劉曉偉，殷楚強(qiáng)，叢亞男，王德春，王海龍，楊希重，汪學(xué)松，陳龍偉，王月磊，王亭

宏基因組二代測(cè)序（metagenomic next-generation sequencing,mNGS）技術(shù)是近幾年蓬勃發(fā)展的一門新興診斷技術(shù)[4-5]，它基于核酸水平，可無偏向地一次性覆蓋送檢樣本中涉及的所有病原體，包括細(xì)菌、真菌、病毒甚至寄生蟲等病原微生物。該技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確率高、病原微生物覆蓋廣等特點(diǎn)，目前，已經(jīng)廣泛用于多系統(tǒng)感染的病原學(xué)診斷[4-7]。基于其自身的優(yōu)勢(shì)，未來可能會(huì)成為病原學(xué)診斷的標(biāo)準(zhǔn)方法。本文回顧性分析原發(fā)性脊柱感染患者的臨床資料，探討mNGS 檢測(cè)指導(dǎo)下原發(fā)性脊柱感染保守治療的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019 年12 月至2022 年2 月就診于青島大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱外科疑似脊柱感染的358 例患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)臨床表現(xiàn)、體征、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)及影像學(xué)表現(xiàn)等初步診斷為原發(fā)性脊柱感染；②患者入院時(shí)無嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)；③C 型臂X 線機(jī)輔助下穿刺病灶獲取標(biāo)本；④進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)及mNGS 檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①未按要求完成全部常規(guī)檢查和mNGS 檢測(cè)的患者；②標(biāo)本送檢過程出現(xiàn)明顯外源性污染的患者；③資料不完整或失訪的患者；④病灶位于頸椎或上胸椎部位的患者。根據(jù)以上納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，共47 例患者納入本研究，其中男33 例，女14 例；年齡17～91 歲，平均（63.2±14.4）歲。

本研究已獲得青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：QYFY WZLL27811），并豁免患者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 檢測(cè)內(nèi)容

患者入院時(shí)完善特異性實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，如布魯氏菌抗體及血清凝集試驗(yàn)、結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)、半乳甘露聚糖抗原檢測(cè)、1,3-β-D-葡聚糖檢測(cè)，定期監(jiān)測(cè)血常規(guī)、紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate,ESR）、超敏C 反應(yīng)蛋白（highsensitivity C reactive protein,hs-CRP）、降鈣素原（procalcitonin,PCT）等感染指標(biāo)，入院后和發(fā)熱時(shí)抽取血培養(yǎng)。采取保守治療方案的患者由脊柱外科醫(yī)師在C 型臂X 線機(jī)引導(dǎo)下行病灶穿刺活檢[8]。所有穿刺活檢及開放手術(shù)獲取的標(biāo)本均進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、病理檢查和mNGS檢測(cè)。

1.2.2 抗感染治療方案

換算截面法：源于鋼筋混凝土構(gòu)件計(jì)算，根據(jù)剛度等效原則，將鋼材換算成相當(dāng)截面的混凝土，或反之，通常其計(jì)算結(jié)果較雙單元法偏大。

未取得明確致病微生物前采用經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療，抗生素使用萬古霉素聯(lián)合三代或四代頭孢，或者利福平聯(lián)合左氧氟沙星。待病原微生物培養(yǎng)及mNGS 檢測(cè)結(jié)果回報(bào)后，調(diào)整抗生素種類及用藥療程：化膿性脊柱炎患者常規(guī)抗感染治療12 周，前4 周靜脈給藥，后續(xù)改用同類抗生素口服；布魯氏菌感染患者常規(guī)三聯(lián)用藥（多西環(huán)素、利福平、頭孢曲松鈉）9個(gè)月左右[9-11]；脊柱結(jié)核患者常規(guī)四聯(lián)用藥（異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇）9～12 個(gè)月[12]；如果患者存在高齡、合并免疫缺陷等疾病、并發(fā)膿腫等，抗生素應(yīng)用時(shí)間需適當(dāng)延長。每2 周復(fù)查血常規(guī)、ESR、hs-CRP、PCT 及各項(xiàng)生化指標(biāo)；每4 周復(fù)查病灶部位MRI。當(dāng)患者出現(xiàn)保守治療無效或加重、嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙、病灶部位脊柱穩(wěn)定性喪失時(shí)行手術(shù)治療[13-14]。

1.3 原發(fā)性脊柱感染性疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[12,15]

脊柱感染初發(fā)癥狀常不明顯，缺乏特異性。需結(jié)合患者病史：①病灶部位疼痛，可伴有發(fā)熱等其他癥狀；②病灶節(jié)段MRI 檢查提示椎體或椎間盤信號(hào)改變，可伴有椎間隙改變或膿腫形成；③入院血常規(guī)、hs-CRP、ESR、PCT 等感染指標(biāo)異常，或抗感染治療有效。

1.3.2 病原微生物診斷標(biāo)準(zhǔn)

①化膿性細(xì)菌：病灶標(biāo)本微生物培養(yǎng)或血培養(yǎng)陽性；②布魯氏菌：布魯氏菌抗體陽性且血清凝集試驗(yàn)結(jié)果＞1∶160 或微生物培養(yǎng)陽性[16]；③結(jié)核分枝桿菌：微生物培養(yǎng)、病理檢查或PCR 任一陽性；④真菌：病原微生物培養(yǎng)或病理檢查陽性。

1.3.3 mNGS檢測(cè)陽性標(biāo)準(zhǔn)

檢測(cè)出列最低層級(jí)的微生物，在同類微生物中所占百分比，稱為相對(duì)豐度。查閱同類文獻(xiàn)，對(duì)mNGS檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)擬定：①化膿性細(xì)菌或布魯氏菌：定義為屬相對(duì)豐度＞15%，同時(shí)序列數(shù)＞40 作為診斷的閾值；②結(jié)核分枝桿菌：實(shí)際所測(cè)得序列數(shù)≥1時(shí)，確診為陽性；③真菌：屬相對(duì)豐度＞15%，同時(shí)序列數(shù)＞50；④臨床罕見的細(xì)菌或其他病原體：當(dāng)屬相對(duì)豐度＞10%，同時(shí)序列數(shù)＞10作為診斷標(biāo)準(zhǔn)[15]。

實(shí)際檢測(cè)過程中，背景微生物也會(huì)影響結(jié)果。常見的背景微生物一般來源于樣本采集工具、實(shí)驗(yàn)耗材及文庫構(gòu)建所用試劑等，如伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、羅爾斯頓菌屬（Ralstonia）、鞘氨醇單細(xì)胞菌屬（Sphingomonas）、脫硫化煤菌屬（Desulfocarbo）及莫拉菌屬（Moraxella）等細(xì)菌，以及細(xì)環(huán)病毒、人類皰疹病毒等。判讀mNGS 檢測(cè)結(jié)果時(shí)，背景菌多不被納入致病微生物范疇。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用卡方檢驗(yàn)比較mNGS 檢測(cè)和微生物培養(yǎng)兩種檢測(cè)方式的陽性率，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α取雙側(cè)0.05，以P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納入病例情況

47 例患者的主要臨床表現(xiàn)為病灶疼痛伴發(fā)熱、病灶局限性疼痛和病灶處及下肢疼痛（表1）。結(jié)合患者病史、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)檢查及穿刺或手術(shù)所見等，47 例均被確診為脊柱感染。感染灶位于胸椎、腰椎及胸腰段合并感染（表1）；mNGS 檢測(cè)結(jié)果均在48 h 內(nèi)完成，病原微生物培養(yǎng)完成時(shí)間在5～7 d不等。所有患者最終均治愈出院并隨訪1年。

表1 47例脊柱感染病例結(jié)果分布

2.2 病原微生物診斷結(jié)果

2.2.1 病理及病原微生物培養(yǎng)結(jié)果

47例患者臨床診斷及病理結(jié)果分為4類：①化膿性細(xì)菌感染：30例，鏡下見中性粒細(xì)胞浸潤，慢性化膿性炎，或有死骨存在，偶有膿腫形成；②布魯氏菌感染：10 例，鏡下見炎性細(xì)胞浸潤，增殖性結(jié)節(jié)和肉芽腫形成；③結(jié)核分枝桿菌感染：6 例，鏡下見慢性肉芽腫性炎伴凝固性壞死；④真菌感染：1 例，鏡下見較多炎性細(xì)胞浸潤，壞死物內(nèi)可見多量真菌菌絲。

47例患者微生物培養(yǎng)陽性23例，陰性24例；陽性結(jié)果共發(fā)現(xiàn)3 類微生物，其中化膿性細(xì)菌感染19 例，占比34.0%（19/47），最常見的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌分別為金黃色葡萄球菌（7例）、大腸埃希菌（5例）；布魯氏菌3 例，占比6.4%（3/47）；煙曲霉菌1 例，占比2.1%（1/47）。見表2。

表2 病原微生物培養(yǎng)和mNGS檢測(cè)結(jié)果分布

2.2.2 mNGS檢測(cè)結(jié)果

mNGS 檢測(cè)頻次為48 例次（47 例患者中，其中1例術(shù)前行mNGS 檢測(cè)結(jié)果陰性，最終該患者進(jìn)行手術(shù)治療，術(shù)后再次進(jìn)行mNGS 檢測(cè)，結(jié)果陽性），陽性結(jié)果45 例次，發(fā)現(xiàn)4 類致病微生物，其中化膿性細(xì)菌30 例次，占比為66.7%（30/45），最常見的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌分別為金黃色葡萄球菌（8 例次）、大腸埃希菌（5 例次）；布魯氏菌8 例次，占比為17.8%（8/45）；結(jié)核分枝桿菌6 例次，占比為13.3%（6/45）；煙曲霉菌1例次，占比為2.2%（1/45）。見表2。

6 例結(jié)核感染病例均通過病理檢出，其中2 例結(jié)核桿菌PCR 陽性，涂片、培養(yǎng)均為陰性，mNGS 檢測(cè)結(jié)果均對(duì)應(yīng)檢出。1 例煙曲霉感染患者，病理結(jié)果提示纖維組織增生及炎細(xì)胞浸潤，壞死物內(nèi)可見多量真菌菌絲，微生物培養(yǎng)及mNGS 檢測(cè)均提示陽性。

3 例次mNGS 檢測(cè)陰性病例臨床均表現(xiàn)為患處疼痛，伴感染指標(biāo)升高，細(xì)菌培養(yǎng)陰性。2 例次病理提示慢性化膿性炎伴肉芽組織形成，布魯氏菌抗體結(jié)果陽性，抗布魯氏菌感染治療有效，確診為布魯氏菌感染；1 例穿刺后微生物培養(yǎng)及mNGS 檢測(cè)均為陰性，抗生素經(jīng)驗(yàn)性治療效果不佳，轉(zhuǎn)行手術(shù)清創(chuàng)內(nèi)固定治療，再次行mNGS檢測(cè)提示貝納特柯克斯體。

47例脊柱感染患者中，微生物培養(yǎng)陽性23例，陽性率為48.9%（23/47）；mNGS 檢測(cè)陽性結(jié)果45 例次，陽性率為93.8%（45/48）。病原微生物培養(yǎng)陽性結(jié)果均與mNGS 檢測(cè)有對(duì)應(yīng)。mNGS 檢測(cè)陽性率遠(yuǎn)高于病原微生物培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。微生物培養(yǎng)陰性病例中，23 例可通過mNGS 檢測(cè)獲得對(duì)應(yīng)陽性結(jié)果。其中檢出陽性較多的致病微生物分別為結(jié)核分枝桿菌（6/24）、布魯氏菌（5/24）、鏈球菌（4/24）及葡萄球菌（3/24），因此mNGS 檢測(cè)可對(duì)確診致病微生物起到有效的補(bǔ)充作用。

2.3 轉(zhuǎn)歸與預(yù)后

47例脊柱感染患者中，46例行保守治療并治愈。1 例患者腰痛伴間斷發(fā)熱半年，結(jié)合影像學(xué)檢查，臨床診斷腰椎間盤感染。首次穿刺微生物培養(yǎng)及mNGS 檢測(cè)結(jié)果均為陰性，經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療2 周效果不佳，轉(zhuǎn)行病灶清創(chuàng)內(nèi)固定術(shù)。術(shù)后再次送病理檢查、病原微生物培養(yǎng)及mNGS 檢測(cè)，mNGS 檢出貝納柯克斯體陽性，應(yīng)用多西環(huán)素、羥氯喹抗感染治療后治愈出院。47 例患者均治療康復(fù)出院。所有患者隨訪1年無復(fù)發(fā)，最終臨床治愈。

3 討論

臨床脊柱感染致病微生物的分類主要有化膿性細(xì)菌、布魯氏菌、結(jié)核分枝桿菌及真菌。脊柱感染的臨床表現(xiàn)、體征、影像學(xué)表現(xiàn)及常規(guī)感染指標(biāo)較為相似，臨床對(duì)獲取明確致病菌比較困難。微生物培養(yǎng)仍是診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但對(duì)低毒力菌群及罕見菌陽性率低，且結(jié)果獲取時(shí)間長。以往研究顯示，mNGS檢測(cè)陽性率高于常規(guī)培養(yǎng)，對(duì)于培養(yǎng)陽性率低或培養(yǎng)時(shí)間長的病原體，mNGS 檢測(cè)具有優(yōu)勢(shì)[15]，目前根據(jù)專家共識(shí)，高度疑似感染性疾病，調(diào)整抗感染治療方案同時(shí)應(yīng)開展mNGS檢測(cè)[17]。

本研究中，病原微生物培養(yǎng)陽性率48.9%，難以達(dá)到臨床對(duì)于脊柱感染保守治療的精準(zhǔn)用藥指導(dǎo)的要求。本研究中，mNGS檢測(cè)病原菌的陽性率顯著高于微生物培養(yǎng)，且微生物培養(yǎng)陽性病例均可通過mNGS 檢測(cè)獲得對(duì)應(yīng)致病微生物，這表明，mNGS 檢測(cè)診斷脊柱感染具有更高的檢出率和準(zhǔn)確性，結(jié)合其快速性的優(yōu)勢(shì)，可將其作為確診病原微生物的補(bǔ)充手段[5]。這對(duì)脊柱感染早期抗感染藥物保守治療有顯著意義。本研究中，mNGS 檢測(cè)出現(xiàn)3 例次陰性病例，結(jié)合病例特點(diǎn)分析其原因，不能排除取材過小、獲取病灶為罕見菌或提取菌群濃度偏低的情況；建議對(duì)標(biāo)本獲取精準(zhǔn)化，增加檢驗(yàn)的操作嚴(yán)謹(jǐn)性。且與微生物培養(yǎng)相比，本研究發(fā)現(xiàn)，mNGS 檢測(cè)技術(shù)難以有效分辨致病菌和背景菌，在病原菌鑒定及相對(duì)豐度方面也缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。此外，mNGS檢測(cè)也缺乏針對(duì)性的藥敏結(jié)果，藥物多根據(jù)陽性結(jié)果給予常用的抗生素治療，因此mNGS 檢測(cè)技術(shù)還需繼續(xù)驗(yàn)證其效能，以提高準(zhǔn)確度。

本研究中患者保守治療獲得高治愈率的另一原因與精準(zhǔn)獲取感染標(biāo)本相關(guān)。本研究中，因通過C型臂X 線機(jī)引導(dǎo)對(duì)頸椎及上胸椎等復(fù)雜部位完成穿刺難度大，故排除此類患者，所有納入患者病灶均位于下胸椎或腰椎部位，根據(jù)李寶田等[18]建議，穿刺首選C 型臂X 線機(jī)引導(dǎo)，取樣過程由脊柱外科臨床醫(yī)師嚴(yán)格無菌操作，取樣部位為病灶核心，所有樣本穿刺結(jié)果均滿足取樣要求。臨床醫(yī)師是脊柱感染診療的執(zhí)行者，其參與取樣過程，能夠提高對(duì)穿刺部位的分析準(zhǔn)度；與CT 引導(dǎo)相比，對(duì)于下胸椎或腰骶椎部位，C型臂X 線機(jī)引導(dǎo)穿刺可獲得同樣良好的穿刺結(jié)果。但對(duì)于頸椎及上胸椎等復(fù)雜部位的穿刺，建議優(yōu)先選取CT引導(dǎo)[18-19]。

目前脊柱感染仍需規(guī)范診療標(biāo)準(zhǔn)，楊波等[20]認(rèn)為治療目的在于消除感染、重建和維持脊柱結(jié)構(gòu)和功能及緩解癥狀。牛寧奎等[21]建議先行經(jīng)驗(yàn)性抗感染保守治療，根據(jù)微生物培養(yǎng)及mNGS 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行合理的藥物調(diào)整。Guo 等[22]及Tsai 等[23]則分別建議在抗感染治療前，先行早期病灶清創(chuàng)內(nèi)固定術(shù)等手術(shù)治療。目前兩種觀點(diǎn)并無明確定論，本研究中入組的脊柱感染病例在經(jīng)使用抗生素、鎮(zhèn)痛、營養(yǎng)治療、康復(fù)鍛煉及預(yù)防并發(fā)癥等保守措施治療后，獲得了極高的保守治愈率。如患者無脊柱失穩(wěn)或嚴(yán)重神經(jīng)壓迫癥狀，在排除感染性休克等病重情況后，應(yīng)優(yōu)先選取抗感染藥物治療，并設(shè)計(jì)個(gè)體化保守治療方案[24]。

本研究存在一定的局限性。本研究屬于單中心研究，且病例數(shù)較少，結(jié)果分析中存在一定的偏倚；本研究納入病例為輕型病例，對(duì)結(jié)果分析存在一定偏倚。

4 結(jié)論

原發(fā)性脊柱感染，應(yīng)用抗生素之前即行感染病灶核心部位活檢，并結(jié)合微生物培養(yǎng)及mNGS 檢測(cè)明確致病微生物后，選取敏感抗生素及合理抗感染療程治療，可獲得顯著的治療效果，并能極大降低患者行手術(shù)治療的概率。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突