馮菲,馬靜,李春曉,李春蘭,謝薇

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450000; 2.河南省中藥臨床應(yīng)用、評(píng)價(jià)與轉(zhuǎn)化工程研究中心,河南 鄭州 450000;3.河南省中藥臨床藥學(xué)中醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450000

近年來,腦血管疾病在老年人群的患病率逐漸提高。該病具有較高的致殘率、病死率和復(fù)發(fā)率,嚴(yán)重影響人們健康和生活水平[1]。我國(guó)急性腦梗死占全部腦卒中發(fā)病率的70%[2]。因此,探索急性腦梗死的快速診斷、有效治療方法成為臨床科研的重中之重。舒血寧注射液主要成分為銀杏葉,每片含總黃酮2 mg。其功能為活血化瘀、通脈舒絡(luò)、益氣健腦。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)[3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的理論,從另一角度解釋中藥多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的問題,使中藥藥物研發(fā)具有可預(yù)測(cè)性[4]。本文根據(jù)世界中醫(yī)藥學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)發(fā)布的《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南》[5],利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究舒血寧注射液主要成分——銀杏葉治療急性腦梗死的潛在作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 銀杏葉化合物與靶標(biāo)獲取運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取銀杏葉相應(yīng)的化合物。以口服利用度(oral bio-availability,OB)≥30%、類藥性(drug likeness,DL)≥0.18、半衰期(half-life,HL)≥4 h為條件進(jìn)行化合物篩選。同時(shí)在TCMSP中尋找篩選出來化合物的Pubchem ID號(hào),進(jìn)入數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),搜索Canonical SMILES后進(jìn)入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/),統(tǒng)一轉(zhuǎn)化成基因名稱。

1.2 急性腦梗死基因獲取以“Acute Cerebral Infarction”為關(guān)鍵詞從GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫搜索與急性腦梗死有關(guān)的基因,刪除重復(fù)基因和假陽性基因,與銀杏葉成分基因進(jìn)行匹配,搜集兩數(shù)據(jù)的交集,在韋恩圖在線繪制平臺(tái)(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)進(jìn)行可視化。

1.3 構(gòu)建“中藥-化合物-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖將銀杏葉有效成分、有效成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)以及急性腦梗死疾病對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)輸入Cytoscape3.9.1軟件,構(gòu)建“中藥-化合物-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。在網(wǎng)絡(luò)圖中,節(jié)點(diǎn)(node)代表藥物以及其有效活性成分、疾病、靶點(diǎn)等;邊(edge)分別代表藥物與活性成分、活性成分與活性成分作用靶點(diǎn)、疾病與活性成分作用靶點(diǎn)等之間的相互關(guān)系。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將銀杏葉-急性腦梗死共同作用靶點(diǎn)的基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),獲取PPI關(guān)系,分值越高說明PPI置信度越高,數(shù)據(jù)可靠性越高。將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行可視化,繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 富集分析將關(guān)鍵靶點(diǎn)基因輸入Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1),對(duì)銀杏葉作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析,選擇生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細(xì)胞組成(cellular component,CC)3個(gè)模塊;進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KECG)通路富集分析,以闡釋舒血寧注射液治療急性腦梗死的生物功能及相關(guān)信號(hào)通路。

1.6 分子對(duì)接最終篩選出20種活性成分與靶蛋白基因進(jìn)行DockThor在線(https://dockthor.lncc.br/v2/)分子對(duì)接[6]。篩選出來的活性成分在 Pubchem數(shù)據(jù)庫中下載其3D結(jié)構(gòu),將拓?fù)湫再|(zhì)排名前5位的靶蛋白基因從PDB數(shù)據(jù)庫中下載核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),將配體與受體輸入到Dockthor在線分子對(duì)接平臺(tái)中。利用Autodock Tools 1.5.6軟件進(jìn)行分子對(duì)接。最后采用PyMol 2.4軟件實(shí)現(xiàn)對(duì)接結(jié)果可視化,建立對(duì)接相互作用模式圖。

2 結(jié)果

2.1 舒血寧注射液-銀杏葉主要成分檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫,共收集307種活性成分,再以O(shè)B≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h作為篩選參數(shù),最終篩選出24種活性成分,見表1。

表1 舒血寧注射液藥中銀杏葉活性成分

2.2 舒血寧注射液-急性腦梗死共同靶點(diǎn)的篩選在Genecards數(shù)據(jù)庫中以“Acute Cerebral Infarction”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索,發(fā)現(xiàn)3 548個(gè)潛在作用靶點(diǎn)的基因。在韋恩圖在線繪制平臺(tái)中分別錄入銀杏葉對(duì)應(yīng)的443個(gè)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因與急性腦梗死的 3 548 個(gè)基因,繪制韋恩圖,兩者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點(diǎn)288個(gè),見圖1。

圖1 舒血寧注射液與急性腦梗死交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建并分析使用Cytoscape 3.9.1軟件靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,紅色代表銀杏葉,橙色代表銀杏葉主要的成分,綠色代表舒血寧注射液與急性腦梗死疾病相交靶點(diǎn),并根據(jù)Degree值進(jìn)行分析,度值越高,說明其在網(wǎng)絡(luò)中越重要。結(jié)果顯示銀杏內(nèi)酯(Bilobalide)、芝麻素(sesamin)、異鼠李素(isorhamnetin)等在網(wǎng)絡(luò)中排名較高,可認(rèn)為是舒血寧注射液治療急性腦梗死的主要的活性成分,見圖2。

圖2 急性腦梗死與銀杏葉的“中藥-化合物-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖將銀杏葉對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因與疾病對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因的所得交集基因輸入STRING數(shù)據(jù)分析平臺(tái),分析下載其關(guān)系表格后,根據(jù)關(guān)聯(lián)分?jǐn)?shù)≥0.8進(jìn)行篩選,再運(yùn)用cytoscape 3.9.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖,見圖3。得到互作關(guān)系排名前5位的蛋白為PIK3R1、SRC、MAPK1、EGFR、STAT3。急性腦梗死與銀杏葉的關(guān)鍵靶點(diǎn)及其拓?fù)湫再|(zhì)見表2。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 急性腦梗死與銀杏葉的關(guān)鍵靶點(diǎn)及其拓?fù)湫再|(zhì)

2.5 GO功能富集分析、KEGG通路富集分析將288個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集分析,獲得GO條目1 281個(gè)(P<0.05),分別包括BP 950個(gè),MF 222個(gè),CC 109個(gè);其中包括細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化、系統(tǒng)過程調(diào)節(jié)、MAPK的正調(diào)節(jié)、對(duì)無機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)等。GO條目之間關(guān)系及柱狀圖見圖4。

圖4 銀杏葉藥物活性成分作用急性腦梗死靶點(diǎn)的GO功能富集分析

KEGG通路富集分析共富集178個(gè)條目(P<0.05),篩選排名靠前的20個(gè)條目進(jìn)行可視化分析,繪制條目之間關(guān)系圖及柱狀圖,見圖5。主要包括癌癥通路、刺激神經(jīng)組織的中的交互作用、cAMP信號(hào)通路、蛋白聚糖在癌癥中的應(yīng)用、TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)、磷脂酶D信號(hào)通路等,見表3。

圖5 銀杏葉藥物活性成分作用急性腦梗死靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

表3 舒血寧注射液治療急性腦梗死的KEGG通路富集分析結(jié)果

2.6 分子對(duì)接在TCMSP數(shù)據(jù)庫中最終篩選出20種活性成分與靶蛋白基因進(jìn)行對(duì)接,DockThor在線對(duì)接[6]結(jié)果具體信息見表4。以Bilobalide為例,與EGFR、PIK3R1用Autodock Tools 1.5.6軟件進(jìn)行作用分析,然后將化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)的相互作用模式用PyMol2.4軟件進(jìn)行展示見圖6。

圖6 活性成分Bilobalide與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接圖

表4 主要化學(xué)成分與主要靶蛋白的結(jié)合能

3 討論

作為神經(jīng)內(nèi)科常見病、多發(fā)病之一的急性腦梗死嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[7-8]。目前,急性腦梗死的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,大多認(rèn)為其與血液高凝狀態(tài)、血液流變學(xué)、動(dòng)脈粥樣硬化、側(cè)支循環(huán)血管阻塞及糖尿病等關(guān)系密切[9-10]。如何治療及預(yù)防急性腦梗死的發(fā)生,在降低致死率、致殘率及提高患者生活質(zhì)量方面有重要意義。中醫(yī)藥能從整體觀的角度分析中藥成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)之間的作用關(guān)系,初步探討其治療疾病的內(nèi)在機(jī)理[11]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),探究舒血寧注射液的主要中藥成分——銀杏葉治療急性腦梗死的治療機(jī)制。

采用TCMSP數(shù)據(jù)庫對(duì)舒血寧注射液的主要中藥成分進(jìn)行篩選,篩選出銀杏葉的主要活性成分為24種,根據(jù)與急性腦梗死相關(guān)靶點(diǎn)的分析得知,銀杏內(nèi)酯(Bilobalide)、芝麻素(sesamin)、β-谷甾醇(isorhamnetin)是與急性腦梗死相關(guān)靶點(diǎn)作用最多的化學(xué)成分。有學(xué)者表示,銀杏內(nèi)酯注射液可減輕神經(jīng)功能損傷,調(diào)節(jié)血脂,提高抗氧化能力[12]。β-谷甾醇具有較強(qiáng)的抗炎作用[13]。有研究表明,β-谷甾醇具有較好的降脂作用,可降低機(jī)體對(duì)膽固醇、膽汁酸和膳食脂質(zhì)的吸收與再吸收,患者身體吸收β-谷甾醇后可有效預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化[14]。芝麻素能降低神經(jīng)元損傷,保護(hù)神經(jīng)元[15]。另外,銀杏葉主要活性成分相關(guān)靶點(diǎn)共有443個(gè),急性腦梗死的相關(guān)靶點(diǎn)共有3 543個(gè),兩者通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析得出其相交靶點(diǎn)共有288個(gè),通過對(duì)急性腦梗死與銀杏葉相關(guān)交集靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)湫再|(zhì),其中排名前5位的蛋白為PIK3R1、SRC、MAPK1、EGFR、STAT3。PIK3R1的高表達(dá)可以抑制炎性因子的產(chǎn)生,通過下調(diào)PIK3R1,可產(chǎn)生炎性因子IL-1β、IL-18,進(jìn)而增高細(xì)胞的凋亡率[16]。有研究表明,通過下調(diào)SRC的表達(dá),可促進(jìn)ZO-1的表達(dá),起到腦保護(hù)的作用[16]。研究顯示,MAPK1是TNF信號(hào)通路和氧化應(yīng)激相關(guān)的關(guān)鍵基因之一,在誘發(fā)腦出血中起到重要作用[17]。EGFR是一種生長(zhǎng)因子受體,通過其配體的結(jié)合激活后,可誘導(dǎo)細(xì)胞分化和增殖。受體位于細(xì)胞表面,配體的結(jié)合激活受體細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的酪氨酸激酶。這種酪氨酸激酶磷酸化了許多細(xì)胞內(nèi)底物,激活了細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA合成[18]。STAT3作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,在發(fā)育和成熟組織功能中具有關(guān)鍵作用,包括控制炎癥和免疫應(yīng)答[19]。STAT3在細(xì)胞刺激下調(diào)控多種基因的表達(dá),在細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡中起關(guān)鍵作用[20],最終達(dá)到腦保護(hù)的作用。

通過對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)的通路分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)主要包括cAMP信號(hào)通路(cAMP signaling pathway)、磷脂酶D信號(hào)通路(Phospholipase D signaling pathway)等。cAMP是一種普遍存在的第二信使,調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、分化、增殖和凋亡等許多生物學(xué)過程。cAMP信號(hào)是維持線粒體穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)線粒體動(dòng)力學(xué)、調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)等信號(hào)通路不可或缺的組成部分[21]。磷脂酶D1(phospholipase D1,PLD1)在多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,如細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、分化、膜運(yùn)輸和細(xì)胞骨架組織[22]。

DockThor在線分子對(duì)接結(jié)果中發(fā)現(xiàn),根據(jù)結(jié)合能的數(shù)值推出,篩選出來的20種主要活性成分均能與互作關(guān)系排名前5位的蛋白(PIK3R1、SRC、MAPK1、EGFR、STAT3)結(jié)合并形成氫鍵。當(dāng)結(jié)合能小于0時(shí),蛋白和小分子便可以自發(fā)地進(jìn)行結(jié)合。分子對(duì)接結(jié)果表明,經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到的20種化合物與靶蛋白結(jié)合的結(jié)合能都遠(yuǎn)小于0。

綜上所述,舒血寧注射液主要中藥成分——銀杏葉能夠起到抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用,但仍有一定局限性,所得結(jié)論仍需通過實(shí)驗(yàn)或臨床研究進(jìn)行印證。