從而阻止細(xì)胞凋亡[27]。此外褪黑素可調(diào)節(jié)缺血性腦損傷中小白蛋白和HPCA 的表達(dá)，從而參與細(xì)胞內(nèi)鈣水平的調(diào)節(jié)[28]，在缺血性腦損傷中起到神經(jīng)保護(hù)作用。銀杏葉提取物EGB761 主要由黃酮苷和獨(dú)特的萜類(lèi)內(nèi)酯組成，在缺血的大腦中表現(xiàn)出抗氧化性能[29]。有研究表明，EGB761 可以減輕腦缺血損傷引起的HPCA 的減少。從而可減輕谷氨酸暴露引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高，因此HPCA 維持參與了EGB的神經(jīng)保護(hù)作用[30]。阿魏酸（4-羥基-3-甲氧基肉桂酸）是一種酚類(lèi)化合物和有效的抗氧化劑，具有較強(qiáng)的抗炎活性[31]。同樣，阿魏酸被證實(shí)在缺血條件下，維持神經(jīng)元細(xì)胞中HPCA 的表達(dá)，阻止了谷氨酸誘導(dǎo)的HPCA 表達(dá)下降[32]。而煙酰胺、雌激素、槲皮素同樣在實(shí)驗(yàn)中被證明可降低大腦中動(dòng)脈大鼠模型的梗死體積，調(diào)節(jié)缺血性腦損傷中HPCA的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣水平[33～35]。分子氫作為一種新的抗氧化劑，可以選擇性地減少.OH 和ONOO-而不影響生理活性氧。研究表明，富氫水（HRW）可以減弱活性氧的過(guò)度產(chǎn)生，保護(hù)神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激[36]，并可以通過(guò)調(diào)節(jié)缺血性腦損傷中鈣緩沖蛋白（特別是小白蛋白和HPCA）的表達(dá)來(lái)保護(hù)神經(jīng)元，從而維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的穩(wěn)態(tài)[37]。7，8-二羥基-4-甲基香豆素（Dhmc）是一種香豆素衍生物，具有特別強(qiáng)的自由基清除能力[38]。Dhmc 抑制谷氨酸誘導(dǎo)的HPCA 的耗竭，通過(guò)清除自由基和調(diào)節(jié)HPCA 表達(dá)來(lái)預(yù)防谷氨酸誘導(dǎo)的毒性[39]，從而保護(hù)神經(jīng)元免受缺血性損傷?，F(xiàn)如今越來(lái)越多的藥物被證實(shí)通過(guò)與HPCA 的相互作用顯示出保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，對(duì)該類(lèi)藥物保護(hù)機(jī)制的深入研究可為神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供新的治療策略及藥物研究靶點(diǎn)。

5 總結(jié)

HPCA 是一種鈣結(jié)合蛋白，其在鈣超載及谷氨酸誘導(dǎo)的Ca2+水平增加的調(diào)節(jié)中起到重要作用，同時(shí)其與神經(jīng)細(xì)胞凋亡抑制蛋白的相互作用在缺血性損傷中起到保護(hù)神經(jīng)元的作用，以上機(jī)制為藥物的研發(fā)起到了指導(dǎo)作用。然而，基于目前對(duì)缺血性腦卒中發(fā)生后神經(jīng)元損傷和修復(fù)的過(guò)程認(rèn)識(shí)不夠完善，需要進(jìn)一步研究以明確HPCA 的表達(dá)在腦卒中發(fā)作前后如何實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)。了解其在氧化損傷、興奮性毒性、鈣超載中的分子機(jī)制，可以為神經(jīng)元保護(hù)提供潛在的治療依據(jù)。如何降低缺血性損傷時(shí)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平或可成為缺血性腦卒中治療的重要方向。進(jìn)一步了解HPCA 在缺血性腦卒中發(fā)生后Ca2+水平的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)機(jī)制，為缺血性腦卒中治療的有效性及安全性提供更多新策略。