劉小倩,王 志,周培華,王丙開,劉曉靜,蔣學(xué)軍,袁方均

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)國藥東風(fēng)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地 胃腸外科,湖北 十堰,442000;2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國藥東風(fēng)總醫(yī)院 胃腸外科,湖北 十堰,442000)

慢傳輸型便秘(STC)是一種常見的由非器質(zhì)性疾病引起的便秘,主要表現(xiàn)為排便次數(shù)減少或糞便干硬伴排便困難。全球成年人慢性便秘的患病率為8.2%～32.9%[1],中國人群為4.0%～10.0%[2-3]。STC的常見治療策略包括調(diào)節(jié)生活方式、改變飲食習(xí)慣、應(yīng)用瀉藥、生物反饋治療以及通過益生菌、益生元和合成菌改善腸道菌群[3],但存在容易復(fù)發(fā)、易導(dǎo)致一系列的副作用等問題,其中瀉藥的濫用導(dǎo)致便秘的治療更為困難[4]。腸道菌群移植(FMT)是通過某種途徑將健康人腸道中的功能菌群移植到患者腸道中,以調(diào)節(jié)腸道菌群,重建腸道微生態(tài)平衡,從而發(fā)揮治療作用[5]。糞便懸浮液可通過鼻胃管或鼻十二指腸管、結(jié)腸鏡、灌腸劑或膠囊進(jìn)行移植[6-7]。

研究[8]發(fā)現(xiàn),FMT對(duì)胃腸功能性疾病療效顯著,腸道菌群的改變與便秘及便秘相關(guān)癥狀密切相關(guān),但其菌群變化和改善機(jī)制仍需要更多的臨床和實(shí)驗(yàn)研究。腸道菌群研究通常采用16S rDNA檢測(cè)進(jìn)行分析,這也是目前微生物群落分析的“金標(biāo)準(zhǔn)”[9-10]。本研究基于16S rDNA基因測(cè)序,初步分析了STC患者的菌群多樣性及分布特點(diǎn),并同步分析了經(jīng)FMT治療后患者菌群分布的變化以及患者便秘癥狀和精神心理狀態(tài),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

STC患者診斷和納入標(biāo)準(zhǔn)：① 成年人,性別不限;② 符合功能性便秘羅馬Ⅳ診斷標(biāo)準(zhǔn)者,并經(jīng)傳輸試驗(yàn)證實(shí)存在結(jié)腸慢傳輸(>48 h),伴或不伴焦慮癥和抑郁癥;③ 經(jīng)口服藥物或生物反饋療法等綜合治療半年后仍便秘者;④ 無嚴(yán)重心功能不全、嚴(yán)重肺功能障礙者,肝腎功能基本正常;⑤ 患者接受上一次治療后至少2周;⑥ Barthel評(píng)分為60分以上者;⑦ 直腸測(cè)壓正常者,直腸功能正常,影像學(xué)檢查無解剖異常(脫肛或腸套疊)導(dǎo)致對(duì)比劑排出困難;⑧ 能配合觀察不良反應(yīng)、療效和隨訪者;⑨既往無腸道手術(shù)病史者;⑩ 凝血功能正常者。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 哺乳期女性或孕婦;② 各種原因?qū)е碌哪c道屏障嚴(yán)重受損的患者;③ 各種原因?qū)е聼o法耐受機(jī)體所需一半以上熱卡需求的腸內(nèi)營養(yǎng)者;④ 免疫缺陷病患者或正在進(jìn)行免疫抑制治療患者;⑤ 合并乙型肝炎、結(jié)核、梅毒及艾滋病病毒抗體陽性者或任何傳染性疾病急性期者;⑥ 入組前已參加其他任何菌群治療者;⑦患者處于疾病末期或者可能在研究中死亡或試驗(yàn)期間研究者認(rèn)定的可能影響受試者依從性和(或)完成試驗(yàn)相關(guān)操作的情況。

健康供體[11]的篩查：① 生理標(biāo)準(zhǔn)。18～25歲非孕期健康成人,傳染病病原體檢查陰性;幽門螺桿菌、血液檢查、糞便檢查陰性。② 精神心理標(biāo)準(zhǔn)。醫(yī)生訪談?wù)J定心理狀態(tài)良好,抑郁自評(píng)量表(SDS)、焦慮自評(píng)量表(SAS)、匹茲堡睡眠質(zhì)量評(píng)分(PSQI)等評(píng)分正常。③ 個(gè)人史。生活方式健康,未參加過藥物試驗(yàn),無胃腸道疾病、精神神經(jīng)系統(tǒng)疾病、過敏性疾病、惡性腫瘤及其他基礎(chǔ)疾病和傳染病史。近2周無胃腸道不適;近3個(gè)月內(nèi)未使用抗生素、抑酸劑或免疫抑制劑等;無消化系統(tǒng)手術(shù)史;無惡性腫瘤病史。④ 供體具有穩(wěn)定性。每8周復(fù)查以上項(xiàng)目,供體應(yīng)保持長(zhǎng)期捐贈(zèng)糞便。⑤根據(jù)受體要求,供體需在捐贈(zèng)糞便前5 d限制部分受體不耐受或過敏食物。

本研究方案得到了十堰市國藥東風(fēng)總醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的審查和批準(zhǔn)。FMT治療在湖北省十堰市國藥東風(fēng)總醫(yī)院胃腸外科進(jìn)行,所有試驗(yàn)根據(jù)1964年《赫爾辛基宣言》及其修正案進(jìn)行?；颊吆途栀?zèng)者均被告知FMT的潛在風(fēng)險(xiǎn)和益處及其實(shí)驗(yàn)性質(zhì)。所有參與本研究的對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 腸道和糞便取樣及FMT

菌液制備、保存及檢測(cè)：采用手工法或智能微生物分離系統(tǒng)(南京法邁特)制備菌液,糞便懸液加入無菌甘油濃度達(dá)到10%,-80 ℃保存待用,儲(chǔ)存時(shí)間最長(zhǎng)4周;使用前,37 ℃融化,每次供體取樣制備菌液前及患者FMT前留取小樣,以供后期溯源。

治療流程方案：患者入院后經(jīng)評(píng)估可以行FMT治療,予以留取糞便送檢16S rDNA檢測(cè),置入鼻空腸管,經(jīng)平片確定鼻腸管在位后,行3 d腸道準(zhǔn)備(萬古霉素500 mg,2次/d),連續(xù)6 d通過鼻腸管給予100 mL新鮮菌液,1次/d,5 min內(nèi)灌注完成。1個(gè)月后再行第2個(gè)療程治療。治療結(jié)束后1個(gè)月復(fù)查糞便16S rDNA。

1.3 臨床量表評(píng)估

療效分析采用胃腸生活質(zhì)量指數(shù)(GIQLI)、Wexner便秘評(píng)分及每天記錄的排便日記。精神心理評(píng)估采用SDS、SAS、PSQI,比較治療前后血檢結(jié)果,記錄治療期間及治療后不良反應(yīng)及嚴(yán)重不良事件。

1.4 糞便DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序和生物信息學(xué)方法

按照QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit (QIAGEN,德國)說明書操作提取糞便細(xì)菌總DNA,送往金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心,建立16S rDNA文庫并測(cè)序。經(jīng)質(zhì)量控制后的全基因組DNA樣本采用Ion 16STMMetagenomics Kit(Thermo Scientific)對(duì)細(xì)菌中16S rDNA基因的高變區(qū)(v2-4-6、v3-6、7-9)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用 Ion ReporterTM軟件內(nèi)的 Ion 16STM宏基因組學(xué)分析模塊直接分析,對(duì)復(fù)雜微生物樣品進(jìn)行快速和版定量評(píng)估。采用Life Ion Torrent PGM二代測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。采用IR(Life)對(duì)樣本進(jìn)行聚類分析及菌群注釋,以97%的一致性將所有的序列聚類成OTUs,得到各個(gè)分類水平中的群落結(jié)構(gòu)。計(jì)算alpha多樣性指數(shù),包括物種豐富度(Chao1)和物種多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))。測(cè)序和標(biāo)準(zhǔn)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)處理由金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)提供。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 9進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖,采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,定性資料比較采用χ2檢驗(yàn),獨(dú)立定量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),配對(duì)定量資料采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn),不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用中位數(shù)及四分位數(shù)間距(IQR)描述并采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)(Man-WhitneyU檢驗(yàn))。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料比較

共納入30例STC患者為STC組,其中男13例,女17例,平均年齡(60.37±8.02)歲。共納入20例健康志愿者為對(duì)照組,其中男8例,女12例,平均年齡(61.05±6.56)歲。STC組與對(duì)照組性別、年齡比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有便秘患者病程8～32年,平均(18.03±6.07)年,中位排便時(shí)間為6 d。

2.2 對(duì)照組和STC組糞便微生物群落比較

STC組菌群多樣性較對(duì)照組菌群多樣性低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);在門水平上,STC組和對(duì)照組的類群主要由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、梭桿菌門組成,STC組厚壁菌門相對(duì)豐度較對(duì)照組降低,而變形菌門和梭狀菌門較對(duì)照組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表1。

表1 STC組和對(duì)照組糞便菌群比較

2.3 實(shí)施FMT前后的糞便微生物群落動(dòng)態(tài)變化

STC患者經(jīng)FMT治療后菌群多樣性較治療前升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);門水平上,便秘患者移植后擬桿菌門和梭桿菌門相對(duì)豐度較治療前降低,而厚壁菌門和變形菌門相對(duì)豐度升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖2。STC患者經(jīng)FMT治療后,在門水平上菌群分布也趨向于捐贈(zèng)者的菌群分布。

表2 STC患者FMT前后糞便菌群比較

2.4 FMT治療STC的療效分析及心理評(píng)估

使用FMT治療后,患者的Wexner便秘評(píng)分由原來的15.17分下降至正常水平(<8分),GIQLI評(píng)分也下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。根據(jù)受試者每天記錄的排便日記,可知STC患者的中位排便次數(shù)由每6 d 1次(IQR：5.0～7.0)下降至每2 d 1次(IQR：1.5～2.3),可以認(rèn)為FMT對(duì)STC有效,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

共有6例患者診斷為輕度抑郁,其中5例經(jīng)治療后評(píng)分變?yōu)檎！?例患者診斷為輕度焦慮,1例為中度焦慮,經(jīng)治療后評(píng)分全部變?yōu)檎?。部分患者雖不能診斷焦慮或抑郁,但焦慮、抑郁癥狀明顯改善,評(píng)分較治療前下降明顯。應(yīng)用FMT治療后,患者的SDS評(píng)分、SAS評(píng)分、PSQI均較治療前下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 STC患者實(shí)施FMT前后精神心理評(píng)估及療效評(píng)估 分

2.5 FMT過程中并發(fā)癥發(fā)生情況及安全性分析

經(jīng)過2個(gè)療程治療后,患者體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)、谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酐(CREA)、尿素(UREA)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表4。治療期間有7例患者出現(xiàn)咽痛,考慮為插管引起,未予處置,治療結(jié)束后癥狀消失。5例患者在注射菌液后輕微腹脹,通過實(shí)施注射前后步行0.5 h等措施后癥狀緩解。所有患者治療期間及治療后隨訪6個(gè)月均未出現(xiàn)其他不良反應(yīng)及不良事件。

表4 STC患者實(shí)施FMT前后BMI和血檢指標(biāo)比較

3 討 論

人類腸道微生物群豐富,其中90%以上是細(xì)菌,細(xì)菌數(shù)量繁多,高達(dá)數(shù)萬億株[12-13]。這些微生物群不僅能維持消化道結(jié)構(gòu)及黏膜屏障的完整,還能參與宿主的營養(yǎng)及藥物代謝,調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能,在維持腸道健康和生理功能方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[14-16]。腸道微生物群以特定的數(shù)量和比例存在于不同的腸段中,并維持著共生或?qū)沟年P(guān)系[17]。腸道微生物群及其代謝物和腸黏膜共同形成腸道微生態(tài)并處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),當(dāng)受到多種因素誘導(dǎo)時(shí)則會(huì)導(dǎo)致微生態(tài)失衡,進(jìn)而導(dǎo)致各種疾病[18-19]。

FMT治療作為一種新興的治療方式,目前其臨床應(yīng)用管理已發(fā)表于中國專家共識(shí)[11,20],并常規(guī)應(yīng)用于慢性便秘患者,取得了臨床成功,有效率達(dá)55.47%～72.73%[21-22]。本中心為確保療效,在FMT前進(jìn)行腸道準(zhǔn)備,選擇4周內(nèi)的菌液進(jìn)行移植,鼻空腸管作為移植途徑。STC患者經(jīng)過2個(gè)療程規(guī)范化治療,癥狀緩解明顯。FMT對(duì)胃腸功能性疾病有一定療效,但腸道菌群的機(jī)制和變化仍缺乏臨床和實(shí)驗(yàn)室資料。本研究顯示,便秘患者的菌群多樣性顯著低于健康人群(P<0.05);菌群以厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、梭狀菌門為主,且在門水平上也存在分布差異,具體表現(xiàn)為便秘患者厚壁菌門顯著降低(P<0.05),而變形菌門和梭狀菌門顯著升高(P<0.05),擬桿菌門和放線菌門則無顯著差異(P>0.05)。這與國內(nèi)外部分研究[23-26]不盡相同,究其原因可能為：腸道菌群構(gòu)成受多種因素影響,例如地區(qū)、飲食、年齡、性別等;慢性功能性便秘導(dǎo)致的因素較為復(fù)雜,除腸道微生態(tài)改變外,還與盆底肌功能障礙、中樞或外周神經(jīng)源性障礙等有關(guān)[27]。檢測(cè)患者移植前和移植后1個(gè)月糞便16S rDNA結(jié)果發(fā)現(xiàn),STC患者經(jīng)FMT治療后,菌群多樣性顯著增加(P<0.05),且在門水平上菌群分布也趨向于捐贈(zèng)者的菌群分布。此外,移植途徑對(duì)療效及菌群多樣性和分布均有影響?？诜z囊較難保證菌群穩(wěn)定性;結(jié)腸鏡較易定植,但屬侵入性操作,風(fēng)險(xiǎn)較高。鼻空腸管的臨床療效和可操作性都相對(duì)穩(wěn)定,因此本研究選擇鼻空腸管作為移植方法,且在治療前進(jìn)行腸道準(zhǔn)備,并在FMT治療1個(gè)療程后進(jìn)行第2個(gè)療程鞏固治療,以此提高菌群定植能力和長(zhǎng)期療效。

此外,關(guān)于精神心理因素與功能性便秘的關(guān)系也日益受到重視,研究[28]表明慢性便秘合并焦慮和(或)抑郁的發(fā)生率高達(dá)52.7%。國外研究[29]也表明腸道中部分菌群豐度和抑郁癥的發(fā)生相關(guān),且抑郁、失眠等情緒障礙更易發(fā)生在便秘群體中[30],而在對(duì)抑郁癥患者使用益生菌輔助治療時(shí),患者抑郁癥癥狀明顯改善[31]。目前關(guān)于精神心理評(píng)估的方式種類繁多,選擇不當(dāng)可能會(huì)對(duì)患者和醫(yī)生都產(chǎn)生負(fù)面影響,而自評(píng)量表因具有條目少、省時(shí)、患者依從性高等特點(diǎn),被推薦作為簡(jiǎn)易評(píng)估患者心理狀態(tài)的首選方案。本研究采用SAS、SDS及PSQI評(píng)估STC患者的精神心理狀態(tài),結(jié)果顯示,STC患者焦慮和抑郁的伴隨發(fā)病率分別為23.3%和20.0%,且經(jīng)過FMT治療后,其焦慮評(píng)分和抑郁評(píng)分均顯著下降(P<0.05)。精神心理因素與慢性便秘的關(guān)系及機(jī)制尚未完全明確,但研究[10,14]表明可能與腦腸軸調(diào)節(jié)有關(guān),FMT通過改變腸道菌群,不僅能緩解便秘癥狀,還能通過調(diào)控短鏈脂肪酸、神經(jīng)遞質(zhì)等菌群代謝產(chǎn)物對(duì)腸神經(jīng)系統(tǒng)近端神經(jīng)元進(jìn)行調(diào)控,經(jīng)下丘腦-垂體-腎上腺軸完成對(duì)神經(jīng)精神系統(tǒng)的控制與調(diào)節(jié)。

本研究的局限性：樣本量較少、來源地區(qū)單一,未將地域差異所引起的菌群差異納入觀察指標(biāo),后期需開展多中心、大樣本、更長(zhǎng)時(shí)間隨訪的臨床研究;此外,還應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行菌株水平的鑒定和分類,更直觀、更準(zhǔn)確地對(duì)腸道菌群變化進(jìn)行解讀與分析,為進(jìn)一步的個(gè)體化特定菌株移植提供思路與指導(dǎo)方案。