石新燁 孫經(jīng)武 劉振 劉婧玚 董文敬 張翠

細(xì)胞死亡在機體發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，人們對細(xì)胞死亡的認(rèn)識經(jīng)歷了漫長的過程。目前認(rèn)為細(xì)胞死亡形式主要分為兩大類：非程序性細(xì)胞死亡，即壞死（Necrosis）；程序性細(xì)胞死亡（Programmed cell death，PCD）。PCD 可以分為裂解性細(xì)胞死亡和非裂解性細(xì)胞死亡[1]，前者包括壞死性凋亡（Necroptosis）和細(xì)胞焦亡（Pyroptosis），這兩種死亡使得細(xì)胞內(nèi)含物外漏，引起炎癥反應(yīng)，因此稱為炎癥性死亡。后者最典型的是細(xì)胞凋亡（Apoptosis）。細(xì)胞焦亡與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，如：動脈粥樣硬化、心力衰竭、心血管疾病、糖尿病及其并發(fā)癥、痛風(fēng)及腫瘤等。近年來發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡及其相關(guān)蛋白廣泛存在于心肌缺血再灌注損傷（Myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）過程中，參與MIRI 的發(fā)生發(fā)展。在臨床治療上既要盡早恢復(fù)缺血組織的血流，又要減輕或防止再灌注對器官造成的二次損傷?，F(xiàn)探討細(xì)胞焦亡的研究進展及其對MIRI 的作用機制及相關(guān)通路研究，進一步分析各種藥物對心肌缺血再灌注損傷的保護作用。

1 細(xì)胞焦亡的形態(tài)學(xué)和分子特征

1.1 細(xì)胞焦亡的形態(tài)學(xué)特征細(xì)胞焦亡是PCD 的一種新形式，在形態(tài)學(xué)上[2]兼具細(xì)胞壞死（質(zhì)膜完整性喪失）和凋亡（DNA 片段化和核固縮），其中凋亡是由基因調(diào)控自主有序的生理性死亡，DNA 片段有序細(xì)胞核碎片狀，而焦亡是在病理狀態(tài)下誘發(fā)產(chǎn)生，DNA 片段隨機且細(xì)胞核完整。壞死和焦亡均存在質(zhì)膜破裂，與壞死爆炸樣破裂不同的是焦亡導(dǎo)致細(xì)胞變扁，焦亡會發(fā)生膜泡變形成囊泡狀結(jié)構(gòu)（稱為焦亡小體）。當(dāng)發(fā)生焦亡時，細(xì)胞膜上會形成直徑為1.1～2.4nm 的微小孔隙，發(fā)生滲透性溶解活性物質(zhì)釋放至胞外，最終導(dǎo)致細(xì)胞破裂死亡，同時激發(fā)免疫反應(yīng)擴大炎癥反應(yīng)。

1.2 細(xì)胞焦亡的分子特征

1.2.1 炎癥小體 炎癥小體的基本結(jié)構(gòu)：位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的感受器模式識別受體（Pattern recognition receptor，PRRs）；效應(yīng)器Caspase-1 前體（Pro-caspase-1）；連接受體蛋白和效應(yīng)蛋白起橋梁作用的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（Apoptosis associated speck-like protein containing，ASC）。PRRs 的成員：核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域（NOD），富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）的蛋白質(zhì)（NLR）家族成員，黑色素瘤缺乏因子2 樣受體（AIM2），以及含有TRIM 家族成員蛋白Pyrin。其 中NLRP1、NLRP3 和NLRC4 和小鼠Nlrp1a 和Nlrp1b 已明確可以形成炎癥小體。也有研究[3]發(fā)現(xiàn)，HIV 病毒蛋白酶可激活由CARD8 炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，使患者CD4+T 細(xì)胞中潛伏的HIV 被清除，因此CARD8 為HIV 的炎癥小體傳感器。

NLRP3 是目前研究最明確的炎癥小體，是由氨基末端熱蛋白結(jié)構(gòu)域（PYD）、NOD、c 端富含LRR結(jié)構(gòu)域和CARD 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。炎癥小體激活存在雙信號模型：信號一由微生物成分或內(nèi)源性細(xì)胞激酶發(fā)揮啟動信號，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 激活，使信號分子MyD88 和TRIF 均可調(diào)控toll 樣受體（TLRs）配體，從而上調(diào)NLRP3 和pro-IL-1β[4]。DDX3X在甲型流感病毒（IAV）感染期間先天抗病毒免疫反應(yīng)至關(guān)重要，研究表明[5]其可激活NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)細(xì)胞焦亡、組裝應(yīng)激顆粒及I 型干擾素（IFN）宿主反應(yīng)進行防御。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶NEK-1 通過與NLRP3 的LRR 結(jié)構(gòu)域相互作用，形成NEK7-NLRP3 復(fù)合物，促進NLRP3 炎癥小體的激活[6]。信號二由離子通量（K+外排、Ca2+動員、Cl-外排和Na+內(nèi)流）、線粒體功能障礙和活性氧（ROS）的產(chǎn)生以及溶酶體損傷廣泛的刺激并激活NLRP3。

1.2.2 Caspase 家族 半胱天冬酶是一種保守的半胱氨酸蛋白酶家族，由氨基末端半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域（CARD）、中央大催化結(jié)構(gòu)域和羧基末端小催化亞基結(jié)構(gòu)域組成，共同參與酶活性中心的形成。Caspases 分類包括：與炎癥相關(guān)的Caspase-1，4，5，11，12，其激活可介導(dǎo)焦亡；與凋亡相關(guān)的Caspase-2，8，9，10（凋亡起始）和Caspase-3，6，7（凋亡執(zhí)行）。研究發(fā)現(xiàn)除了Caspase-1 活性位點與GSDMD N 和C 端結(jié)構(gòu)域連接器的接合外，L2和L2’環(huán)上的反平行β 片在其N-端結(jié)構(gòu)域遠端與GSDMD C-端結(jié)構(gòu)域內(nèi)結(jié)合了一個疏水口袋，揭示了Caspase-1 通過兩個不同的界面介導(dǎo)對GSDMD 特異性剪切[7]。在焦亡介導(dǎo)底物GSDMD缺失的情況下，Caspase-1 激活Caspase-3，7 并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，間接說明Caspase-1 誘導(dǎo)焦亡可能只有唯一的底物，即GSDMD。同時在細(xì)胞凋亡過程中，Caspase-3，7 在Asp87 位點切割GSDMD，可導(dǎo)致GSDMD 的焦亡活性失活，此實驗表明焦亡與凋亡存在雙向干擾[8]。同樣Caspase-8 在細(xì)胞焦亡和細(xì)胞凋亡中均可發(fā)揮作用，它可以激活NLRP3 對GSDMD 進行切割。

1.2.3 Gasdermin 蛋白家族 Gasdermins 是功能多樣的蛋白質(zhì)家族，主要在皮膚、胃腸道和免疫細(xì)胞中表達，其在粘膜屏障系統(tǒng)中發(fā)揮作用?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)的GSDMs 主要有6 種：GSDMA～E 和DFNB59。除了DFNB59，其余GSDMs 均含有高度保守的N-末端和C-末端，其中C 端結(jié)構(gòu)域作為抑制結(jié)構(gòu)域而限制N 端功能。GSDMD 蛋白是細(xì)胞焦亡Caspase的共同底物效應(yīng)執(zhí)行蛋白，在兩條焦亡通路中均扮演著關(guān)鍵角色，NF-κB/GSDMD 軸作為橋梁影響NLRP3 凋亡小體介導(dǎo)的焦亡。此外，大量研究證實SADMA、GSDMB、GSDMC、GSDME 在某種情況下均可誘導(dǎo)焦亡的發(fā)生。

2 細(xì)胞焦亡通路

2.1 經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑由炎癥小體組裝介導(dǎo)并伴 有GSDMD 裂解和IL-1β 和IL-18 釋放。炎癥小體的組裝起始于PRRs 通過識別病原相關(guān)分子（Pathogen associated molecular patterns，PAMPs）和非病原相關(guān)宿主來源的危險信號分子（Danger associated molecular patterns，DAMPs）危險信號分子的刺激，NLRP3 通過每個蛋白中的PYD 相互作用，招募ASC 從而為ASC 絲狀形成提供成核平臺，絲狀A(yù)SC“斑點”通過CARD-CARD 相互作用促進Caspase-1 的招募和激活。Caspase-1 被ASC 招募激活后一方面剪切Pro-IL-1β 和Pro-IL-18，促進IL-1β 和IL-18 的成熟與釋放，招募更多的炎癥細(xì)胞聚集，擴大炎癥反應(yīng)，提高機體先天性免疫防御能力，達到保護宿主細(xì)胞的目的。另一方面激活的Caspase 特異性剪切 GSDMD，將N-末端從具有自我抑制作用的C-末端釋放出，GSDMD-N 與脂質(zhì)結(jié)合形成非選擇性孔隙，不依賴于增加滲透壓來破壞細(xì)胞，最終細(xì)胞膜破裂并伴隨大量炎性因子釋放，觸發(fā)細(xì)胞焦亡[9]。

2.2 非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性細(xì)菌的胞質(zhì)識別依賴于Caspase-4，5，11 的存在以觸發(fā)NLRP3 炎癥激活，證明Caspase-11 激活獨立于NLRP3 炎癥小體激活焦亡發(fā)生，為了與已知的依賴于Caspase-1 的炎癥小體途徑區(qū)別開來，這種新的炎癥小體參與途徑被稱為非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑。Caspase-4，5，11 激活后直接裂解GSDMD 成GSDMD-N 并寡聚轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，最終形成質(zhì)膜孔并觸發(fā)焦亡。有研究發(fā)現(xiàn)激活的Caspase-11 可特異性剪切和修飾通道蛋白Pannexin-1，引起細(xì)胞ATP 的釋放致離子通道P2X7 開放，使鉀鈉鈣離子外流，細(xì)胞發(fā)生滲透性腫脹進而發(fā)生膜破裂[10]。但此途徑激活的Caspase-11 不能剪切IL-1β 和IL-18，使IL‐1β 和IL‐18 成熟并釋放。

2.3 其他途徑Deng 等[11]發(fā)現(xiàn)A 組鏈球菌（GAS）的SpeB 毒力因子通過Gln246 裂解GSDMA，釋放一個激活的N 端片段來觸發(fā)角化細(xì)胞焦亡，而GSDMA 基因缺陷減弱了小鼠對GAS 的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致不受控制的細(xì)菌傳播和死亡。細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞中的顆粒酶A（Granzyme A，GzmA）通過穿孔素進入靶細(xì)胞，在Lys229/Lys244 位點水解GSDMB 誘導(dǎo)焦亡，將GzmA 引入小鼠癌細(xì)胞，可促進小鼠腫瘤清除[12]，為治療腫瘤提供新靶點，同時GSDMB 作為一種抗菌細(xì)胞溶酶，在炎癥性腸病患者的GSDMB 增多過程中可促進上皮細(xì)胞的恢復(fù)和修復(fù)，但不依賴于焦亡[13]。Hou 等[14]發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞來源的TNF-α 激活的Caspase-8 可在ASP365位點將GSDMC 裂解為N-GSDMC，阻止Caspase-8招募Caspase-3 參與凋亡過程。Zhang 等[15]發(fā)現(xiàn)顆粒酶B 可誘導(dǎo)成熟的Caspase-3 裂解GSDME，并在Asp270 處直接切割GSDME，同時誘導(dǎo)獨立于Caspase 的焦亡，使表達GSDME 的細(xì)胞將非炎性凋亡轉(zhuǎn)化為焦亡，從而發(fā)揮抑制腫瘤的作用。以上研究說明GSDMA、GSDMB、Caspase-8/GSDMD、Caspase-3/GSDME 均為細(xì)胞焦亡相關(guān)通路。

3 細(xì)胞焦亡參與心肌缺血再灌注損傷的機制

3.1 氧化應(yīng)激缺血再灌注產(chǎn)生的活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）通過對復(fù)合物Ⅰ/Ⅲ的氧化損傷使線粒體ROS 的產(chǎn)生和氧化還原功能發(fā)生障礙，強烈增強蛋白質(zhì)半胱氨酸磺化和損害血紅素完整性致心肌細(xì)胞損害[16]。在創(chuàng)傷性腦損傷模型中，NADPH 氧化酶可使脂肪酸氧化增加，激活NLRP3 炎癥小體，進一步給予NLRP3 炎癥小體的抑制劑INF4E 可以改善線粒體功能，發(fā)揮保護MIRI 和改善心肌功能損傷作用[17]。以上均表明線粒體功能障礙和線粒體ROS 的產(chǎn)生在NLRP3 炎癥小體激活中是不可缺少的。

3.2 鈣離子超載心肌缺血后調(diào)節(jié)相關(guān)交換體的活性及肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP 酶功能障礙使細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，其可激活蛋白酶與鈣依賴性磷脂酶活性，致生物膜完整性破壞、肌原纖維收縮、線粒體破壞、ATP 耗竭及心肌頓抑等不良后果。因此鈣通路調(diào)控因子在MI/R 損傷中發(fā)揮重要作用。Chen 等[18]研究證明，Ugonin U 通過Ca2+動員和線粒體ROS的產(chǎn)生激活NLPR3 炎癥小體。其激活機制可能是：Ca2+的增加促進NLRP3 和ASC 之間的相互作用；Ca2+的增加誘導(dǎo)線粒體功能障礙進而導(dǎo)致NLRP3炎癥小體激活。也有研究[19]表明，在無Ca2+培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)K+外排也可觸發(fā)NLRP3 炎癥小體激活。綜上，鈣離子超載可以激活NLRP3 炎癥小體但不是必需條件。

3.3 內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷內(nèi)皮細(xì)胞受ROS 的攻擊使縮血管活性物質(zhì)增多，同時表達炎性因子及大量NO 導(dǎo)致ROS、蛋白酶等毒性因子介導(dǎo)的細(xì)胞毒性增強，均加重心肌細(xì)胞受損。Sun 等[20]在建立心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞和MIRI 動物模型中觀察到NLRP3炎癥小體的激活和焦亡，并且通過天麻素的干預(yù)可阻斷焦亡發(fā)生，改善MIRI。在小鼠MIRI 模型中BECN1 基因可以調(diào)節(jié)Caspase-4 介導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞焦亡[21]。綜上，細(xì)胞焦亡在內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷致MIRI 中發(fā)揮作用。

3.4 自噬缺血時自噬激活可減弱心肌缺血再灌注損傷[22]，而再灌注時自噬過度激活可加重心肌缺血再灌注損傷。自噬可直接清除炎癥小體，也可消除炎癥刺激：如ROS、線粒體脫氧核糖核酸或受損的細(xì)胞器）來減輕炎癥，維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)高糖抑制了H9C2 心肌細(xì)胞的自噬，激活了NLRP3炎癥小體，加重了心肌缺血再灌注損傷，使用雷帕霉素激活自噬可抑制NLRP3 炎癥小體，最終緩解心肌缺血再灌注損傷[23]。以上表明適度自噬可以通過抑制細(xì)胞焦亡發(fā)揮改善MIRI 作用。

4 通過細(xì)胞焦亡通路對心肌缺血再灌注損傷進行保護的藥物

4.1 抑制細(xì)胞焦亡相關(guān)通路對MIRI 發(fā)揮保護作用研究發(fā)現(xiàn)[24]，牛舌草總黃酮（TF）在小鼠MIRI 模型中可以通過ROS/TXNIP/NLRP3 通路發(fā)揮抗MIRI作用。Geniposide 促進AMPK 磷酸化激活后降低炎癥小體及IL-1β、IL-18 的基因和蛋白表達水平，進而改善能量代謝，從而抑制NLRP3，降低ROS 水平的表達[25]。七氟醚通過抑制P2X7-NLRP3 信號通路抑制IL-1β、IL-18 和GSDMD 的表達，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和焦亡保護心功能[26]。曲美他嗪（TMZ）及大黃素可以降低TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3 炎癥小體通路蛋白水平，緩解心肌缺血再灌注損傷[27]。心肌成纖維細(xì)胞分泌外泌體將miR-133a 傳遞到心肌細(xì)胞，抑制心肌細(xì)胞焦亡保護心肌[28]。綜上，通過抑制炎癥小體的激活及下游蛋白的表達可發(fā)揮保護心肌的作用。

4.2 臨床藥物的研究

4.2.1 研究發(fā)現(xiàn)糖尿病以AMPK 依賴的方式產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞焦亡，加重大鼠MIRI 程度。大量研究發(fā)現(xiàn)多種降糖藥可通過抑制細(xì)胞焦亡減輕MIRI。胰島素通過丙酮酸脫氫酶e1α 亞基（PDHA1）的去磷酸化可以減少因NLRP3 激活焦亡誘導(dǎo)的炎癥，顯著降低心肌梗死面積，改善心臟血流動力學(xué)、病理改變及能量代謝[29]。二甲雙胍可減少促炎細(xì)胞因子并減少NLRP3 炎癥小體的激活，增加細(xì)胞活力，降低LDH 的釋放以及縮小心肌梗死面積、抑制心肌纖維化，達到減輕MIRI 和細(xì)胞焦亡的作用[30]。在巨噬細(xì)胞中用NLRP3 刺激處理后給予格列本脲，發(fā)現(xiàn)該藥物以劑量依賴的方式抑制NLRP3 炎癥小體的激活和IL-1b 的釋放[31]。小分子16673-34-0 是格列本脲合成的中間底物，可抑制心肌細(xì)胞NLRP3 炎癥小體的形成，限制小鼠心肌缺血再灌注損傷后的梗死面積，而不影響葡萄糖代謝[32]。

4.2.2 褪黑素能降低小鼠主動脈內(nèi)皮組織中與焦亡相關(guān)基因的表達，包括NLRP3/ASC/Caspase-1、NFκB/GSDMD、IL-1β 和IL-18，通過序列互補抑制miR-223 的功能，可以阻斷褪黑素以上作用并增加NLRP3 的表達，表明褪黑素通過MEG3/miR223/NLRP3 軸防止內(nèi)皮細(xì)胞焦亡[33]。抑制TLR4-NLRP3介導(dǎo)的焦亡對大鼠缺血再灌注損傷有保護作用，表明褪黑素通過TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3 炎癥小體通路對肝臟缺血/再灌注損傷的發(fā)病起重要作用。

4.2.3 秋水仙堿 接受經(jīng)皮冠狀動脈介入治療的ST段抬高型心肌梗死患者服用0.5mg 的秋水仙堿可減少心肌梗死面積和心肌炎癥反應(yīng)，顯著降低缺血性心血管事件的風(fēng)險[34]。在AMI 小鼠模型中[35]，短期使用秋水仙堿治療可顯著降低NLRP3 炎癥小體的激活和NLRP3 下游焦亡相關(guān)蛋白的表達，改善心功能、心力衰竭和心肌梗死后的生存質(zhì)量。表明秋水仙堿通過抑制NLRP3 介導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡而抑制AMI 后的炎癥反應(yīng)和心室重構(gòu)。

缺血的心肌組織恢復(fù)血供后可造成進一步損害并影響心肌纖維結(jié)構(gòu)、電生理功能、心肌代謝功能及心臟泵功能，從而削弱冠狀動脈血運重建治療的療效，因而尋找減輕再灌注損傷藥物對心肌缺血疾病至關(guān)重要。大量研究表明細(xì)胞焦亡與心肌缺血再灌注損傷有關(guān)，本研究探討了細(xì)胞焦亡與MIRI之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注從多方面均可誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡進而損傷心肌細(xì)胞，為后續(xù)藥物抑制細(xì)胞焦亡減少心肌損傷提供依據(jù)。也有研究提出相反意見，表示目前的文獻主要關(guān)注其在急性心肌缺血再灌注損傷中的有害影響，但不能忽略的是在一定條件下還可能參與心臟保護信號傳導(dǎo)。在豬MI 模型中，我們在其體內(nèi)未觀察到NLRP3 炎癥小體抑制后炎癥反應(yīng)的減弱[36]。炎癥是一把雙刃劍，在過度活躍時有害，但在活性較低時有益，其活性嚴(yán)重程度依賴于再灌注時間和細(xì)胞位置，繼續(xù)深入研究細(xì)胞焦亡參與MIRI 的發(fā)生機制有望為其提供有效靶點，與此同時在開始使用細(xì)胞焦亡抑制劑進行臨床試驗之前，需充分了解NLRP3 炎癥小體在心肌缺血再灌注損傷中的作用。