田二青，任麗梅，武金寶，王馳，蘇琪皓，劉中華

1內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040

2包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古 包頭 014031

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道惡性腫瘤[1]，近年來，其發(fā)病率和病死率分別居所有腫瘤的第二位和第五位[2]，并且逐漸呈年輕化趨勢(shì)[3]。有40%的CRC 患者行結(jié)直腸癌切除術(shù)后因病情惡化、復(fù)發(fā)導(dǎo)致死亡[4]。CRC 的發(fā)生涉及多種致病機(jī)制，包括基因融合、遺傳不穩(wěn)定性、體細(xì)胞突變等[5-6]，目前尚未完全明確。結(jié)直腸腺瘤（colorectal adenomas，CRA）被認(rèn)為是一種重要的癌前病變，90%以上的CRC 由CRA 發(fā)展而來，且從癌前病變發(fā)展到腫瘤通常需要5～10年[4]。激活轉(zhuǎn)錄因子2（activating transcription factor 2，ATF2）是一種應(yīng)激誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子，不僅在細(xì)胞核中起到致癌作用，還在細(xì)胞質(zhì)中起到抑癌作用，作用機(jī)制為通過線粒體凋亡通路激活胱天蛋白酶9（caspase 9）的活性，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。目前，關(guān)于ATF2和caspase 9 在CRA 和CRC 中表達(dá)的報(bào)道很少。本研究檢測(cè)ATF2 和caspase 9 在CRC 組織、CRA 組織和癌旁組織中的表達(dá)水平，并分析其與CRC 患者臨床特征的關(guān)系，進(jìn)而探討ATF2 和caspase 9 在CRC 中的致病機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年1月至2022年1月包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院收治的CRC、CRA 患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)檢查確診；術(shù)前無任何放化療等抗腫瘤治療；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤；合并心、肝、腎功能障礙或其他嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入50 例CRC 患者和30 例CRA 患者。CRC 患者中，男性23 例，女性27 例；年齡36～88 歲，平均（51.46±7.38）歲；分化程度：高分化19 例，中+低分化31 例；TNM 分期：Ⅰ+Ⅱ期27 例，Ⅲ+Ⅳ期23 例；浸潤(rùn)深度：肌層以內(nèi)22 例，漿膜及漿膜外28 例；淋巴結(jié)陽(yáng)性19 例，淋巴結(jié)陰性31 例。CRA 患者中，男性13 例，女性17 例；年齡32～84 歲，平均（49.32±7.19）歲；管狀腺瘤9例，絨毛狀腺瘤13 例，管狀絨毛狀腺瘤8 例。CRC和CRA 患者年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。取50 例CRC 患者的CRC 組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織（距離病灶邊緣10 cm 以上）、30 例CRA 患者的CRA 組織。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意。

1.2 免疫組化檢測(cè)方法

兔抗人ATF2、caspase 9 多克隆抗體均以1∶300比例稀釋，將蠟塊切成4 μm 厚的切片，然后依次行烤蠟、水化、抗原修復(fù)、PV 二步法染色、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色、二甲苯透明和封片等操作。操作步驟按照試劑盒說明書。

1.3 結(jié)果判斷

由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立完成閱片及評(píng)分，每張切片隨機(jī)選擇5 個(gè)高倍鏡視野（×400）觀察，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分。染色強(qiáng)度評(píng)分：無染色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，黃褐色為3 分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：＜5%為0 分，5%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分。兩項(xiàng)評(píng)分的乘積≥3 分為陽(yáng)性（+）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)分析；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATF2 和caspase 9 表達(dá)情況的比較

ATF2主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核，caspase 9主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。CRC 組織中ATF2、caspase 9陽(yáng)性表達(dá)率均低于CRA 組織和癌旁組織，CRA 組織中caspase 9 陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 CRC 組織、CRA 組織和癌旁組織中ATF2、caspase 9表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征CRC 患者CRC 組織中ATF2、caspase 9 表達(dá)情況的比較

不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、腫瘤大體分型及病理類型CRC 患者CRC 組織中ATF2、caspase 9 陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。浸潤(rùn)深度為肌層以內(nèi)、TNM 分期為Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CRC 患者CRC 組織中ATF2 陽(yáng)性表達(dá)率分別高于浸潤(rùn)深度為漿膜及漿膜外、TNM 分期為Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；分化程度為高分化、TNM 分期為Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CRC 患者CRC 組織中caspase 9 陽(yáng)性表達(dá)率分別高于分化程度為中+低分化、TNM 分期為Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征CRC 患者CRC 組織中ATF2、caspase 9 表達(dá)情況的比較

2.3 CRC組織中ATF2與caspase 9表達(dá)的相關(guān)性

Spearman 相關(guān)分析顯示，CRC 組織中ATF2 與caspase 9 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.418，P=0.003）。

3 討論

ATF2 是激活蛋白-1 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中的一種重要成分，作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞應(yīng)激、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮作用。研究顯示，在應(yīng)激刺激下，ATF2 可定位于細(xì)胞核中，激活多種基因靶點(diǎn)，包括細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白D 和c-Jun，在各種組織類型的腫瘤中發(fā)揮致癌作用，如惡性黑色素瘤、前列腺癌、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、肝癌等。但也有越來越多的證據(jù)表明，ATF2 定位于細(xì)胞質(zhì)，如非惡性皮膚癌中，與腫瘤抑制作用有關(guān)。已有研究利用缺失ATF2的小鼠的表皮基底層細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ATF2 轉(zhuǎn)錄活性的缺失可促進(jìn)皮膚乳頭狀瘤的形成[7]。研究表明，ATF2發(fā)揮致癌作用或抑癌作用的根本原因可能與其亞細(xì)胞定位相關(guān)，主要受蛋白激酶Cε（protein kinase Cε，PKCε）的調(diào)節(jié)。PKCε可結(jié)合ATF2 的T52，使其發(fā)生磷酸化修飾，并使ATF2 定位于細(xì)胞核，發(fā)揮致癌作用。當(dāng)細(xì)胞外界及自身發(fā)生變化后，PKCε作用減弱，ATF2 的T52 磷酸化水平降低，從而使ATF2 定位在線粒體并干擾含有己糖激酶1（hexokinase 1，HK1）和電壓依賴性陰離子通道1（voltage dependent anion channel 1，VDAC1）的高階復(fù)合物的形成，導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔長(zhǎng)時(shí)間開放，同時(shí)ATF2 向線粒體的募集也可引起膜電位降低、細(xì)胞色素C 滲漏等，這些都將激活線粒體凋亡通路引發(fā)細(xì)胞凋亡[8-9]。本研究結(jié)果顯示，CRC組織中ATF2 陽(yáng)性表達(dá)率低于CRA 組織和癌旁組織，提示ATF2 的異常表達(dá)發(fā)生于癌前病變，若阻斷其在線粒體中的定位可抑制CRC 的發(fā)生。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，ATF2 的陽(yáng)性表達(dá)率受腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的影響，在浸潤(rùn)深度越深、TNM 分期越高和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中ATF2 陽(yáng)性表達(dá)率越低。說明ATF2 的異常表達(dá)與CRC 的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)。

caspase 9 是一種啟動(dòng)型caspase，處于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游，由凋亡肽酶激活因子1（apoptotic peptidase activating factor 1，APAF1）、細(xì)胞色素C 和dATP 組成的凋亡體激活，觸發(fā)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡[10]。細(xì)胞凋亡是一個(gè)高度組織化的程序性細(xì)胞死亡過程，對(duì)器官發(fā)育、組織重塑、免疫反應(yīng)和腫瘤抑制至關(guān)重要[11-12]。異常的細(xì)胞凋亡被認(rèn)為有助于腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。隨著對(duì)caspase 9 的不斷研究，發(fā)現(xiàn)caspase 9 在許多腫瘤中低表達(dá)，與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，CRC 組織中caspase 9 陽(yáng)性表達(dá)率低于CRA 組織和癌旁組織，CRA 組織中caspase 9 陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組織，提示caspase 9表達(dá)下調(diào)時(shí)，降低了腫瘤細(xì)胞的凋亡水平，導(dǎo)致CRC 的發(fā)生和發(fā)展。此外還發(fā)現(xiàn)，caspase 9 的陽(yáng)性表達(dá)率與分化程度、TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。這表明caspase 9 的表達(dá)與腫瘤的增殖水平和惡性程度有一定的關(guān)系，可能在CRC 發(fā)展和惡化的某些階段起作用，與趙巖等[14]的研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，ATF2 和caspase 9 主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，而在細(xì)胞核中的表達(dá)則較為分散，在CRC 組織中均表達(dá)下調(diào)。Spearman 相關(guān)性分析顯示，CRC 組織中ATF2 與caspase 9 表達(dá)呈正相關(guān)，這也許說明在CRA 惡變過程中，ATF2 可能通過線粒體凋亡通路調(diào)控caspase 9 表達(dá)，在CRC 的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。雖然ATF2 在細(xì)胞質(zhì)中通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑癌作用，但其核輸出和線粒體定位的精確機(jī)制仍有待研究。且本研究?jī)H通過免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)，有必要進(jìn)一步通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)或結(jié)合其他相關(guān)因素對(duì)該結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的分析及驗(yàn)證。ATF2 作為腫瘤治療中的一個(gè)重要分子靶點(diǎn)，抑制其核內(nèi)轉(zhuǎn)錄功能，增強(qiáng)其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)定位，可作為今后CRC 治療的策略之一，為靶向精準(zhǔn)治療開辟新途徑。