劉恒煉，馮 倩，夏 敏

仙旱合劑治療排卵障礙性異常子宮出血療效及機(jī)制探討

劉恒煉，馮 倩，夏 敏*

重慶市中醫(yī)院 婦科，重慶 400021

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析仙旱合劑治療排卵障礙性異常子宮出血（abnormal uterine bleeding‐ovulatory dysfunction，AUB-O）的作用機(jī)制，觀察仙旱合劑治療AUB-O的臨床療效，以及從血液動力學(xué)、血清白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號通路相關(guān)因子水平的變化對其作用機(jī)制進(jìn)行探討。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析仙旱合劑治療AUB-O的活性成分及作用機(jī)制。選擇重慶市中醫(yī)院婦科97例血熱型AUB-O患者，運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組49例和治療組48例。對照組患者口服宮血寧膠囊治療，治療組患者口服仙旱合劑治療，治療持續(xù)10 d。觀察兩組的臨床療效，比較兩組治療前后的出血量、止血時間、D-二聚體水平、血小板數(shù)量、子宮血液動力學(xué)、優(yōu)勢卵泡率以及血清血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）、前列環(huán)素I2（prostaglandin I2，PGI2）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、前列腺素F2α（prostaglandin F2α，PGF2α）水平及IL-17信號通路相關(guān)因子IL-6、IL-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、MMP1、轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的變化情況。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)仙旱合劑治療AUB-O與IL-17信號通路相關(guān)。治療組總有效率為95.8%，對照組總有效率為79.6%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。治療后，兩組出血量隨著治療時間的延長均減少，第7、10天出血量比治療前及第3天顯著減少（＜0.05），第10天出血量顯著少于第7天（＜0.05），第10天出血量治療組顯著少于對照組（＜0.05）；治療組止血時間顯著短于對照組（＜0.05）。治療后，與治療前比較，治療組患者子宮動脈子宮動脈收縮期最大血流速度/舒張末期血流速度（S/D）、阻力指數(shù)（RI）升高，D-二聚體下降（＜0.05），對照組改善不明顯，且治療組S/D顯著高于對照組（＜0.05）。治療后，兩組血小板數(shù)量與治療前比較顯著增加，且治療組血小板數(shù)量多于對照組（＜0.05）。治療后，治療組優(yōu)勢卵泡率58.3%，對照組優(yōu)勢卵泡率26.5%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。治療后，治療組血清PGI2、PGE2水平明顯降低（＜0.05），兩組血清PGF2α、TXA2水平明顯升高（＜0.05），且治療組血清PGI2水平優(yōu)于對照組（＜0.05）。治療后，治療組血清IL-6、IL-1β、MMP9、MMP1、NF-κB、AP-1、COX-2水平與治療前比較均顯著下降（＜0.05），且治療組血清IL-6、IL-1β、AP-1、COX-2水平與對照組比較均顯著降低（＜0.05）。仙旱合劑治療AUB-O療效確切，其止血機(jī)制與增加血小板數(shù)量使血小板聚集、增加子宮動脈血流阻力，收縮子宮螺旋動脈相關(guān)。仙旱合劑可通過IL-17信號通路中的有效靶點(diǎn)，降低血清炎性因子的分泌，阻斷COX-2誘導(dǎo)PGE2的生成，起到止血的作用。

排卵障礙性異常子宮出血；仙旱合劑；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；IL-17信號通路；止血作用

異常子宮出血（abnormal uterine bleeding，AUB）是指非妊娠期或妊娠期婦女源自宮腔的出血，是婦科常見病，發(fā)病率11%～13%。排卵障礙性異常子宮出血（AUB‐ovulatory dysfunction，AUB-O）在臨床比較常見，臨床表現(xiàn)為月經(jīng)的規(guī)律喪失，經(jīng)期延長超過7 d或少于3 d，月經(jīng)量過多（＞80 mL）或過少（＜20 mL）[1]。國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟將其統(tǒng)一命名并進(jìn)行了分類。AUB可引起患者貧血、繼發(fā)感染、不孕，可能伴發(fā)子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜惡變，我國也根據(jù)國際分類形成專家共識[2-3]。AUB不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并對患者的精神造成負(fù)擔(dān)[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)在治療AUB-O上主要使用激素治療和手術(shù)治療[5]?？诜に刂委熁颊咭缽男圆?，并具有一定副作用，患者對手術(shù)的接受度較差，并且病情容易反復(fù)，對大部分功能性出血不能起到根治作用。通過研究證實(shí)中醫(yī)藥治療AUB-O是有效的并通過專家共識得以推薦[6-7]。本課題組前期對血熱型AUB-O患者進(jìn)行療效觀察，發(fā)現(xiàn)仙旱合劑止血效果穩(wěn)定，并能緩解患者癥狀、體征，改善患者的凝血相關(guān)指標(biāo)[8]。仙旱合劑由仙鶴草、旱蓮草、側(cè)柏葉、地黃、丹皮、甘草、槐角、白及、荊芥炭、白茅根、地榆11味中藥組成，可涼血、止血，用于痔漏及內(nèi)臟出血。宮血寧膠囊作為治療血熱型崩漏出血的上市藥物，具有涼血止血的作用，故選作本研究的對照藥物。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析仙旱合劑治療AUB-O的機(jī)制，通過觀察口服藥物后在不同時間點(diǎn)的出血量及治療前后的血液指標(biāo)的變化情況，驗證仙旱合劑的止血效果，并探討仙旱合劑治療AUB-O的機(jī)制，為臨床藥物研究奠定基礎(chǔ)。

1 仙旱合劑網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1 仙旱合劑活性成分及靶點(diǎn)的篩選

借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）檢索仙旱合劑中11味藥材的所有化學(xué)成分，以藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18作為篩選條件，篩選較高活性的化合物。然后在TCMSP平臺獲取化合物對應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，同時使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Uniprot Database）篩選出物種為“人”的靶點(diǎn)。

1.2 疾病靶點(diǎn)的篩選及與活性成分靶點(diǎn)交集

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，獲得AUB-O疾病以及藥物有效成分相關(guān)靶點(diǎn)，取交集后篩選出共同作用靶點(diǎn)。

1.3 “活性成分-靶蛋白-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

采用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建仙旱合劑治療AUB-O的“活性成分-靶蛋白-疾病”共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖，其中發(fā)現(xiàn)仙旱合劑與AUB-O相關(guān)的有效成分和共同靶點(diǎn)。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（protein-proteininteraction，PPI）網(wǎng)絡(luò)

將篩選得到的疾病-藥物成分共同靶蛋白在String平臺構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，將蛋白種類設(shè)置為“homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為“high confidence（0.7）”，其他保持默認(rèn)設(shè)置，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析

2 臨床研究

2.1 資料來源與試驗設(shè)計

本研究病例均為2016年10月—2019年10月重慶市中醫(yī)院婦科收治的AUB-O患者，辨證屬血熱型。依照比例1∶1隨機(jī)分配為對照組和治療組，比較類型為差異性檢驗，且以綜合療效指數(shù)為主要評價指標(biāo)。根據(jù)前期研究結(jié)果、相關(guān)文獻(xiàn)專家估計[8]，計算得出所需樣本量為45，兩組共計100例，借助SAS統(tǒng)計分析系統(tǒng)，產(chǎn)生隨機(jī)分組表，患者入組序號即為受試者序號，每個患者根據(jù)對應(yīng)受試者序號接受相應(yīng)的治療方案。本研究通過重慶市中醫(yī)院倫理審查，批號2016-KY-12。

2.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

2.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)美國美國婦產(chǎn)科學(xué)會指南和國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟最新修訂指南[9]制定：（1）與正常月經(jīng)的周期頻率、規(guī)律性、經(jīng)期長度、經(jīng)期出血量任何1項不符的、源自子宮腔的異常出血，并且包括近期在出血量、頻率、持續(xù)時間和疼痛的改變。（2）患者不伴有其他疾病（如甲狀腺疾病、高血壓、腎臟疾病、厭食癥或暴食癥、精神病和其他一些慢性?。?。（3）患者未使用類似或相關(guān)藥物治療。

2.2.2 中醫(yī)證候血熱證診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[10]以及《中醫(yī)婦科臨床診療指南》[11]擬定：（1）突然出血，量多，或淋漓不盡，色深紅，質(zhì)黏稠；（2）頭暈面赤；（3）煩渴；（4）大便秘結(jié)，小便黃；（5）舌質(zhì)紅絳或舌尖紅，舌苔黃或黃膩；（6）脈數(shù)或弦數(shù)、洪數(shù)。具備上述（1）和其他任何3項即可診斷。

2.3 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)及終止標(biāo)準(zhǔn)

2.3.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）符合西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)并為出血期患者；（2）符合中醫(yī)血熱型辨證的標(biāo)準(zhǔn)；（3）年齡14～49歲；（4）患者或其法定監(jiān)護(hù)人愿意參加本研究并簽署患者知情同意書。

上述樣品均加溶劑適量，機(jī)械振搖至分散均勻，再超聲處理10 min使溶解，放冷，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，離心，濾過，取續(xù)濾液進(jìn)樣，記錄色譜圖。

2.3.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）先天性生殖器官發(fā)育異常導(dǎo)致功血者以及婦科內(nèi)外生殖器器官、生殖道的損傷、病變、感染等；（2）妊娠和產(chǎn)褥期相關(guān)出血；（3）近3個月內(nèi)服用激素類藥物或其他可引起月經(jīng)失調(diào)的藥物；（4）血紅蛋白＜90 g/L的患者；（5）染色體異常；（6）合并有嚴(yán)重心血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等原發(fā)性疾??；（7）精神病患者；（8）過敏體質(zhì)或?qū)Ρ狙芯克幬锝M成成分過敏者。

2.3.3 終止標(biāo)準(zhǔn) （1）未能堅持按時服藥或采用其他藥物治療者；（2）無任何檢測記錄者；（3）患者3個月內(nèi)參加其他臨床試驗；（4）研究過程中發(fā)現(xiàn)患有其他病，需要用其他藥物或非藥物治療者；（5）對于入組研究觀察的患者超過10 d未止血者建議患者終止觀察，改用其他藥物或手段干預(yù)。

2.4 治療方法

2.4.1 治療藥物 仙旱合劑為院內(nèi)制劑，由重慶市中醫(yī)院制劑室生產(chǎn)（渝藥制字Z20051115，生產(chǎn)批號180801），規(guī)格：100 mL/瓶。宮血寧膠囊由云南白藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)（國藥準(zhǔn)字Z20020087，生產(chǎn)批號ZMA1701），規(guī)格：0.13 g×18粒/瓶。

2.4.2 給藥方法 治療組患者口服仙旱合劑每次30 mL，3次/d連續(xù)服用。對照組患者口服宮血寧膠囊，每次2粒，3次/d，連續(xù)服用。兩組均連續(xù)服藥，血止后停藥，最長給藥時間不超過10 d。對于超過10 d未止血者建議患者終止觀察，改用其他藥物或手段干預(yù)。前期觀察數(shù)據(jù)納入本研究，終止觀察后數(shù)據(jù)不納入本研究。

2.5 療效標(biāo)準(zhǔn)

參照國家衛(wèi)生部頒發(fā)的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中醫(yī)證候評分標(biāo)準(zhǔn)對患者治療前后癥狀進(jìn)行積分。依據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[11]擬定臨床治愈、顯效、有效及無效標(biāo)準(zhǔn)。（1）治愈：陰道血止，癥狀積分減少＞95%；（2）顯效：陰道血止，癥狀積分減少＞70%；（3）有效：陰道出血控制，癥狀積分減少＞30%；（4）無效：陰道出血未停止，其他癥狀無改善，癥狀積分減少＜30%。

總有效率＝（治愈例數(shù)＋顯效例數(shù)＋有效例數(shù)）/總例數(shù)

2.6 觀察指標(biāo)

2.6.1 出血量、止血時間 在治療第3、7、10天分別記錄患者出血量和止血時間。根據(jù)月經(jīng)失血圖法評分測量出血量。

2.6.2 血液指標(biāo)及血清因子水平 治療前后靜脈采血，血細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)兩組患者血小板，全自動血凝儀檢測D-二聚體水平；利用彩超檢測子宮動脈血流動力血指標(biāo)子宮動脈收縮期最大血流速度/舒張末期血流速度（S/D）、阻力指數(shù)（RI）和優(yōu)勢卵泡率（卵泡＞15 mm則視為有優(yōu)勢卵泡）；靜脈血以3000 r/min分離血清后，采用ELISA法檢測血清血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）、前列環(huán)素I2（prostaglandin I2，PGI2）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、前列腺素F2α（prostaglandin F2α，PGF2α）的水平，檢測試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)。

2.6.3 白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號通絡(luò)相關(guān)因子水平 采用ELISA法檢測血清中白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP9）、MMP1、轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）水平，嚴(yán)格按照試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）說明書操作。

2.7 不良反應(yīng)觀察

治療期間檢查患者血常規(guī)、肝功能，并記錄服藥過程中出現(xiàn)的不良反應(yīng)。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

3.1.1 藥物-疾病共同作用靶點(diǎn) 獲得與候選化合物134種，相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白235個。通過檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫，獲得AUB-O疾病靶點(diǎn)2993個，與藥物有效成分相關(guān)靶點(diǎn)取交集后篩選出共同作用靶點(diǎn)158個（圖1）。

圖1 仙旱合劑治療AUB-O靶點(diǎn)韋恩圖

3.1.2 “活性成分-靶蛋白-疾病”共表達(dá)網(wǎng)絡(luò) 采用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建仙旱合劑治療AUB-O“活性成分-靶蛋白-疾病”網(wǎng)絡(luò)，其中仙旱合劑與AUB-O相關(guān)的有效成分有122種，共同作用于158個靶點(diǎn)（圖2）。網(wǎng)絡(luò)圖表明同一活性成分作用不同的靶點(diǎn)，同一作用靶點(diǎn)也可對應(yīng)于不同的活性成分，顯示出仙旱合劑通過多成分、多靶點(diǎn)途徑治療AUB-O。3.1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn) 利用String平臺構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，利用Cytohubba插件中degree算法篩選出度值大于平均度值（16.1）的前50個作用最強(qiáng)靶蛋白（圖3），這些靶蛋白在網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵作用。

不同顏色和形狀的節(jié)點(diǎn)分別代表活性成分和作用靶點(diǎn)，邊代表活性成分和疾病作用靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系

圖3 疾病預(yù)測靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中核心靶蛋白

3.1.4 GO功能和KEGG途徑富集分析 對158個共作用靶蛋白進(jìn)行GO注釋，尋找仙旱合劑治療功能性異常子宮出血所參與的生物學(xué)過程。通過Cluster Profiler R軟件對158個靶蛋白進(jìn)行GO富集分析，分析關(guān)鍵靶點(diǎn)參與的生物過程。仙旱合劑治療功能性異常子宮出血的靶點(diǎn)影響了166個生物學(xué)過程，（圖4-A、B）。借助ClusterProfiler R軟件對仙旱合劑治療功能性異常子宮出血的158個共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，以＜0.05為篩選條件，篩選出通路共160條，排名前20的通路見圖5-A、B。通過查閱文獻(xiàn)以及前期研究基礎(chǔ)，AUB-O可能與炎癥相關(guān)，因此推測IL-17信號通路可能是仙旱合劑作用于AUB-O的主要信號通路，并查找出可能參與通路作用的相關(guān)因子有IL-6、IL-1β、MMP9、MMP1、NF-κB、AP-1、COX-2。

3.2 臨床研究結(jié)果

3.2.1 兩組基線資料比較 因研究中脫落3例患者，最終對照組49例和治療組48例。治療組患者年齡16～49歲，平均（35.48±6.22）歲，病程2.5～6個月，平均（3.35±2.56）個月；對照組患者年齡14～50歲，平均（36.91±7.48）歲，病程2.5～6.5個月，平均（3.65±2..13）個月。兩組患者的年齡、病程資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05），具有可比性。

3.2.2 臨床療效 治療組治愈24例，顯效12例，有效10例，無效2例，總有效率為95.8%；對照組治愈14例，顯效15例，有效10例，無效10例，總有效率為79.6%；兩組總有效率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），見表1。

A-預(yù)測靶點(diǎn)的GO功能分析柱狀圖 B-預(yù)測靶點(diǎn)的GO功能分析氣泡圖

3.2.3 兩組優(yōu)勢卵泡率比較 經(jīng)彩超檢查，治療前治療組優(yōu)勢卵泡率23.8%，對照組優(yōu)勢卵泡率24.2%，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。治療后，治療組有優(yōu)勢卵泡者28例，無優(yōu)勢卵泡者20例，優(yōu)勢卵泡率58.3%；對照組有優(yōu)勢卵泡者13例，無優(yōu)勢卵泡者36例，優(yōu)勢卵泡率26.5%。兩組相比，治療組優(yōu)勢卵泡率明顯高于對照組（＜0.05）。見表1。

3.2.4 兩組止血時間及出血量比較 治療前兩組出血量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。治療后治療組患者止血時間顯著短于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。治療后，兩組出血量隨著治療時間的延長均減少，第7、10天出血量比治療前及第3天顯著減少（＜0.05），第10天出血量顯著少于第7天（＜0.05），第10天出血量治療組顯著少于對照組（＜0.05），見表2。

3.2.5 兩組血小板、D-二聚體、子宮動脈血流動力學(xué)比較 治療前兩組血小板、D-二聚體、子宮動脈血流動力學(xué)指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。治療后，治療組患者子宮動脈S/D、RI較治療前升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；對照組子宮動脈S/D、RI較治療前有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）；治療后，治療組S/D顯著高于對照組（＜0.05）。治療后，兩組血小板數(shù)量與治療前比較顯著增加，且治療組血小板數(shù)量多于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。治療后，兩組D-二聚體均下降，與治療前比較治療組下降明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），對照組下降不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。見表3。

A-預(yù)測靶點(diǎn)的KEGG分析柱狀圖 B-預(yù)測靶點(diǎn)的GO功能分析氣泡圖

表1 兩組患者總有效率和排卵率比較

與對照組比較：*＜0.05

*< 0.05control group

表2 兩組患者出血量及止血時間的比較()

與同組治療前比較：*＜0.05；與對照組治療后同期比較：▲＜0.05；與同組第3天比較：&＜0.05；與同組第7天比較：?＜0.05

*< 0.05same group before treatment;▲< 0.05control group in same period after treatment;&< 0.05same group on day 3;?< 0.05same group on day 5

3.2.6 兩組血清PGI2、PGE2、PGF2α、TXA2水平比較 治療前兩組血清PGI2、PGE2、PGF2α、TXA2水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。治療后，治療組血清PGI2、PGE2水平明顯降低（＜0.05），對照組血清PGI2、PGE2水平無明顯改善。兩組血清PGF2α、TXA2水平明顯升高（＜0.05），且治療組血清PGI2水平優(yōu)于對照組（＜0.05）。見表4。

3.2.7 兩組血清IL-6、IL-1β、MMP9、MMP1水平比較 治療前兩組血清IL-6、IL-1β、MMP9、MMP1水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。治療后，治療組血清IL-6、IL-1β、MMP9、MMP1水平與治療前比較均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；對照組治療后血清MMP9、MMP1水平與治療前比較均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），但I(xiàn)L-6、IL-1β雖有所下降，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。治療后，治療組IL-6、IL-1β水平與對照組比較均顯著降低（＜0.05）。見表5。

3.2.8 兩組血清NF-κB、AP-1、COX-2水平比較 治療前兩組血清NF-κB、AP-1、COX-2水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。治療后，與治療前比較，治療組血清NF-κB、AP-1、COX-2水平均顯著下降（＜0.05），對照組血清NF-κB水平顯著下降（＜0.05），AP-1、COX-2水平無明顯改變（＞0.05）。治療后，治療組血清AP-1、COX-2水平均比對照組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。見表6。

3.2.9 安全性評價 治療前后對兩組患者的血常規(guī)、尿常規(guī)、大便常規(guī)、心電圖、肝腎功能進(jìn)行檢測，未發(fā)現(xiàn)異?；蛑委熐爱惓６委熀螽惓＜又夭±煶讨形匆娕c藥物相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生。

表3 兩組血小板、D-二聚體、子宮動脈血流動力學(xué)比較()

與同組治療前比較：*＜0.05；與對照組治療后比較：▲＜0.05

*< 0.05same group before treatment;▲< 0.05control group after treatment

表4 兩組血清PGI2、PGE2、PGF2α、TXA2水平的比較()

與同組治療前比較：*＜0.05；與對照組治療后比較：▲＜0.05

*< 0.05same group before treatment;▲< 0.05control group after treatment

表5 兩組血清IL-6、IL-1β、MMP9、MMP1水平比較()

與同組治療前比較：*＜0.05；與對照組治療后比較：▲＜0.05

*< 0.05same group before treatment;▲< 0.05control group after treatment

表6 兩組NF-κB、AP-1、COX-2比較()

與同組治療前比較：*＜0.05；與對照組治療后比較：▲＜0.05

*< 0.05same group before treatment;▲< 0.05control group after treatment

3 討論

國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟將AUB分為9大類，其中AUB‐O最為常見，約占AUB的50%[2]，排卵障礙包括無排卵、稀發(fā)排卵與黃體功能不足。無排卵常見于青春期、絕經(jīng)過渡期出血，稀發(fā)排卵常見于育齡期多囊卵巢綜合征、卵巢功能減退等。AUB‐O臨床表現(xiàn)有急性出血和慢性出血之分，該病見于中醫(yī)“崩漏”“月經(jīng)先期”“月經(jīng)過多”“經(jīng)期延長”“經(jīng)間期出血”范疇，但排除“月經(jīng)后期”“月經(jīng)過少”。

中醫(yī)認(rèn)為，AUB‐O的主要病機(jī)為沖任損傷，不能制約經(jīng)血，胞宮蓄溢失常，導(dǎo)致經(jīng)血非時妄行。常見病因有脾虛、腎虛、血熱、血瘀等[12]，腎虛是AUB-O的根本內(nèi)因，熱擾沖任是AUB-O的主要病機(jī)，瘀血是病理產(chǎn)物[13]。臨床中血熱型AUB最常見、比例大，因此在治療血熱型AUB需治病求本——補(bǔ)腎滋陰、清熱涼血、化瘀止血。本課題前期研究已經(jīng)證實(shí)仙旱合劑在止血方面的療效是確切的，該藥的方藥成分亦具有滋陰清熱、涼血化瘀止血的作用[8]，本研究通過多途徑研究探索其止血機(jī)制。

3.1 仙旱合劑止血效果可能與改善凝血功能、血流動力學(xué)有關(guān)

本研究顯示，治療組總有效率為95.8％，顯著高于對照組為79.6%。仙旱合劑治療后患者止血時間短于對照（宮血寧膠囊）組，并且總出血量少于對照組，兩組治療過程中未見明顯不良反應(yīng)發(fā)生。上述結(jié)果提示了仙旱合劑療效優(yōu)于宮血寧膠囊，且安全性較好。仙旱合劑在止血、改善癥狀方面療效確切。

D-二聚體是纖維蛋白的降解產(chǎn)物，主要反映纖維蛋白的溶解功能，其水平升高可反映繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)，纖溶亢進(jìn)可能是AUB的機(jī)制之一，仙旱合劑治療后患者D-二聚體水平下降說明其在抑制纖溶活性增強(qiáng)方面產(chǎn)生作用；治療后患者血小板數(shù)量增加、子宮動脈血流阻力增加、子宮內(nèi)膜厚度變薄，說明仙旱合劑在改善凝血功能方面可能與其活性成分參與內(nèi)源性凝血途徑發(fā)揮凝血功能有關(guān)，并能增加子宮動脈阻力，減低子宮血流灌注，加速內(nèi)膜壞死、崩潰、脫落，促進(jìn)子宮血竇關(guān)閉，子宮收縮、復(fù)舊，使患者身體從異常的凝血機(jī)制逐漸恢復(fù)為正常。

3.2 仙旱合劑可通過IL-17信號通路治療AUB-O出血

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，仙旱合劑可通過多成分、多途徑、多靶點(diǎn)治療AUB-O。課題組選取其中IL-17信號通路中的靶點(diǎn)進(jìn)行ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，患者服用仙旱合劑10 d后，血清中IL-6、IL-1β、MMP9、MMP1、AP-1（JUN）、COX-2、NF-κB均下降。

現(xiàn)代研究表明，月經(jīng)來潮的機(jī)制主要涉及2方面的問題：一是螺旋動脈血管活性的變化。血管活性的變化除了受雌孕激素的周期性影響之外，還受局部的前列腺素、內(nèi)皮素、NO等血管活性物質(zhì)的影響；二是組織破壞，即MMPS及其組織抑制劑金屬蛋白酶-1（tissue inhibitor metalloproteinase-1，TIMP-1）間的平衡失調(diào)導(dǎo)致組織崩解，血管脆性增加，破裂引起出血[14-15]。因此有學(xué)者認(rèn)為，AUB也與這2個方面息息相關(guān)。炎癥會導(dǎo)致子宮內(nèi)膜螺旋動脈發(fā)生損傷，從而引起異常出血。子宮內(nèi)膜局部炎癥時，粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞顯著增加，二者除可以合成分泌PGE、PGI2和纖維蛋白溶酶激活劑（plamnipen activator，PA）外，還可釋放松弛素，使內(nèi)膜中局部的網(wǎng)狀纖維分解，造成內(nèi)膜松弛、崩潰而不規(guī)則脫落，致使經(jīng)間期出血和遷延不愈的出血[16]。

IL-17信號通路中被激活細(xì)胞的NF-κB、AP-1因子誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6等促炎癥細(xì)胞因子，這些促炎因子作用于子宮內(nèi)膜能通過IL-17誘導(dǎo)的IL-6維持輔助性T細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）細(xì)胞數(shù)量，從而形成正反饋確立一種慢性炎癥狀態(tài)[17]。IL-17還能刺激多種趨化因子，這些因子將招募粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞與淋巴細(xì)胞從而加重炎癥。長期炎癥刺激子宮內(nèi)膜會導(dǎo)致部分子宮內(nèi)膜壞死，IL-17信號通路可以降解胞外MMP1、2、3、9、13參與到這個過程中。MMPs可以水解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中多種成分，以促進(jìn)經(jīng)血纖溶及子宮內(nèi)膜的剝脫[18]。IL-17還可通過COX-2誘導(dǎo)PGE2[19]，PGE2的擴(kuò)血管作用也能促進(jìn)炎癥細(xì)胞進(jìn)入炎癥部位，吞噬免疫復(fù)合物及釋放溶酶體，包括中性蛋白酶和膠原酶，造成子宮異常出血。

PGE2是脂代謝產(chǎn)物，其合成受COX-2影響，在發(fā)熱、炎癥、血管舒縮過程中發(fā)揮重要作用，在炎癥產(chǎn)生的過程中具有促進(jìn)炎癥發(fā)生和擴(kuò)張血管作用，月經(jīng)過多患者PGE2的合成分泌較正常月經(jīng)女性增多[20-21]。而PGF2α是一種強(qiáng)有力的血管收縮劑[22]，可以通過前列腺素F受體（prostaglandin F receptor gene，PTGFR）促使局部組織缺血誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子lα（hypoxia-inducible factor 1α，HIFla）表達(dá)，進(jìn)而HIFla通過正反饋直接調(diào)控PTGFR的表達(dá)，維持必要的低氧環(huán)境。PGF2α和其他血管收縮劑（如內(nèi)皮素-1）導(dǎo)致螺旋小動脈收縮，從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜功能層的缺氧，以致子宮內(nèi)膜壞死脫落[23]。PGF2α和PGE2主要存在于子宮內(nèi)膜上，在月經(jīng)周期的增生期合成，月經(jīng)期含量最多。

TXA2是血小板在血小板環(huán)氧化物和血小板氧化酯酶的氧化作用下生成的代謝產(chǎn)物，是縮血管物質(zhì)，并能使血小板聚集；PGI2與TXA2的作用相反，其是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放，具有較強(qiáng)的抗血小板凝集作用，還可舒張動脈。PGI2/TXA2通路參與炎癥和腫瘤的調(diào)節(jié)過程。在AUB時PGI2與TXA2、PGF2α和PGE2的平衡被打破，PGI2與PGE2升高，PGF2α與TXA2下降，PGE2/PGF2α增大，擴(kuò)血管、抗凝、抗血小板聚集的活性增強(qiáng)，表現(xiàn)為出血時間延長、出血量過多，在中醫(yī)學(xué)中與“血瘀證”的表現(xiàn)相契合，因此是“血瘀證”的重要分子標(biāo)志物[24]。治療組患者PGI2與PGE2明顯降低，PGF2α與TXA2明顯升高。仙旱合劑的方藥組成中含有大量化瘀、清熱、涼血止血的藥物，與本研究的機(jī)制相吻合。仙旱合劑并可以增加血小板含量，并糾正出血期PGI2與TXA2、PGF2α和PGE2的失衡，增加血小板聚集，收縮螺旋動脈，從而起到止血的作用。

3.3 仙旱合劑可能通過改善排卵達(dá)到止血作用

血熱型崩漏治療不僅要“塞流”，還需要“澄源”和“固本”。仙旱合劑為復(fù)方中藥，其中藥物不僅有清熱涼血、化瘀止血的作用，起到止血塞流的作用，其中的地黃、墨旱蓮等中藥具有滋陰補(bǔ)腎的作用，說明仙旱合劑亦有“澄源”和“固本”的作用。對于AUB-O，經(jīng)血排出到排卵期之間是經(jīng)后期，夏桂成教授認(rèn)為經(jīng)后期應(yīng)滋陰養(yǎng)血以奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，此期是陰分恢復(fù)和滋長的時期，調(diào)治應(yīng)以補(bǔ)陰為主[25]。方中的滋陰藥物恰好起到相應(yīng)的作用。本研究中治療組患者優(yōu)勢卵泡率明顯高于對照組，由此推測仙旱合劑中藥物可能通過改善患者排卵功能，達(dá)到止血功能，其間的機(jī)制值得進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

仙旱合劑治療AUB-O療效確切，其作用機(jī)制與其活性成分參與凝血機(jī)制的調(diào)節(jié)，增加子宮動脈阻力，減低子宮血流灌注有關(guān)，從而促進(jìn)子宮血竇關(guān)閉，子宮收縮、復(fù)舊，使患者身體從異常的凝血機(jī)制逐漸恢復(fù)到正常。通過調(diào)節(jié)IL-17信號通路，降低血清炎性因子PGI2、PGE2、PGF2α、TXA2水平，糾正出血期的失衡狀態(tài)，起到增加血小板含量和血小板聚集，收縮螺旋動脈，達(dá)到止血的作用。仙旱合劑還可能促進(jìn)AUB-O患者卵泡發(fā)育，改善患者排卵功能，增強(qiáng)止血作用。由于仙旱合劑中藥組成眾多，今后還需進(jìn)一步研究其有效成分及其藥理機(jī)制，以便進(jìn)行新藥開發(fā)和推廣。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Curative effect and mechanism of Xianhan Mixture in treatment of abnormal uterine bleeding‐ovulatory dysfunction

LIU Heng-lian, FENG Qian, XIA Min

Department of Gynecology, Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Chongqing 400021, China

To observe the clinical efficacy of Xianhan Mixture (仙旱合劑) in the treatment of abnormal uterine bleeding‐ovulatory dysfunction (AUB-O), analyze its active ingredients and signal pathway through network pharmacology, and explore the mechanism in hemodynamics and interleukin-17 (IL-17) signal pathway.The active ingredients and mechanism of Xianhan Mixture in the treatment of AUB-O were analyzed by network pharmacology. A total of 97 cases of hemothermic AUB-O were selected from the department of gynecology in Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine. They were randomly divided into control group (49 cases) and treatment group (48 cases). The control group was given Gongxuening Capsule (宮血寧膠囊) orally, and the treatment group was given Xianhan Mixture orally for 10 d. The clinical effect of the two groups was observed. The bleeding volume, bleeding time, D-dimer level, platelet count, uterine hemodynamics, dominant follicle rate and serum thromboxane A2(TXA2) and prostaglandin I2(PGI2), prostaglandin E2(PGE2), prostaglandin F2α (PGF2α) level and IL-17 signaling pathway related factors IL-6, IL-1β, matrix metalloproteinase 9 (MMP9), MMP1, activator protein-1 (MMP1), activator protein-1 (AP-1), cyclooxygenase-2 (COX-2), and nuclear factor-κB (NF-κB) were compared between the two groups before and after treatment.Through network pharmacological analysis, it was found that the treatment of AUB-O by Xianhan Mixture was related to IL-17 signaling pathway. The total effective rate was 95.8% in the treatment group and 79.6% in the control group, the treatment group was superior to the control group (< 0.05). After treatment, the bleeding volume in the two groups decreased with the extension of treatment time, the bleeding volume in the 7th and 10th day was significantly reduced compared with that before treatment and the 3rd day (< 0.05), the bleeding volume in the 10th day was significantly less than that in the 7th day (< 0.05), and bleeding volume in the 10th day was significantly less than that in the control group (< 0.05); The bleeding time in the treatment group was less than that in the control group (< 0.05). After treatment, compared with before treatment, the maximum systolic blood velocity/end-diastolic blood velocity (S/D) and resistance index (RI) of uterine artery in the treatment group were increased, and D-dimer was decreased (< 0.05), while the improvement was not obvious in the control group, and S/D in the treatment group was significantly higher than that in the control group (< 0.05). After treatment, the number of platelets in the two groups was significantly increased compared with that before treatment, and the number of platelets in the treatment group was higher than that in the control group (< 0.05). After treatment, the dominant follicle rate was 58.3% in the treatment group and 26.5% in the control group, and the difference between the two groups was statistically significant (< 0.05). After treatment, serum PGI2and PGE2levels in the treatment group were significantly decreased (< 0.05), serum PGF2α and TXA2levels in the two groups were significantly increased (< 0.05), and serum PGI2levels in the treatment group were better than those in the control group (< 0.05). After treatment, serum levels of IL-6, IL-1β, MMP9, MMP1, NF-κB, AP-1 and COX-2 in treatment group were significantly decreased compared with before treatment (< 0.05), and serum levels of IL-6, IL-1β, AP-1 and COX-2 in treatment group were significantly decreased compared with control group (< 0.05).Xianhan Mixture was effective in the treatment of AUB-O, and its hemostatic mechanism was related to increasing the number of platelets, increasing the blood flow resistance of uterine artery, and shrinking the spiral artery of uterus. Xianhan Mixture could reduce the secretion of serum inflammatory factors through effective targets in IL-17 signaling pathway, block the generation of COX-2 induced PGE2, and play a hemostatic role.

abnormal uterine bleeding‐ovulatory dysfunction; Xianhan Mixture; network pharmacology; IL-17 signaling pathway; hemostasis effect

R285.64

A

0253 - 2670(2023)12 - 3921 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.12.019

2022-11-13

重慶市衛(wèi)生計生委中醫(yī)藥科技項目（ZY201602106）；重慶市中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科項目[(2018)43]；國家中醫(yī)藥管理局第三屆國醫(yī)大師傳承工作室及全國名中醫(yī)傳承工作室（2018YFC1704104）；第七批全國老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗傳承項目[(2022)79]；夏敏重慶英才·創(chuàng)新領(lǐng)軍人才項目[2019(2)]

劉恒煉，碩士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向為生殖內(nèi)分泌疾病、不孕癥。E-mail: 765307823@qq.com

通信作者：夏 敏，主任醫(yī)師，從事婦科內(nèi)分泌、輔助生殖工作。E-mail: 491405096@qq.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]